CC BY
63
УДК 616.314.17-036:575.113.2 Э. Ш. ГРИГОРОВИЧ
Е. Г. ПОМОРГАЙЛО
Омская государственная медицинская академия
ПРОГНОЗ РАЗВИТИЯ У ПАЦИЕНТОВ ТЯЖЕЛОЙ ФОРМЫ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕНЕРАЛИЗОВАННОГО ПАРОДОНТИТА ПУТЕМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЗАИМОСВЯЗИ МЕЖДУ ИНДИВИДУАЛЬНЫМИ ПОЛИМОРФНЫМИ АЛЛЕЛЯМИ ИЛИ ГАПЛОТИПАМИ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ
В статье проводится анализ частоты встречаемости распределения генотипов и аллелей гена 1Ь-1 в и антагониста его рецептора (^-^М у больных пародонтитом среднетяжелой и тяжелой степени, а также анализируются ассоциации генотипов этих генов с развитием деструктивных форм пародонтита. В группе пациентов, больных тяжелыми формами пародонтита, полиморфизм — 511С/Т в промоторной области гена ^-1 в был более выражен, чем в группе сравнения, а носители Т-аллеля встречались статистически значимо чаще, возрастала доля пациентов с генотипом 2R/2R и аллелем 2R.
По данным ВОЗ (2000), в структуре стоматологических заболеваний патология пародонта занимает одно из ведущих мест, большую часть из которых составляют воспалительные заболевания. Обращаемость по причине заболеваний пародонта занимает 4-е место после обращаемости по поводу кариеса и его осложнений, 85% обслуживаемого населения нуждаются в пародонтологическом лечении [1]. При этом 65% больных с заболеваниями пародонта обращаются в стоматологическую клинику с тяжелой формой заболевания, и только 5% — с начальными стадиями воспалительных заболеваний пародонта. Несвоевременное обращение приводит к потере зубов у взрослых примерно в 50% случаев.
Этиологическими факторами воспалительных заболеваний тканей пародонта в настоящее время принято считать инфекционные агенты, персистирующие в зонах зубо-десневого соединения. Доказано, что при нарушении гигиены полости рта отмечается развитие зубной бляшки, состоящей из самих микроорганизмов, клеток слущенного эпителия, минеральных соединений. Внутри бляшки возникает динамическое взаимодействие, которое достигает кульминации с формированием сообщества микрофлоры. Микроорганизмы в наддесневой бляшке получают питание за счет слюны и компонентов пищи, рост бляшки сопровождается продвижением ее под десневой край и вызывает раздражение контактирующих с ней эпителиальных тканей. Нарушение целостности эпителия и подлежащих тканей является следствием персистирования в бляшке кариопатогенных бактерий типа S. mutans и St. sobri-nus, и синтезу ими провоспалительных веществ, типа липополисахаридов и пептидогликана. Соответственно увеличению содержания периодонтопатогенных микроорганизмов возрастает уровень синтезируемых ими экзотоксинов и повреждающих ткани ферментов, что заканчивается деструкцией тканей пародонта.
В ответ на повреждение реализуется стереотипная воспалительная реакция с вовлечением сосудов мик-роциркуляторного русла. Это создает предпосылки для формирования воспалительного инфильтрата, способного вызывать вторичную альтерацию тканей пародонта вследствие чрезмерного действия цитоки-нов. Таким образом, именно воспалительный ответ является ведущим в формировании и хронизации течения воспалительного процесса в десне, а гингивит как первичное заболевание с прогрессирующим течением переходит в пародонтит, что имеет решающее значение для потери зуба. Прогрессирование воспаления связывают с изменением экспрессии различных цитокинов и хемокинов. Предполагается, что у человека существует особый наследственный профиль провоспалительных цитокинов, который предрасполагает к определенному характеру течения воспаления. В связи с этим в настоящее время делаются попытки определить генетическую основу межиндивидуальных различий в иммунном ответе путем определения взаимосвязи между индивидуальными полиморфными аллелями, или гаплотипами генов цитокинов, и заболеванием.
Цель исследования — изучить распределение генотипов и аллелей генов 1Ь-1 в и антагониста его рецептора (1Ь-ШЫ) у больных пародонтитом среднетяжелой и тяжелой степени и проанализировать возможные ассоциации генотипов этих генов с риском развития заболевания.
Материал и методы исследования
Нами были взяты на лечение и обследованы 50 пациентов, больных пародонтитом среднетяжелой и тяжелой степени, имеющие клинические признаки активного течения заболевания пародонта, что выражалось в наличии отека, гиперемии, гноетечения
«ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК» № 1 (65) МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ «ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК» № 1(65)
Структура олигонуклеотидных праймеров
Таблица 1
Ген Мутация U R
IL-1ß C + 3953T TCCTACTGGTGTTGT CATCAG CTTGGGTGGACATG GTCCTG
C-511T AAAGAGGCAAAGGAG GGTGTTC GGGTACAATGAAGG GCCAATAG
IL-1RN Intron 2 86 п.о. VNTR CCCACTCATGGCCTTGTTC GGCTCAATGGTACCACATC
Таблица 2
Программа амплификации
IL-1 ß IL-1RN
C + 3953T C-511T Intron 2 86 п.о. VNTR
95 0С 3 мин 1 цикл 95 0С 3 мин 1 цикл 95 0С 3 мин. 1 цикл
95 0С 10 с 40 циклов 95 10 с 40 циклов 95 0С 10 с 40 циклов
60 0С 10 с 64 10 с 62 0С 10 с
72 0С 15 с 72 25 с 72 0С 25 с
72 0С 2,5 мин 1 цикл 72 0С 2,5 мин 1 цикл 72 0С 2,5 мин 1 цикл
20 0С Хранение 20 0С Хранение 20 0С Хранение
Таблица 3
Частота встречаемости аллелей полиморфного локуса С-511Т гена ^-1Р в группах пациентов, больных тяжелыми формами пародонтита, и группе сравнения
Аллель Больные тяжелыми формами пародонтита (100 хромосом) Группа сравнения (100 хромосом) Уровень статистической значимости различия
Количество хромосом (шт.) Частота встречаемости аллеля Количество хромосом (шт.) Частота встречаемости аллеля
С 65 0,65 91 0,91 0,02
Т 45 0,45 9 0,09 0,02
из пародонтальных карманов, абсцедирования, выраженной кровоточивости десен, разной степени выраженности над- и поддесневых зубных отложений.
Объектами исследования явились образцы венозной крови, полученные у 50 пациентов, больных пародонтитом, находившихся на лечении в клинике кафедры терапевтической стоматологии Омской государственной медицинской академии и пародонто-логическом отделении ГКСП № 1 в период с 2005 года по настоящее время, и образцы венозной крови, полученные у 50 пациентов, не имевших клинических проявлений заболевания пародонта.
Проводили забор венозной крови с антикоагулянтом и последующим получением взвеси лейкоцитов, из которой выделяли ДНК методом перхлоратной экстракции с этанольным осаждением [2]. Все больные дали информированное согласие на исследование.
С целью обнаружения ассоциации между частотой встречаемости аллелей применялись стандартные статистические методы. Попарное сравнение контрольных и опытных частот проводилось с помощью точного критерия Фишера и %2 .
Для проведения генетического исследования использовали праймеры, синтезированные в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск). Структуры праймеров и про-
грамма амплификации приведены в таблицах 1 и 2.
Амплификацию проводили в буфере, содержащем 10 мМ Трис-НС1 (рН 8,9), 50 мМ KCl, 1,7 мМ MgCl, 0,05% Tween 20, с добавлением 0,2 мМ-го раствора dNTP, 0,5 мкМ-го раствора праймеров, 20 нг ДНК и 1,0 ед. акт. Taq-полимеразы. Реакционную смесь в объеме 20 мкл покрывали 40 мкл минерального масла. ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», г. Москва) с начальной денатурацией при 95 оС — 2 мин. Далее в течение 35 циклов при следующих режимах: денатурация — 7 сек. при 95 оС; отжиг праймеров — 10 сек. при 64 оС для IL1-Ra и при 60 оС для IL-1ß; элонгация — 20 сек. при 72 оС.
Исследование полиморфизма IL1-Ra проводили с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими полиморфный регион в пределах второго интрона, в котором находится вариабельное количество тандемных повторов — 86 п. н. (VNTR). В результате амплификации определяли фрагменты ДНК размером 438, 610 и 696 п. н. с 2, 4 или 5 тандемными повторами соответственно. Эти аллели были обозначены как 2R, 4R и 5R в данном исследовании и соответствовали аллелям IL1-Ra 2, 1, 4 [8].
С целью определения полиморфных вариантов генов IL-1 ß использовали ПЦР с дальнейшей рестрикцией ампликонов эндонуклеазами рестрикции:
Таблица 4
Частота встречаемости генотипов полиморфного локуса С-511Т гена ^-1Р в группах пациентов, больных тяжелыми формами пародонтита, и группе сравнения
Генотип Больные тяжелыми формами пародонтита (п = 50) Группа сравнения (п = 50) Уровень статистической значимости различия
Количество (шт.) Частота встречаемости Количество (шт.) Частота встречаемости
С/С 14 0,27 35 0,70 > 0,01
С/Т 27 0,55 10 0,20 > 0,01
Т/Т 9 0,18 5 0,10 > 0,05
Таблица 5
Частота встречаемости аллелей полиморфного локуса VNTR-intr2 гена ^-№а в группах пациентов, больных тяжелыми формами пародонтита, и группе сравнения
Аллель Больные тяжелыми формами пародонтита (100 хромосом) Группа сравнения (100 хромосом) Уровень статистической значимости различия
Количество хромосом (шт.) Частота встречаемости аллеля Количество хромосом (шт.) Частота встречаемости аллеля
2R 28 0,28 20 0,20 > 0,05
4R 72 0,72 80 0,80 > 0,05
Таблица 6
Частота встречаемости генотипов полиморфного локуса VNTR-intr2 гена ^-№а в группах пациентов, больных тяжелыми формами пародонтита, и группе сравнения
Генотип Больные тяжелыми формами пародонтита (п = 50) Группа сравнения (п = 50) Уровень статистической значимости различия
Количество (шт.) Частота встречаемости Количество (шт.) Частота встречаемости
2R/2R 4 0,09 1 0,02 > 0,05
2R/4R 20 0,39 18 0,35 > 0,05
4R/4R 26 0,52 31 0,63 > 0,05
TaqI — для генотипирования полиморфного локуса С + 3953Т 1Ь-1р. Амплификация проводилась совместно. При гидролизе амплификационного фрагмента гена 1Ь-1 в эндонуклеазой рестрикции TaqI выявлялось три фрагмента размером 550, 146 и 404 п. н. Фрагмент 550 п. н. соответствовал амплификационному фрагменту, не подвергнувшемуся гидролизу, что указывает на присутствие аллеля +3953Т 1Ь-1р. При наличии аллеля С происходит разрезание амплификационного фрагмента ДНК на два размером 146 и 404 п. н.
Анализ рестрикционных смесей осуществляли с помощью электрофореза в 8%-м полиакриламидном геле.
Для обнаружения ассоциации между частотой встречаемости аллелей применялись стандартные статистические методы. Попарное сравнение контрольных и опытных частот проводилось с помощью точного критерия Фишера и х2 для долей с включением поправки Йейтса на непрерывность.
Результаты и их обсуждение
Известно, что 1ИР — провоспалительный цито-кин, который играет главную роль в инициализации и поддержании воспалительного ответа и осуществле-
ния всего комплекса защитных реакций. Его функция во время воспаления: пролиферация активированных Т- и В-клеток, индукция PGE2, продукция цитокинов макрофагов, индукция лихорадки, протеинов острой фазы, активности остеокластов. В популяции людей наблюдается полиморфизм гена 1Ь-1 р. Хорошо изучены два полиморфизма: полиморфизм в промоторной области гена в положении 511 и полиморфизм нуклеотидной замены С + 3953Т в 5 экзоне. Оба полиморфизма связаны с увеличением продукции 1Ь-1Р в 2-4 раза. Также изучался полиморфизм гена антагонист рецептора 1Ь-1, который является естественным ингибитором действия интерлейкина. Дефект гена антагониста приводит к развитию более пролонгированного иммунного ответа и связан с повышением риска развития хронических воспалительных состояний. В гене антагониста рецептора известен мини-са-теллитный полиморфизм — вариабельность по числу 86-членных тандемных повторов во втором интроне, предполагающем существование пяти аллелей, каждому из которых соответствует определенное число повторов [4, 5]. Наиболее часто встречаются аллель, содержащий четыре повтора (у 74% населения), и аллель, содержащий два повтора (21%). Оставшиеся же аллели встречаются менее чем в 5% случаев.
«ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК» № 1 (65) МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ «ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК» № 1(65)
Считается, что увеличение числа повторов ведет к понижению количества антагониста рецептора 1Ь-1, а носительство аллеля с двумя повторами связано с повышенным уровнем циркулирующего антагониста в ходе воспаления. Для удобства статистики и анализа, а также в связи с тем, что аллели с повторами три, пять и шесть встречались редко, полиморфизм гена антагониста рецептора 1Ь-1 описывали, учитывая только аллели с двумя и четырьмя повторами [6, 8, 9].
В результате нашего исследования были сделаны выводы, которые отражены в таблицах 3, 4, 5 и 6.
В группе сравнения преимущественно определялся генотип С/С; в группе пациентов, больных тяжелыми формами пародонтита, — С/Т; носители Т-аллеля встречались статистически значимо чаще по сравнению с группой сравнения (табл. 3 и 4).
У большинства исследуемых пациентов в обеих группах определялся в основном генотип 4R/4R и аллель 4R.
Однако необходимо обратить внимание на то, что в группе пациентов, больных тяжелыми формами пародонтита, возрастала доля пациентов с генотипом 2R/2R и аллелем 2R, хотя эти данные не достигали уровня статистической значимости.
По литературным данным, такое увеличение носителей аллеля 2R, обусловливающее большую продукцию антагониста 1Ь-1 на фоне увеличения продукции самого 1Ь-1, вполне объяснимо.
Согласно существующей версии при реализации воспалительного ответа у носителей генетически обусловленного перевеса в сторону выработки антагониста рецептора количество этого белка больше, чем необходимо для адекватной реализации воспаления, что вызывает компенсаторное образование еще большего количества 1Ь-1. При этом и антагониста рецептора в ответ вырабатывается тоже больше. Таким образом, носительство сочетаний генов 1Ь-1 и антагониста его рецептора, определяющих перевес в сторону выработки антагониста, приводит к более продолжительному воспалительному ответу [2, 4, 5] (табл. 5).
Кроме того, у носителей аллеля Т гена интерлейкина и 2R гена антагониста рецептора воспаление, по всей видимости, должно быть не только более продолжительным, но и более интенсивным. Следует отметить, что обладатели Т/Т генотипа 1Ь-1 и 2R/2R антагониста рецептора в данном исследовании болеют этой патологией с юности, имея наибольшее количество рецидивов заболевания в год (табл. 6).
Выводы
В группе пациентов, больных тяжелыми формами пародонтита с полиморфизм -511С/Т в промоторной области гена, 1Ь-1р был более выражен, чем в контрольной группе, а носители Т-аллеля встречались достоверно чаще.
Возможно, именно этот полиморфизм в сочета-
нии с полиморфизмом гена антагониста рецептора обусловливает протекание воспалительного ответа более продолжительно, что может являться причиной хронизации воспаления, более раннего его начала и более тяжелого течения [3, 6, 7, 9].
Мы полагаем, что полученные данные могут использоваться в комплексе с другими исследованиями с целью прогноза развития у пациентов ранних тяжелых форм заболевания.
Библиографический список
1. Боровский Е.В. Терапевтическая стоматология / Е.В. Боровский. — М., 2003. — 746 с.
2. Смольникова М.В. Клиническая иммуногенетика заболеваний человека / М.В. Смольникова, В.И. Коненков // Медицинская иммунология. — 2001. — Т. 3. — С. 379-389.
3. Успенская М.Н. Инфекция Helicobacter pylori в свете современных представлений о гастроканцерогенезе и пепсин-пепсиноген-образующей функции желудка / М.Н. Успенская, В.П. Калиновский, Е.И. Ткаченко, К.П. Хансон // Вопросы онкологии. — 2005. — Т. 51, № 5. — С. 533-539.
4. Correa P. Human gastric carcinogenesis: a multistep and multifactorial process. First American Cancer Society Award Lecture on Cancer Epidemiology and Prevention / P. Correa // Cancer Res. - 1992. - Vol. 52. - Р. 6735-40.
5. El Omar E.M. Interleukin-1 polymorphisms associated with increased risk of gastric cancer / E.M. El Omar, M. Carrington, K.E. McColl, J.H. Bream, H.A. Young et al. // Nature. — 2000. — Vol. 404. - Р. 398-402.
6. Machado J.C. Interleukin-1b and interleukin-1RN polymorphisms are associated with increased risk of gastric carcinoma / J.C. Machado, P. Pharoah, S. Sousa, R. Carvalho, C. Oliveira, C. Figueiredo et al. // Gastroenterology. — 2001. 121:823-9.
7. Merchant J.L. Inflammation, atrophy, gastrit cancer connecting the molecular dots / J.L. Merchant // Gastroenterology. — 2005. — Vol. 129, № 3. — P. 1079-1082.
8. Nicklin M.J. A physical map of the region encompassing the human interleukin-1 alpha, interleukin-1 beta and interleukin-1 receptor antagonist genes / M.J. Nicklin, A. Weith, G.W. Duff // Genomics. — 1994. — № 19. — Р. 382-384.
9. Pociot F. A TaqI polymorphism in the human interleukin-Ф (IL-1 в) gene correlates with IL-1 в secretion in vitro // F. Pociot, J. Molvig, L Wogensen // Eur.J.Clin.Invest. — 1992. — № 22. — Р. 396-402.
ГРИГОРОВИЧ Эльмира Шадидовна, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры терапевтической стоматологии.
ПОМОРГАЙЛО Елена Геннадьевна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры патологической анатомии с курсом клинической патологии.
Дата поступления статьи в редакцию: 10.10.2008 г.
© Григорович Э.Ш., Поморгайло Е.Г.
