CC BY
76
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 618.19-006.04-08-078.33
Черткова А.И., Славина Е.Г., Заботина Т.Н., Короткова О.В., Шоуа Э.К., Борунова А.А., Жукова Л.Г., Окружнова М.А., Кадагидзе З.Г.
ПРОГНОСТИЧЕСКИЕ И ПРЕДИКТИВНЫЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина» Минздрава России, 115478, г Москва, Россия
Цель настоящей работы — определение связи количественного состава лимфоцитов периферической крови больных разными подтипами рака молочной железы (РМЖ) со стадиями заболевания и эффективностью проведенного лечения. В исследование включены пациентки с первично операбельным РМЖ и первично неоперабельным HER2+ РМЖ и трижды негативным РМЖ(ТН РМЖ). На ранних стадиях заболевания наблюдалось повышение количества ЕК- и ЕКТ-клеток и CD8+CD28- Т-клеток. У больных первично неоперабельным HER2+ и ТН РМЖ выявлены определенные различия в популяционном составе лимфоцитов и количестве регуляторных Т-клеток до и после лечения в зависимости от степени лечебного патоморфоза опухоли. Обнаружена связь исходного количества CD3+, CD3+CD4+ с показателями выживаемости у больных трижды негативным РМЖ.
Ключевые слова: первично операбельный РМЖ; HER2+PMM; ТН РМЖ; таргетная терапия; химиотерапия; субпопуляции лимфоцитов периферической крови.
Chertkova A.I, Slavina E.G., Zabotina T.N., Korotkova O.V., Shoua E.K., Borunova A.A., Zhukova L.G., Okruzhnova M.A., Kadagidze Z.G.
PROGNOSTIC AND PREDICTIVE IMMUNOLOGIC MARKERS OF EFFICACY OF BREAST CANCER TREATMENT N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Ministry of Health, 115478, Moscow, Russia
The aim of this work was to determine association of quantitative composition of lymphocytes in the peripheral blood of patients with different breast cancer subtypes with stage of disease and the effectiveness of the treatment. In study were included patients with primary operable breast cancer and primary inoperable HER2+ and Triple-negative breast cancer. In the early stages of the disease observed increase in the number of NK-, NKT-cells and CD8+CD28— T cells. In patients with primary inoperable HER2+ and Triple-negative breast cancer revealed certain differences in the population composition of lymphocytes and the number of regulatory T-cells before and after treatment, depending on the degree of therapeutic pathomorphosis of the tumor. The connection of the initial number of CD3+, CD3+CD4+ with survival rates was detected in patients with triple-negative breast cancer.
Keywords: primary operable BC, HER2+BC, tripl negative BC, target therapy, chemotherapy, lymphocyte subpopulations (PBL).
For citation: Chertkova A.I, Slavina E.G., Zabotina T.N., Korotkova O.V., Shoua E.K., Borunova A.A., Zhukova L.G., OkruzhnovaM.A., Kadagidze Z.G. Immunologiya. 2017; 38(2): DOI: 10.18821/0206-4952-2017-38-2-For correspondence: Zaira G. Kadagidze, Professor, Dr. Sci. Med Head laboratory of clinical immunology, E-mail: [email protected]
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. This work was supported by RFBR grant No. 14-04-00867.
Received 17.09.16 Accepted 03.11.16
введение
В настоящее время не вызывает сомнения утверждение, что иммунная система способна распознавать опухоль и генерировать как локальный, так и системный иммунный ответ, направленный на подавление опухолевого роста [1]. Состояние иммунной системы пациента и способность проводимого лечения влиять на эффекторное и супрессорное звенья иммунитета во многих случаях определяют прогноз заболевания и успех различных видов противоопухолевой терапии, включая таргетную и химиотерапию [2]. РМЖ является одним из самых гетерогенных вариантов опухолей, характеризующихся неоднородностью прогноза и чувствительности к противоопухолевой терапии [3, 4]. Приблизительно в 20—30% случаев РМЖ обнаруживается гиперэкспрессия
Для корреспонденции: Кадагидзе Заира Григорьевна, д-р мед. наук, проф., руководитель лаборатории клинической иммунологии опухолей, E-mail: [email protected], orcid ID 00000002-0058-0987
рецептора эпидермального фактора роста 2 (HER2 [ЕгЬВ2] — HER2+ РМЖ) [5]. РМЖ, характеризующийся отсутствием гиперэкспрессии HER2, отсутствием или низкой экспрессией рецепторов эстрогенов и прогестерона, получил название РМЖ с тройным негативным фенотипом (ТН РМЖ) [4]. Как и при других нозологических формах рака, иммунная система может играть двоякую роль при раке молочной железы (РМЖ): способствовать опухолевому росту или тормозить его [6]. В значительном количестве исследований последних лет подтверждается роль иммунной системы в клиническом ответе на некоторые стандартные варианты системной терапии РМЖ [2, 7]. В настоящее время ведется активный поиск иммунологических прогностических факторов при различных вариантах опухолей. Продемонстрирована прогностическая значимость определенных популяций иммуно-компетентных клеток в опухолевом микроокружении. В то же время значение лимфоцитов периферической крови (ПК) в этом аспекте изучено в значительно меньшей степени [1, 8, 9]. В связи с этим определение взаимосвязи между субпопу-ляционным составом лимфоцитов ПК у пациенток с разными
подтипами РМЖ до лечения и его изменениями в процессе лечения и эффективностью проведенной терапии является актуальным.
Цель настоящей работы — определение связи количественного состава лимфоцитов ПК больных с разными подтипами РМЖ и с различной эффективностью проведенного лечения. Основные задачи исследования:
— определение связи между количеством эффекторных и регуляторных популяций лимфоцитов ПК до лечения и стадией заболевания у пациенток с первично операбельным РМЖ;
— исследование связи количественного состава лимфоцитов ПК больных первично неоперабельным HER2+РМЖ до и после таргетной и химиотерапии с результатами лечения;
— исследование взаимосвязи количественного состава лимфоцитов ПК больных первично неоперабельным ТН РМЖ до и после химиотерапии с непосредственными и отдаленными результатами лечения.
Материал и методы
Характеристика больных
В исследование вошли 3 группы больных.
Первую группу составили 73 больных первично операбельным раком молочной железы (ПО РМЖ) с различными стадиями заболевания: I — T1N0 (n = 24), II — T1N1, T2N0—1 (n = 38), III — T2—3, N0—2 (n = 11). В этой группе подавляющее большинство пациенток имели эстрогенпо-зитивный и прогестеронпозитивный статус опухоли. У 10 (13,7%) пациенток выявлена гиперэкспрессия/амплификация гена HER2. 4 пациентки (5,5%) имели ТН РМЖ. Контролем служили здоровые женщины соответствующего возраста (n = 35). Иммунологическое обследование больных проводилось до оперативного вмешательства.
Вторую группу составили 22 пациентки с первично неоперабельным HER2+РМЖ. Пациентки на первом этапе лечения получали трастузумаб (8—6 мг/кг внутривенно (в/в) капельно 1 раз в 3 нед) + лапатиниб (1000 мг перорально ежедневно в течение 6 нед) + химиотерапия (х/т). Х/т включала 4 курса доцетаксела 75 мг/м2 в/в капельно 1 раз в 3 нед, а затем 4 курса винорельбина 25 мг/м2 в/в 1 раз в 3 нед. После окончания таргетной терапии и х/т пациенткам проводилось хирургическое лечение, в операционном материале определялась степень лечебного патоморфоза опухоли (ЛПО). В соответствии со степенью ЛПО больных делили на две группы: группа A — пациентки с низкой (0—2) степенью ЛПО (n = 11); группа B — пациентки с высокой (3—4) степенью ЛПО (n = 11). Контролем служили здоровые женщины (n = 18). Иммунологическое обследование больных проводилось до начала лечения и после 2—4 курсов терапии.
В третью группу включены больные первично неоперабельным ТН РМЖ (n = 26). Все пациентки после 4—6 курсов х/т (доксорубицин 50 мг/м2 + цисплатин 60—75 мг/м2 1 раз в 3 нед) подвергались оперативному лечению, и в операционном материале определялась степень ЛПО. В соответствии со степенью ЛПО больных делили на две группы: группа С — пациентки с низкой (1—2) степенью ЛПО (n = 8); группа D — пациентки с высокой (3—4) степенью ЛПО (n = 18). Фиксировалась общая продолжительность жизни пациенток (ОВ), продолжительность безрецидивного периода (БРП) и время до прогрессирования заболевания (ВДП). Состояние иммунной системы больных определялось до начала лечения и после окончания х/т. Контролем служили здоровые женщины (n = 22).
Иммунологическое обследование включало иммунофе-нотипирование лимфоцитов ПК методом многопараметрово-го цитометрического анализа с использованием панели мо-ноклональных антител, конъюгированных с FITC, PE, PC5 к поверхностным и внутриклеточным маркерам лимфоцитов (BD Biosciences Bekman Coulter, США, «Сорбент», Россия
ORIGINAL ARTICLE
и eBiocsience, США). Проточно-цитофлуориметрический анализ проводили на 5-параметровом проточном цитоф-луориметре аналитического типа FACSCalibur производства компании Becton Dickinson (США). Лимфоциты выделяли по параметрам светорассеяния и экспрессии CD45. Определяли процент следующих популяций лимфоцитов: Т-лимфоцитов (CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD8+CD28+, CD8+CD28—), активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+, CD4+CD25+), естественных киллерных Т-клеток (ЕКТ) (CD3+CD16+CD56+), естественных киллеров (ЕК) (CD3-CD16+CD56+ и CD16+Perforin+), В-клеток, а также ре-гуляторных CD4+CD25+FOXP3+ или CD4+CD25lnshCD127low/ neg Т-клеток (Трег). Все пациентки дали информированное согласие на проведение иммунологического обследования.
Статистический анализ данных
Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических программ «Статистика» и «SPSS». Нормальность распределения показателей определяли с помощью критерия Шапиро — Уилка. Результаты представлены в виде медианы Me и квартилей (25—75-й процен-тили) в случае распределения отличного от нормального или в виде среднего значения x и стандартного отклонения (s) x(s), при нормальном распределении показателей. Статистическую значимость различий между сравниваемыми группами оценивали по непараметрическому U-критерию Манна—Уитни и /-критерию Стьюдента для независимых групп и критерию Вилкоксона для зависимых групп. Различия между показателями считали статистически значимыми при p < 0,05 (95% ДИ). Корреляционный анализ проводили методом Спирмена. Влияние показателей клеточного иммунитета на выживаемость определяли с использованием критерия кривых выживаемости Каплана—Майера. Медиана наблюдения составила 20 мес.
Результаты исследования
Популяционный состав лимфоцитов ПК у больных ПО РМЖ до операции
Проведенное исследование продемонстрировало связь между исходным количеством клеток основных популяций лимфоцитов ПК больных ПО РМЖ и стадией заболевания. Результаты представлены в табл. 1. Повышение процента CD3-CD16+CD56+ ЕК-клеток, в том числе CD16+Perform+ ЕК-клеток, наблюдалось только на ранней стадии заболевания (I стадия). От стадии заболевания зависело также и исходное количество CD3+CD16+CD56+ ЕКТ-клеток: у больных с I и II стадиями процент этих клеток был статистически значимо выше по сравнению с таковым у доноров и больных с III стадией. Повышение на ранних стадиях процента клеток врожденного иммунитета сочеталось со сниженным количеством Т-клеток адаптивного иммунитета: CD3+ (I, IIA и ПВ стадии) и CD3+CD4+ (I стадия). На более поздних стадиях процент CD3+ Т-клеток оказывался близким к нормальному. У пациенток с I стадией ПО РМЖ отмечалось также статистически значимое по сравнению с контролем повышение исходного количества CD8+CD28- Т-клеток. По мере увеличения стадии заболевания процент этих клеток снижался и у больных с III стадией не отличался от контроля. Зависимости исходного количества CD4+CD25highCD127low/neg Трег от стадии заболевания не наблюдалось. Все пациентки с ПО РМЖ подверглись оперативному вмешательству. Процент изученных популяций лимфоцитов после лечения не отличался от исходных значений за исключением статистически значимого снижения Трег у пациенток со II стадией РМЖ (данные не показаны).
Результаты лечения больных с первично неоперабельным HER2+ РМЖ
Лечение (таргетная терапия + х/т) пациенток с первично неоперабельным HER2+ РМЖ у 11(50%) из 22 обследованных больных индуцировало низкий (0—1 степени) ЛПО (группа А) и у 11(50%) из 22 — высокий (3—4 степени)
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 1
субпопуляции лимфоцитов периферической крови больных ПО рМЖ на различных стадиях заболевания до хирургического лечения (% антиген-положительных клеток)
Показатель Стадия I (1) Стадия 11А и 11Б (2) Стадия ША(3) Доноры(4) Р
медиана и (квартили) или среднее значение и (стандартное отклонение) л:^)*
СЭ3+ 64,4(11,8)* 68,6(12,5)* 70,9(13,7)* 73,8(7,7)* Р— = 0,002
СЭ3+С04+ 32,2(8,5)* 36,3(7,9)* 41,1(13,5)* 43,4(8,0)* р1 = 0,022; Р_ < 0,001
СЭ3+С08+ 26,0(8,4)* 26,0(10,6)* 23,7(8,4)* 26,9(5,9)*
СЭ3-С016+С056+ 22,2 (14,0—28,9) 18,4 (9,7—26,2) 12,3 (8,7—21,4) 16,0 (11,4—20,7) р1 3 = 0,038; Р— = 0,013
СЭ3+С016+С056+ 18,0 (14,0—21,4) 11,8 (8,8—19,2) 8,6 (4,9—14,8) 6,7 (4,1—13,2) р1 3 = 0,001; Р2—3 = 0,043; Рм < 0,001
С08+СЭ28+ 3,1 (1,4—5,2) 3,9 (1,7—6,7) 3,8 (1,4—6,9) 6,5 (4,3—8,5) Р\_4 < 0,001
СЭ8+С028- 15,9 (10,7—22,5) 13,8 (9,4—18,3) 10,6(4,4—12,0) 10,6 (5,8—12,4) Р1 3 = 0,005; Р_ < 0,001
СЭ16+РегБэпп+ 22,7(6,8)* 18,3(7,9)* 16,2(6,2)* 15,5(6,4)* Р1 2 = 0,030; Р1 3 = 0,012; Р_ = 0,001
СЭ4/С08 0,75 (0,57—1,1) 0,96 (0,69—1,26) 1,19 (075—1,6) 1,2 (0,9—1,5) Р\_3 = 0,034
СЭ4+С025ь'вь 8,2 (7,5—9,0) 8,45 (7,49—9,46) 8,93 (6,26—9,8) 9,42 (7,6—10,3)
CD127low/neв
ЛПО (группа В). Результаты иммунофенотипирования лимфоцитов ПК больных HER2+ РМЖ до и после лечения представлены в табл. 2. Проведя исследование, обнаружили как сходство, так и различия между группами в исходном уровне некоторых показателей и в характере их изменений в процессе терапии. У пациенток обеих групп после лечения отмечалось снижение количества СЙ3-С016+СВ56+-ЕК-клеток, однако в группе А оно было значительно более выражено, чем в группе В: этот показатель после лечения статистически значимо снизился не только по отношению к исходному значению, но и по отношению к контролю. У пациенток группы А после лечения наблюдалось также снижение количества СО3+СВ16+СВ56+-ЕКТ-клеток. Исходное количество Т-лимфоцитов СБ4+СБ25+ было снижено по сравнению с контролем в обеих группах, но в то время как лечение привело к повышению количества этих клеток у больных группы В до контрольного уровня, в группе А оно снизилось в еще большей степени. Только у пациенток группы А после лечения повысился процент СБ3+-Т-клеток, В-клеток, лимфоцитов, экспрессирующих маркер СБ95 (Fas/FPO-1), и увеличился иммунорегуляторный индекс (ИРИ) СБ4+/СБ8+. В то же время только у пациенток с высокой степенью ЛПО после лечения повысился процент Т-лимфоцитов СБ3+СБ8+. Количество Т-клеток СБ8+СБ28+ до лечения в группе В было статистически значимо ниже, чем в группе А и в контрольной группе, а после лечения увеличилось до нормы. В группе А процент этих клеток не изменялся. В группе А отмечалась тенденция к повышению процента Т-лимфоцитов СВ8+СБ28— после лечения, а в группе В отмечалось статистически значимое снижение показателя. Исходная величина соотношения СБ8+СБ28+/ С08+С028- у больных с высокой степенью ЛПО была ниже, чем в группе А и в группе контроля, а в группе А не отличалась статистически значимо от контроля. После лечения величина этого соотношения повысилась в обеих группах: в группе В до контрольного уровня, а в группе А превысила контрольные значения. До лечения у пациенток с высокой степенью лечебного патоморфоза опухоли количество CD4+CD25+FOXP3+ Трег было статистически значимо
выше, чем у пациенток с низкой степенью ЛПО и выше, чем в контрольной группе. Проведенное лечение привело к значительному снижению процента Трег у больных группы В. В группе А снижение этого показателя было менее выражено. Непараметрический корреляционный анализ Спирмена выявил умеренную статистически значимую отрицательную связь между степенью ЛПО и величиной соотношения CD8+CD28+/CD8+CD28- у больных HER2+ РМЖ до лечения (г = —0,552; р = 0,007) и умеренную статистически значимую положительную связь между степенью лечебного па-томорфоза опухоли и количеством CD4+CD25+FOXP3+ Трег у больных HER2+ РМЖ до лечения (г = 0,455; р = 0,037). И в группе А (ЛПО 0—2 степени) и в группе В (ЛПО 3—4 степени) после лечения отмечалось повышение процента CD3+CD4+-Т-лимфоцитов и активированных CD3+HLA-БЯ+-Т-клеток по сравнению с исходным уровнем, и количество CD3+HLA-DR+ Т-клеток в обеих группах превысило контрольные значения.
Результаты лечения больных с первично неоперабельным ТН РМЖ
У больных этой группы в результате проведенного лечения (цисплатин+доксорубицин) существенно чаще, чем у пациенток с HER-2+ выявлялась высокая степень ЛПО. Только у 8 (~31%) из 26 обследованных больных первично неоперабельным ТН РМЖ отмечался ЛПО 1—2 степени (группа С), а у 18(~69%) из 26 — 3—4 степени (группа D). Результаты иммунофенотипирования лимфоцитов ПК больных ТН РМЖ до лечения и после х/т представлены в табл. 3. До лечения у больных с высокой степенью ЛПО процент CD8+CD28+ и активированных CD4+CD25+ Т-клеток, а также величина соотношения CD8+CD28+/CD8+CD28- были статистически значимо ниже контрольных значений, а процент Т-клеток CD3+CD8+ был снижен и до, и после лечения. До лечения у пациенток группы D процент CD3+CD4+-Т-клеток был выше, чем у больных в группе ЛПО 1—2 степени. У больных с низкой степенью ЛПО до лечения практически все исследованные показатели были в пределах нормы за исключением сниженного по отношению к контролю процента регуляторных CD4+CD25+FOXP3+-Т-клеток. После
ORIGINAL ARTICLE
Таблица 2
Популяции лимфоцитов ПК больных HER2+ рМЖ до и после двух—четырех курсов лечения (% антиген-положительных клеток)
Больные HER2+ РМЖ (медиана и квартили)
Показатель ЛПО 0 —1-й степени (группа А) ЛПО 3— -4-й степени (группа B) Контроль(5) Р
до лечения(1) 1 после лечения(2) до лечения(3) после лечения(4)
CD3+ 76,3 (65,3- —79,7) 81,4 (69,4—85,9) 70,4 (60,4— 75,5) 72,7 (66,8— -76,5) 69,9 (66,3— 78,0) Р1—2 = 0,026
CD3+CD4+ 38,1 (23,3—44,5) 46,8 (38,2—49,7) 44,0 (26,5— 48,0) 42,8 (39,5— 48,2) 37,2 (35,2—43,6) pi 2 = 0,003; p3—4 = 0,026
CD3+CD8+ 14,1 (10,5 —15,7) 16,9 (11,5—22,4) 13,0 (6,1— -16,2) 18,0 (9,8— -24,8) 18,3 (14,4— 21,1) Р3—4 = 0,040
CD4/CD8 2,36 (1,1- -2,5) 2,1 (1,45—2,96) 1,78 (1,08— 4,85) 2,17 (1,44— 4,27) 1,44 (0,96— 2,25) Р\_2 = 0,012
CD3+HLA-DR+ 8,1 (5,3— 13,7) 13,0 (7,4—17,6) 7,4 (5,6— 14,4) 9,5 (6,1— 13,6) 6,6 (4,7— 8,7) Р_ 2 = 0,001; Р2 5 = 0,005; р_5 = 0,032
CD3+CD38+ 6,6 (4,5— 9,2) 13,6 (6,3—16,9) 6,5 (3,1— 10,5) 7,2 (4,6— 10,7) 5,4 (3,3— 10,0) Р\_2 = 0,001
CD3+CD16+CD56+ 12 (8,6- -19) 7,2 (6—18,4) 8,7 (7,7— -18) 9,3 (6,4— 10,6) 10,2 (8,5— -15,8) p1—2 = 0,003
CD3-CD16+CD56+ 12,8 (10,2- —21,1) 8,8 (3,6—17,0) 19,5 (12,3— 29,4) 21,0 (6,1— -24,5) 19,1 (12,6— -22,9) Р1 2 = 0,001; Р3_4 = 0,032; Р2_5 = 0,005
CD19+ 4,1 (3,3- -8,1) 6,4 (2,4—8,0) 3,9 (3,2— 6,6) 4,4 (2,7— 9,2) 3,5 (2,3— 5,1) Р1—2 = 0,002
CD95 50,7 (41- 63,7) 64,1 (49,4—67,6) 62,7 (51,3 —72) 56,3 (47,9— 64,9) 59,5 (51,0— 65,2) Р1—2 = 0,002
CD8+CD28+ 7,8 (6- 12,9) 10,1 (7,5—12,4) 3,9 (2,0— 8,3) 9,1 (4,0— 13,6) 8,6 (7,5— 12,7) Р3_4 = 0,022; Р3—5 = 0,006
CD8+CD28- 11,3 (10,2- —15,8) 10,4 (6,5—21,2) 16,0 (13,2— 25,9) 16,7 (10,5— 19,0) 18,8 (14,3— -26,5) Р3-4=0,053; Р1-5=0,043
CD8+CD28+/ CD8+CD28- 0,72 (0,31- —1,12) 0,88 (0,55—1,54) 0,23 (0,19— 0,54) 0,61 (0,37— -0,81) 0,46 (0,32— -0,87) Р3_4 = 0,001; Р2_5 = 0,039; Р3_5 = 0,017
CD4+CD25+ 4,62 (3,01 —7,13) 3,52 (2,37—5,45) 5,38 (4,2— -7,14) 7,5 (4,56— 9,68) 9,0 (6,4— 11,1) Р12 = 0,002; Р3— = 0,004; р_ 5 = 0,006; Р25< 0,001; Р3_5 = 0,001
CD4+CD25+FOXP3+ 0,11 (0,05- —0,36) 0,11 (0,07—0,18) 0,43 (0,31— -0,57) 0,02 (0,0— -0,17) 0,24 (0,21— 0,36) Р\_3 = 0,010; Р3_4< 0,001; Р2 5 = 0,009; Р3_5 = 0,032;
. = 0,019
химиотерапии изменения субпопуляционного состава лимфоцитов ПК наблюдались главным образом у пациенток с высокой степенью ЛПО. Так, в группе D после лечения процент Т-клеток CD3+, CD3+CD4+ и ИРИ превысил контрольные значения, а процент В-клеток уменьшился. Повышение количества CD8+CD28+ и снижение количества CD8+CD28-Т-клеток привело к нормализации величины соотношения CD8+CD28+/CD8+CD28- у больных этой группы. После х/т у пациенток с высокой степенью ЛПО уменьшилось количество регуляторных Т-клеток CD4+CD25+FOXP3+, которое до лечения было в пределах нормы. В то же время у пациенток группы С лечение привело к некоторому увеличению количества Трег. У них также возросло число CD3+ Т-лимфоцитов.
Нами была обнаружена также взаимосвязь между процентом некоторых популяций лимфоцитов ПК до лечения и отдаленными результатами х/т (табл. 4). Повышенное по сравнению с контролем у пациенток до лечения количество Т-лимфоцитов CD3+ и CD3+CD4+ ассоциировалось со статистически значимым увеличением ОВ, БРВ, а также ВДП. Медиана ОВ в группе больных с пониженным уровнем Т-лимфоцитов CD3+ и CD3+CD4+ составила 23,8 мес, и не была достигнута в группе с повышенным уровнем этих клеток. Отмечалась также тенденция к увеличению
показателей выживаемости у пациенток с более высоким исходным уровнем регуляторных CD4+CD25+FOXP3+-Т-клеток: двухлетняя ОВ и БРВ составила 100% по сравнению с 58% (р = 0,206) и 75% (р = 0,308) соответственно в группе больных с низкими значениями показателя. Повышенный до лечения процент CD50+ лимфоцитов ассоциировался с увеличением времени до прогрессирования.
Обсуждение
В иммунном ответе на опухоль участвуют клетки как врожденного (ЕК- и ЕКТ-клетки), так и адаптивного (Т-клетки CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+) иммунитета [1]. Естественные киллеры в настоящее время рассматриваются как важная составляющая иммунологического надзора. В наших исследованиях на положительную роль ЕК-клеток у больных ПО РМЖ может указывать тот факт, что повышение их количества, а также количества перфорин-позитивных ЕК-клеток, наблюдалось только у больных на ранней стадии заболевания (I стадия).
Уникальной популяцией Т-лимфоцитов являются ЕКТ-клетки. Они играют важную роль в регуляции иммунного ответа при различных патологических состояниях [13] и могут как стимулировать, так и подавлять противоопухолевый иммунный ответ [13, 14]. Исходное количество ЕКТ-клеток, как
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 3
Популяции лимфоцитов ПК больных Тн рМЖ до и после химиотерапии (% антиген-положительных клеток)
Показатель Больные ТН РМЖ Контроль(5) Р
ЛПО 1—2-й степени (группа С) ЛПО 3— —4-й степени (группа D)
до лечения (1) после лечения (2) до лечения (3) после лечения (4)
медиана и квартили
СЭ3+ 67,8 (63,5—80,2) 87,1 (70,6—90,2) 77,3(70,4— 81,0) 81,1 (73,4— 85,6) 76,4 (69,5— 79,0) Р1—2 Р4—5 = 0,012; = 0,025
СЭ4+ 42,8 (37,4—44,7) 46,1 (41,0—53,5) 45,8 (38,4— 54,4) 51,6 (45,3— 58,0) 43,9 (35,8— 50,0) Рл—5 = 0,038
СО3+СЭ4+ 39,5 (34,2—41,9) 45,7 (34,5—47,7) 47,2 (41,1- 55,5) 53,3 (44,1— 60,9) 43,7 (35,6—49,7) Р— Р4—5 = 0,036; = 0,018
СО3+СЭ8+ 10,1 (9,6—28,7) 17,9 (14,4—32,9) 13,6 (6,6— 17,9) 14,3 (8,8— 17,2) 19,1 (13,1— 27,7) Р3—5 Р4—5 = 0,034; = 0,042
СЭ4/С08 1,91 (1,24—2,81) 2,16 (1,5—2,63) 2,15 (1,6— 3,27) 2,6 (1,76— 3,86) 1,9 (1,08— 2,6) Р4—5 = 0,047
СО3+НЬА-ЭК+ 7,5 (7,4—9,7) 8,1 (4,3—13,1) 7,7 (7,0— 10,3) 5,5 (3,6— 7,4) 5,8 (4,5— 8,3)
СЭ50 97,4 (95,7—99,3) 98,0 (97,5—99) 98,7 (97,6— 99,2) 96,4 (88,4— -99,5) 97,8 (96,5— -99,1) Р3—4 = 0,024
СЭ3+С016+С056+ 4,2 (3,3—16,9) 8,75 (6,4—18,5) 9,6 (4,9— 16,3) 9,0 (2,6— 15,0) 8,7 (5,6— 10,9)
СЭ3—С016+С056+ 12,0 (8,9—20,9) 11,0 (6,0—23,1) 11,9 (7,1— -18,2) 12,5 (9,1— 17,3) 13,6 (9,9— 22,3)
СЭ19+ 2,6 (2,2—8,3) 4,05 (1,85—6,0) 6,7 (4,4— 10,2) 1,9 (1,4— 3,2) 4,7 (2,4— 13,2) Р3—4 Р4—5 = 0,010; = 0,002
СЭ95 54,6 (40,8—76,9) 57,7 (42—84,4) 53,2 (44,3— 62,0) 53,2 (41,8— 72,6) 49,8 (37,1— 60,3)
СЭ8+С028+ 7,2 (5,2—13,1) 8,05 (4,05—11,5) 7,3 (4,7— 9,3) 9,3 (5,6— 10,8) 9,8 (8,0— 15,5) Р3—5 = 0,005
СЭ8+С028— 15,2 (9,4—,6) 16,2 (13,1—22,8) 12,8 (10,3— 17,7) 10,6 (7,3-16,1) 14,3 (6,6— 23,8) Р2—4 = 0,042
СЭ8+С028+/ СЭ8+С028— 0,55 (0,16—1,53) 0,43 (0,24—0,73) 0,45 (0,26— -0,71) 0,76 (0,48 —1,1) 0,83 (0,36— 1,73) Р3—4 Р3—5 = 0,027; = 0,037
СЭ4+С025+ 7,1 (3,6—8,2) 7,7 (4,04—11,3) 4,6 (2,11— 9,2) 7,3 (5,4— 12,1) 8,8 (6,4— 11,0) Р3—5 = 0,018
CD4+CD25+FOXP3+ 0,14 (0,04—0,26) 0,23 (0,14—0,34) 0,32 (0,13— 0,48) 0,18 (0,14— 0,34) 0,38 (0,24— 1,01) Р4—5 Р1—5 = 0,014; = 0,013
Примечание. Значения р даны только для статистически значимых различий.
и ЕК-клеток, зависело от стадии заболевания: у больных с I и II стадиями их процент в ПК был статистически значимо выше, чем у больных с III стадией, а также у здоровых женщин.
Повышенный на ранних стадиях процент клеток врожденного иммунитета сочетался со сниженным количеством CD3+ (I, ПА и ПВ стадии) и CD3+CD4+ (I стадия) Т-клеток адаптивного иммунитета. На более поздних стадиях процент CD3+-Т-клеток увеличивался до нормы, по-видимому, главным образом за счет CD3+CD4+-Т-клеток, поскольку процент ЕКТ-клеток постепенно снижался с увеличением распространенности процесса, а процент CD3+CD8+-Т-лимфоцитов был практически одинаков при всех стадиях РМЖ. Повышение количества ЕК- и ЕКТ-клеток врожденного иммунитета на ранних стадиях РМЖ и снижение этих показателей на более поздних стадиях может указывать на важное значение этих лимфоцитов в первую очередь на начальных этапах развития опухоли. На более поздних стадиях основную роль, очевидно, играют клетки адаптивного иммунитета.
У пациенток с первично неоперабельными формами HER2+ РМЖ количество определенных популяций лимфоцитов до лечения и его изменения после лечения ассоциировались с результатами терапии. Так, снижение количества С03—С016+СВ56+ ЕК-клеток после лечения трастузумабом в сочетании с лапатинибом и химиотерапией было значительно более выражено у больных с низкой степенью (0—2) ЛПО, чем при +достижении высокой степени (3—4) ЛПО. Одним из механизмов противоопухолевой активности трастузумаба, направленного против ги-перэкспрессированного у больных HER2+РМЖ рецептора эпидермального фактора роста 2 (HER2 [ЕгЬВ2]), является
активация антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) [15]. Основными клетками-эффекторами АЗКЦ являются ЕК-клетки [16, 17] и значительное снижение их количества может являться неблагоприятным фактором при лечении трастузумабом. Проведенное лечение приво-
Таблица 4
выживаемость (в%) больных Тн рМЖ в зависимости от количества CD3+, CD3+CD4+, CD50+ лимфоцитов ПК до лечения
Популяции лимфоцитов (по отношению к контролю) 2-летняя ОВ 2-летняя БРВ 2-летняя ВДП
Процент CD3+Т-клеток:
ниже (п = 14) 45 34 39
выше (п = 19) 94 76 72
Р 0,04 0,017 0,014
Процент CD3+CD4+ Т-клеток:
ниже (п = 12) 41 27 37
выше (п = 11) 89 69 68
Р 0,037 0,115 0,046
Процент CD50+ лимфоцитов:
ниже (п = 10) 60 25 30
выше (п = 22) 78 70 70
Р 0,41 0,076 0,006
дило также к статистически значимому снижению количества ЕКТ-клеток, как и в случае с ЕК-клетками, только у больных с низким ЛПО. В то же время, у пациенток с ТН РМЖ процент ЕК- и ЕКТ-клеток не ассоциировался с результатами лечения. Возможно, при химиотерапии большее значение могут иметь клетки адаптивного иммунитета, отвечающие на антигены разрушенных опухолевых клеток [18]. Таким образом, исходное количество ЕК- и ЕКТ-клеток ПК и характер его изменений в процессе лечения, по-видимому, имеют различное значение при разных подтипах РМЖ и разных вариантах терапии.
Основными клетками-эффекторами адаптивного противоопухолевого иммунитета являются CD3+CD8+-Т-лимфоциты. В настоящее время в клинических исследованиях этой популяции лимфоцитов уделяется большое внимание как важному благоприятному прогностическому фактору при многих злокачественных новообразованиях [19]. В настоящем исследовании у пациенток с ИБЯ2+ РМЖ статистически значимое повышение процента CD3+CD8+-Т-лимфоцитов ПК после таргетной терапии и х/т наблюдалось только у больных, лечение которых индуцировало высокую степень ЛПО. В то же время при ТН РМЖ высокая степень ЛПО сочеталась со сниженным количеством CD3+CD8+-Т-клеток в ПК и до, и после лечения. Причины снижения количества клеток основной эффекторной популяции в ПК у больных с данным подтипом РМЖ не ясны. Возможно, в данном случае большее значение для результатов лечения имеет количество этих клеток в опухолевом микроокружении и их функциональная активность.
В настоящее время установлено, что некоторые широко используемые в клинике химиопрепараты способны индуцировать иммуногенную гибель опухолевых клеток [18] и состояние иммунной системы пациента, и ее способность отвечать на проводимое лечение играют важную роль в клинической эффективности химиотерапии. Повышенный по сравнению с контролем до лечения процент CD3+ и CD3+CD4+-Т-лимфоцитов ПК ассоциировался со статистически значимым увеличением ОВ, БРВ и ВДП, что указывает на благоприятное значение исходно повышенного количества этих клеток у больных ТН РМЖ, получавших лечение цисплатином и доксорубицином.
Значительное внимание в клинических исследованиях уделяется популяциям регуляторных Т-клеток, которые играют важную роль в ускользании опухоли от иммунологического надзора. Регуляторные Т-клетки определяются среди Т-лимфоцитов и CD8+ и CD4+. Среди Т-клеток CD8+ особый интерес представляет популяция CD8+CD28--Т-лимфоцитов. Она является гетерогенной и включает в себя как клетки-супрессоры (продуцируют супрессорные цитокины ГЬ-10, ГЬ-4, TGFP), так и клетки-эффекторы (продуцируют эффекторные цитокины Ш№у, TNFa) [20]. Во многих клинических исследованиях у больных с различными злокачественными опухолями, включая РМЖ, Т-лимфоциты CD8+CD28-, как правило, характеризуются как супрессорная популяция [20—22]. При различных патологических состояниях большое значение имеет баланс между Т-клетками CD8+CD28+ и CD8+CD28- [22, 23]. И у больных ИБЯ2+ РМЖ, и у пациенток с ТН РМЖ с высокой степенью лечебного патоморфоза (группы В, D) до лечения были статистически значимо снижены процент CD8+CD28+ Т-клеток и величина соотношения CD8+CD28+/ CD8+CD28- (т.е. в пользу клеток-супрессоров) по сравнению с контролем. Важно отметить, что у пациенток с ПО РМЖ процент CD8+CD28—-Т-клеток был повышен только на ранних (I и II) стадиях заболевания.
В экспериментальных и клинических исследованиях в последние десятилетия активно изучалась роль регуляторных CD4+CD25+FOXP3+-Т-клеток (Трег), повышение количества которых в опухолевой ткани и периферической кро-
ORIGINAL ARTICLE
ви в большинстве случаев коррелирует с плохим прогнозом заболевания [24]. Однако в некоторых случаях повышение количества Трег может являться благоприятным прогностическим признаком [25, 26]. У больных HER2+ РМЖ была обнаружена статистически значимая отрицательная связь между степенью ЛПО и величиной соотношения CD8+CD28+/CD8+CD28- до лечения и статистически значимая положительная связь между степенью ЛПО и количеством CD4+CD25+FOXP3+ Трег до лечения. Полученные результаты, возможно, указывают на то, что в определенных ситуациях исходное повышение показателей регуляторного (супрессивного) звена иммунитета является реакцией на эффективный противоопухолевый иммунный ответ, существующий у пациенток на ранних стадиях РМЖ и у больных HER2+ и ТН РМЖ, положительно ответивших на проведенное лечение. В то же время уменьшение процента Трег и повышение соотношения CD8+CD28+/CD8+CD28- под влиянием терапии только у больных с высокой степенью ЛПО указывает на положительное значение снижения этих показателей после лечения. При этом снижение процента Трег происходило на фоне нормализации количества Т-клеток CD4+CD25+. Таким образом, увеличение количества лимфоцитов CD4+CD25+ у пациенток с высокой степенью ЛПО происходило, по-видимому, за счет активированных, а не регуляторных Т-клеток.
Заключение
Полученные нами результаты и данные других авторов подтверждают важное значение состояния иммунной системы пациента для обеспечения высокой эффективности проводимой противоопухолевой терапии. Различные популяции иммунокомпетентных клеток как врожденного, так и адаптивного иммунитета, вносят свой вклад в защиту организма от опухоли на разных этапах ее роста и участвуют в ответе организма на проводимое лечение. Повышение количества Т-лимфоцитов CD3+ и CD3+CD4+ до начала лечения, по-видимому, может иметь положительное значение у пациенток с первично неоперабельным ТН РМЖ, получающих лечение цисплатином и доксорубицином. Однако для подтверждения прогностического значения этих показателей требуется более длительный период наблюдения. Повышение по сравнению с нормой количества регулятор-ных Т-клеток CD4+CD25+FOXP3+ и уменьшение величины соотношения CD8+CD28+/CD8+CD28- в ПК до лечения не во всех случаях следует рассматривать как отрицательный фактор прогноза заболевания. Важно также изучать динамику этих показателей в процессе лечения и корреляцию этих изменений с эффективностью проводимого лечения. Выявление связи определенных популяций эффекторных и регуляторных клеток и характера их изменений в процессе противоопухолевой терапии с эффективностью проводимого лечения может помочь в установлении прогностических и предиктивных иммунологических маркеров, разработке индивидуальных подходов к лечению больных РМЖ и повышению его эффективности.
Финансирование. Работа поддержана грантом РФФИ № 14-04-00867.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература
4. Жукова Л.Г. Рак молочной железы с тройным негативным фенотипом у российской популяции больных. Клинико-морфологические особенности. Вопросы онкологии. 2015; 61(2): 189—94.
24. Кадагидзе З.Г., Черткова А.И., Славина Е.Г. Регуляторные Т-клетки и их роль в противоопухолевом иммунном ответе. Вопросы онкологии. 2009; 55(3): 269—77.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
references
1. Gutkin D.W., Shurin M.R. Clinical evaluation of systemic and local immune responses in cancer: time for integration. Cancer Immunol. Immunother. 2014; 63(1): 45—57.
2. Galluzzi L., Buqué A., Kepp O., Zitvogel L., Kroemer G. Immunological effects of conventional chemotherapy and targeted anticancer agents. Cancer Cell. 2015; 28(6): 690—714.
3. Dai X., Li T., Bai Z., Yang Y., Liu X., Zhan J., Shi B. Breast cancer intrinsic subtype classification, clinical use and future trends. Am. J. Cancer Res. 2015; 5(10): 2929—43.
4. Zhukova L.G. Breast cancer triple negative phenotype in Russian population of patients. Clinical and morphological features. Voprosy oncologii. 2015; 61(2): 189—94. (in Russian)
5. Jiang H., Rugo H.S. Human epidermal growth factor receptor 2 positive (HER2+) metastatic breast cancer: how the latest results are improving therapeutic options. Ther. Adv. Med. Oncol. 2015; 7(6): 321—39.
6. Chen D.S., Mellman I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 2013; 39(1): 1—10.
7. Emens L.A. Breast cancer immunobiology driving immunotherapy: vaccines and immune checkpoint blockade. Expert Rev. Anticancer Ther. 2012; 12(12): 1597—611.
8. Ahn S.G., Jeong J., Hong S., Jung W.H. Current issues and clinical evidence in tumor-infiltrating lymphocytes in breast cancer. J.Pathol. Transl. Med. 2015; 49(5): 355—63.
9. Liu S., Foulkes W.D., Leung S., Gao D., Lau S., Kos Z., Nielsen T.O. Prognostic significance of FOXP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in breast cancer depends on estrogen receptor and human epidermal growth factor receptor-2 expression status and concurrent cytotoxic T-cell infiltration. Breast Cancer Res. 2014; 16(5): 432.
10. Chester C., Fritsch K., Kohrt H.E.. Natural killer cell immunomodulation: targeting activating, inhibitory, and co-stimulatory receptor signaling for cancer immunotherapy. Front. Immunol. 2015; 6: 601.
11. Long E.O., Kim H.S., Liu D., Peterson M.E., Rajagopalan S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annu. Rev. Immunol. 2013; 31: 227—58.
12. Vivier E., Raulet D.H., Moretta A., Caligiuri M.A., Zitvogel L., Lanier L.L. et al.Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 2011; 331(6013): 44—9.
13. Subleski J.J., Jiang Q., Weiss J.M., Wiltrout R.H. The split personality of NKT cells in malignancy, autoimmune and allergic disorders. Immunotherapy. 2011; 3(10): 1167—84.
14. Terabe M., Berzofsky J.A. The role of NKT cells in tumor immunity. Adv. Cancer Res. 2008; 101: 277—348.
15. Junttila T.T., Parsons K., Olsson C., Lu Y., Xin Y., Theriault J. et
al. Superior in vivo efficacy of afucosylated trastuzumab in the treatment of HER2-amplified breast cancer. Cancer Res. 2010; 70(11): 4481—9.
16. Wang W., Erbe A.K., Hank J.A., Morris Z.S., Sondel P.M. NK cell-mediated antibody-dependent cellular cytotoxicity in cancer immunotherapy. Front. Immunol. 2015; 6: 368.
17. Musolino A., Naldi N., Bortesi B., Pezzuolo D., Capelletti M., Missale G. et al. Immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms and clinical efficacy of trastuzumab-based therapy in patients with HER-2/neu-positive metastatic breast cancer. J. Clin. Oncol. 2008; 26: 1789—96.
18. Pol J., Vacchelli E., Aranda F., Castoldi F., Eggermont A., Cremer I. et al. Trial watch: Immunogenic cell death inducers for anticancer chemotherapy, OncoImmunology. 2015; 4(4): e1008866.
19. Gooden M.J., de Bock G.H., Leffers N., Daemen T., Nijman H.W. The prognostic influence of tumour infiltrating lymphocytes in cancer: a systematic review with meta-analysis. Br. J. Cancer. 2011; 105(1): 93—103.
20. Filaci G., Fenoglio D., Fravega M., Ansaldo G., Borgonovo G., Traverso P. et al. CD8+CD28- T regulatory lymphocytes inhibiting T cell proliferative and cytotoxic functions infiltrate human cancers. J. Immunol. 2007; 179(7): 4323—34.
21. Karagöz B., Bilgi O., Gümüs M., Erikçi A.A., Sayan O., Türken O. et al. CD8+CD28— cells and CD4+CD25+ regulatory T cells in the peripheral blood of advanced stage lung cancer patients. Med Oncol. 2010; 27(1): 29—33.
22. Song G., Wang X., Jia J., Yuan Y., Wan F., Zhou X. et al. Elevated level of peripheral CD8(+)CD28(—) T lymphocytes are an independent predictor of progression-free survival in patients with metastatic breast cancer during the course of chemotherapy. Cancer Immunol. Immunother. 2013; 62(6): 1123—30.
23. Dai S.X., Wu G., Zou Y. et al. Balance of CD8+ CD28+/CD8+ CD28— T lymphocytes is vital for patients with ulcerative colitis. Dig. Dis. Sci. 2013; 58(1): 88—96.
24. Kadagidze Z.G., Chertkova A.I., Slavina E.G. Regulatory T-cells and their role in antitumor immune response. Voprosy. oncologii. 2009; 55(3): 269—77.
25. Badoual C., Hans S., Rodriguez J., Peyrard S., Klein C., Agueznay Nel H. et al. Prognostic value of tumorinfiltrating CD4(+) T-cell subpopulations in head and neck cancers. Clin. Cancer Res. 2006; 12(2): 465—72.
26. Ladoire S., Martin F., Ghiringhelli F. Prognostic role of FOXP3+ regulatory T cells infiltrating human carcinomas: the paradox of colorectal cancer. Cancer Immunol. Immunother. 2011; 60: 909—18.
Поступила 17.09.16 Принята в печать 03.11.16
