Прогностически значимые изменения состава миелограммы у больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Оригинальные статьи

прогностически значимые изменения состава миелограммы у больных диффузной в-крупноклеточной лимфомой

чэн Цзяо1,2, П.А. Зейналова1,2

1ФГБУ«НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; 2ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет); Россия, 119991, Москва, ул. Трубецкая, 8, стр. 2

Введение. Увеличение процентного содержания бластных клеток в миелограмме больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой (ДВКЛ) является прогностически неблагоприятным фактором. В работе оценена частота данного явления у 60 больных ДВКЛ и предпринята попытка анализа возможности выявления минимального поражения костного мозга различными проточно-цитометрическими методами.

Материалы и методы. Исследование проведено у 60 больных ДВКЛ. Диагноз во всех случаях установлен на основании критериев классификации ВОЗ. Исследование костного мозга проводилось на основании мазков пунктатов (миелограмма). Имму-нофенотипические иссследования включали широкую панель моноклональных антител к В-линейным антигенам CD19, CD20, CD21, CD22, CD24, CD45, а также каппа- и лямбда-цепям иммуноглобулинов.

Результаты. Увеличение процентного содержания бластных клеток в костном мозге больных ДВКЛ установлено в 73,3 % случаев. Эта группа пациентов имела более низкие показатели выживаемости. Использованы следующие методы идентификации моноклональных В-лимфоцитов костного мозга: анализ мембранных каппа- и лямбда-цепям иммуноглобулинов в пределах CD19+ клеток, в пределах зрелых CD45++ CD20+ лимфоцитов, в пределах CD5-негативных зрелых CD20+CD45++ лимфоцитов. Анализ уровней экспрессии различных дифференцировочных антигенов зрелых В-клеток — CD20, CD21, CD22, CD24. Установлено, что в пределах зрелых В-лимфоцитов костного мозга присутствует пропорция CD21-негативных клеток. Заключение. Наиболее информативными методами установления минимального поражения костного мозга при ДВКЛ являются оценка клональности по каппа- и лямбда-цепям мембранных иммуноглобулинов зрелых В-лимфоцитов (CD45++ CD20+CD5—), а также установление аберрантности зрелых В-лимфоцитов по экспрессии CD21.

Ключевые слова: диффузная В-крупноклеточная лимфома, поражение костного мозга, бластные клетки

PROGNOSTICALLY SIGNIFICANT BONE MARROw CELLuLAR CONTENT CHANGES

in diffuse large b-cell lymphoma

Cheng Jiao1,2, P.A. Zeynalova1 2

'N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center; 24 Kashyrskoe shosse, Moscow 115478, Russia; 2Sechenov University; 2 build., 8 Trubetskaya St., 119991 Moscow, Russia

Introduction. Increasing of blast cell percentage in bone marrow of diffuse large B-cell lymphoma patients is a sign of unfavourable prognosis. We estimated the frequency of this phenomenon and made attempts to idenify minimal bone marrow involvement in DLBCL by flow cytometry.

Materials and methods. Study has been done in 60 DLBCL patients. Diagnosis in all cases was done according to WHO (2008) criteria. Bone marrow study was done on smears (myelogram). Immunophenotypic study was done with a large panel of B-lineage monoclonal antibodies as well as kappa and lambda light chains to membrane immunoglobulins.

Results. Increase in blast cell content in bone marrow was noted in 73.3 % of DLBCL patients. That group of patients had lower survival. We used the following methods for identification of monoclonal B-lymphocytes: monoclonality according to membrane light immunoglobulin chains within mature B-lymphocytes and aberrancy of immunophenotype. Levels of different B-cell antigen expression — CD20, CD21, CD22, CD24. It was identified B-lymphocytes with aberrant expression of CD21.

Conclusion. The most informative methods of identification of minimal bone marrow involvement in DLBCL are estimation of clonality according to light chain expression of mature B-lymphocytes (CD45++CD20+CD5-), as well as assessement of aberrancy of CD21 expression of mature B-lymphocytes.

Key words: diffuse large B-cell lymphoma, bone marrow involvement, blast cells

Контакты: Чэн Цзяо [email protected]

DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-4-58-63

Оригинальные статьи 59

Введение

Прогностические факторы при диффузной В-круп-ноклеточной лимфоме (ДВКЛ) могут быть разделены на относящиеся к пациенту (возраст, статус по шкале Карновского) и факторы, относящиеся собственно к опухоли (стадия, опухолевая нагрузка, пролифери-рующая фракция, наличие экстранодального поражения). Сывороточные уровни лактатдегидрогена-зы, уровни р2-микроглобулина, пролиферирующая фракция являются индикаторами агрессивности заболевания. Важную роль в прогнозе ДВКЛ играет терапевтическая тактика, применяемая у больных. Международный прогностический индекс (1Р1) и скорректированный для возраста прогностический индекс (аа1Р1) разработаны как модели предсказания исходов на основе клинических факторов при оценке прогноза более чем у 4000 больных [1].

Поражение костного мозга является неблагоприятным фактором прогноза ДВКЛ. Общепринятая точка зрения состоит в том, что конкордантное вовлечение костного мозга при ДВКЛ существенно ухудшает прогноз (5-летняя общая выживаемость в этих случаях составляет 10 %), что не зависит от групп риска в соответствии с 1Р1 [2].

В наших предшествующих работах было показано, что изменения состава миелограммы у больных ДВКЛ в ряде случаев имеют прогностическое значение [3, 4]. В числе причин этого прогностически неблагоприятного явления может быть минимальное поражение костного мозга при ДВКЛ, не улавливаемое морфологическими методами.

В настоящей работе мы проанализировали частоту повышения процентного содержания бластных

0 50 100 150 200

Рис. 1. Кривые общей выживаемости в группах больных ДВКЛ с нормальным и повышенным (>1 %) содержанием бластных клеток в миелограмме

клеток в костном мозге больных ДВКЛ, а также проанализировали различные подходы к установлению минимального поражения костного мозга, основанные на оценке клональности зрелых В-лимфоцитов и абер-рантности их иммунофенотипа в сравнении с обычными В-клетками.

Материалы и методы

Исследование проведено у 60 больных ДВКЛ. Диагноз во всех случаях установлен на основании критериев классификации ВОЗ (2008) [5].

У всех больных проведен подсчет миелограмм двумя специалистами-гемоцитологами.

Иммунологические исследования проведены методом проточной цитометрии на приборе FACS CANTO II (Becton Dickinson, США). Использовали панель антител к антигенам В-лимфоцитов — CD19, CD20, CD21, CD24, а также к общелейкоцитарному антигену CD45, каппа- и лямбда-цепям иммуноглобулинов.

Результаты

Прогностически значимыми оказались следующие показатели миелограммы: повышение процента бластных клеток (значимость близка к достоверной), снижение процента нейтрофильных гранулоцитов, повышение процента оксифильных нормобластов.

Снижение процентного содержания нейтрофиль-ных гранулоцитов имело достоверную связь с поздними стадиями ДВКЛ. Прогностическая роль увеличения оксифильных нормобластов рассмотрена нами в отдельных публикациях.

В настоящей статье мы остановимся на увеличении процента бластных клеток в костном мозге больных ДВКЛ, возможных причинах этого явления и про-точно-цитометрических подходах к диагностике минимального поражения костного мозга при ДВКЛ.

Увеличение процентного содержания бластных клеток в миелограмме отмечено у 73,3 % больных ДВКЛ. Больные с содержанием бластных клеток 1 % и выше имели худшие показатели выживаемости (р = 0,172) (рис. 1), что подтверждает наши более ранние наблюдения.

Одной из причин повышения уровня бластов может быть наличие в костном мозге пациентов единичных опухолевых клеток ДВКЛ, которые на морфологическом уровне трудно отличимы от бластных клеток.

Вопрос диагностики минимального поражения костного мозга при ДВКЛ проточно-цитометриче-ским методом актуален, так как хорошо известно, что вовлечение в процесс костного мозга существенно ухудшает прогноз заболевания.

Для детального изучения В-клеточного звена костного мозга методом проточной цитометрии нами использованы 3 пробы (табл. 1).

Таблица 1. Панель моноклональных антител для изучения субпопуляций В-клеток костного мозга у больных диффузной В-крупноклеточ-ной лимфомой

№ пробы V450 V500 FITC PE PE-Cy5 PE-Cy7 APC APC-H7

1 CD21 CD45 CD9 CD30 CD19 - CD22 CD38

2 - - CD45 CD20 CD19 CD10 CD5 CD24

3 - - kappa lambda CD19 - - -

Необходимо было оценить возможность определения клональности В-лимфоцитов костного мозга у больных ДВКЛ. Следует отметить, что в стандартной постановке иммунологических реакций (см. табл. 1) мы использовали конъюгат антител к каппа-цепям иммуноглобулинов человека, меченный флуоресцеин-изтиоцианатом (FITC), а к лямбда-цепям — фикоэритрином (РЕ). Простое использование этих конъюгатов в сочетании с антителами к В-клет-кам (CD19), как правило, малоинформативно. Это обусловлено тем, что наряду со зрелыми В-лимфо-цитами в костном мозге присутствует выраженная пропорция В-линейных предшественников, негативных в отношении мембранных иммуноглобулинов. В этих случаях оценка клональности в пределах популяции CD19+ лимфоцитов представляется сложной ввиду разбавления В-клеток В-линейными предшественниками.

По этой причине целесообразно включение в панель определения клональности В-лимфоцитов маркеров, отражающих зрелость лимфоидных клеток. Мы использовали антитела к CD45 (позволяют исключить из анализа клетки-предшественники на основании более слабой экспрессии на них антигена) и CD20 (мембранный CD20 экспрессирован на всех зрелых В-клетках и лишь на небольшой пропорции предшественников). Сочетание этих 2 маркеров на мембране клетки характерно для зрелых В-лимфоцитов. Использованные антитела и флуо-рохромы представлены в табл. 2.

Таблица 2. Панель моноклональных антител, использованная для оценки моноклональности зрелых В-клеток костного мозга больных ДВКЛ

№ пробы V450 V500 FITC PE

1 CD20 CD45 Каппа Лямбда

Данное сочетание антигенов (CD45, CD20, каппа-цепи, лямбда-цепи) использовано при исследовании В-лимфоцитов костного мозга 6 больных ДВКЛ.

Приводим примеры различных вариантов экспрессии каппа- и лямбда-цепей на В-лимфоцитах костного мозга больных ДВКЛ.

Рис. 2. Экспрессия каппа- и лямбда-полипептидных цепей иммуноглобулинов на зрелых В-лимфоцитах (CD45++CD20+) костного мозга больного ДВКЛ. Лямбда-цепи присутствуют на 22,4 % В-лимфоци-тов (овал показан черной стрелкой), каппа-цепи — на 55,3 % клеток (показано голубой стрелкой). Реакция поликлональна

I

и

л и цГ и! ^

Рис. 3. Тенденция к моноклональности легких цепей иммуноглобулинов по лямбда-типу. Часть клеток имеют выраженную экспрессию (++) лямбда-цепей (обведены овалом). Видно, что в пределах этих клеток присутствует отчетливая пропорция крупных клеток, как показано на рис. 4

Пример поликлональной реакции представлен на рис. 2.

Следующий пример (рис. 3) иллюстрирует В-лимфоциты с наличием явной тенденции к моноклональности по лямбда-цепям мембранных

Оригинальные статьи 61

Рис. 4. Характеристики светорассеяния В-клеток костного мозга больной ДВКЛ. Видно, что в пределах клеток, гиперэкспрессирующих лямбда-цепи (обведены овалом на рис. 3) присутствует пропорция крупных клеток с большими значениями параметра 1 (соответствует FSC — прямому рассеянию света лазерного луча)

иммуноглобулинов. На рисунке овалом обведены клетки, гимерэкспрессирующие мембранные лямбда-цепи иммуноглобулинов. На рис. 4 показано, что в пределах клеток, гиперэкспрессирующих лямбда-цепи, присутствует пропорция крупных клеток.

Другой подход для оценки клональности В-кле-ток был применен с целью выявления минимального количества В-лимфоцитов с периферическим имму-нофенотипом (CD45+ CD20+ CD5-), моноклональ-ность по каппа- или лямбда-легким полипептидным цепям иммуноглобулинов. В этом случае для оценки клональности мы применили антитела, меченные АРС-Н7 и АРС (табл. 3).

Таблица 3. Панель моноклональных антител для оценки монокло-нальности зрелых CD5-негативных В-лимфоцитов костного мозга

№ пробы V500 FITC PE APC APC-H7

1 CD45 CD5 CD20 Каппа Лямбда

ность (неспецифическое связывание антител к каппа- и лямбда-цепям иммуноглобулинов); в 1 случае содержание В-клеток в костном мозге (CD20+) было очень малым — 0,57 %. В 3 случаях установлена кло-нальность, в 2 случаях анализируемые В-клетки были поликлональны.

На рис. 5 приведен пример поликлональности В-клеток костного мозга у больных ДВКЛ.

Представленные данные убедительно свидетельствуют о возможности оценки клональности В-кле-ток костного мозга у больных ДВКЛ.

Общая панель для исследования В-лимфоцитов (см. табл. 1) позволяет подробно оценить маркеры В-клеток в целом (CD19), их более зрелые формы (CD20); антигены, присутствующие практически на всех периферических В-клетках (CD21, CD22, CD24), клональность по экспрессии каппа- и лямбда-цепей, дополнительные и активационные маркеры (CD10, CD5, CD38, CD9), а также уровень зрелости клеток на основании экспрессии общелейкоцитарного антигена CD45.

Маркер CD19. Среднее содержание зрелых В-лим-фоцитов в костном мозге больных ДВКЛ среди CD45+ лимфоцитов составило 8,4 ± 1,4 % (диапазон от 0,8 до 22,8). Уровень CD22+ лимфоцитов в целом по группе больных ДВКЛ - 9,1 ± 1,6 % (0,17-23,0 %), уровни CD20 - 8,3 ± 1,4 % (0,04-22,0 %), содержание CD24+ в целом по группе - 7,2 ±1,6 % (0,06-22,1 %).

При оценке экспрессии антигена CD24 гейти-рования по CD45 было недостаточно (перекрест с Т-клетками), поэтому использовали в CD45+-renre оси CD19 и CD24. Практически все CD19+ клетки были СD24-позитивны. Количество CD21+ лимфоцитов в целом по группе - 6,6 ± 1,7 % (0,08-22,9 %).

Подобный подход был реализован у 7 больных ДВКЛ и оказался весьма успешным. Последовательность гейтирования была такова: CD45++ лимфоид-ные клетки (низкое SSC), CD20+ B-лимфоциты, CD5+ B-лимфоциты. Далее берем гейт CD5-^ra-тивных лимфоцитов, в котором присутствуют зрелые В-клетки - CD20+CD45++ CD5-. В этом гейте оцениваем клональность В-клеток по каппа- или лямбда-полипептидным цепям иммуноглобулинов. Из 7 случаев лишь в 1 не удалось оценить клональ-

Рис. 5. Пример поликлональной популяции CD45++CD20+CD5-В-лимфоцитов костного мозга у больного ДВКЛ

На большинстве зрелых В-клеток костного мозга (CD45+) присутствовали практически все пан-В-кле-точные антигены. Клональность популяции В-лим-фоцитов костного мозга по каппа- и лямбда-цепям, как правило, не наблюдалась.

При сравнении средних значений процентного содержания различных популяций лимфоцитов достоверные различия получены для популяций клеток CD19 и CD21, средние значения 8,37 и 6,55 %. Кроме того, достоверно различались популяции CD19 и CD24: 8,4 и 7,1 % (табл. 4).

Таблица 4. Попарное сравнение средних значений процентного содержания В-клеток костного мозга, выявляемого на основании экспрессии различных дифференцировочных антигенов, у больных ДВКЛ в пределах зрелых CD45++ лимфоцитов

Сравниваемые пары t Степень свободы P

CD19CD45- CD20CD45 1,835 17 ,084

CD19CD45- CD22CD45 -,341 16 ,738

CD19CD45- CD21CD45 2,350 13 ,035

CD19CD45- CD24CD45 2,415 14 ,030

CD20CD45- CD22CD45 -1,295 15 ,215

CD20CD45- CD21CD45 1,968 13 ,071

CD20CD45- CD24CD45 1,721 14 ,107

CD22CD45- CD21CD45 1,991 13 ,068

CD22CD45- CD24CD45 1,611 13 ,131

CD21CD45- CD24CD45 -,608 13 ,554

Для более глубокого понимания данного вопроса мы обратились к данным зарубежной и отечественной литературы относительно особенностей иммунофенотипа клеток ДВКЛ. Одной из таких

особенностей является отсутствие экспрессии антигена CD21 на клетках ДВКЛ. По данным отечественных онкогематологов, антиген экспрессирован лишь в 10 % случаев ДВКЛ [4].

Действительно, в ряде случаев ДВКЛ популяция зрелых В-лимфоцитов костного мозга была гетеро-генна по экспрессии данного антигена, что можно подтвердить конкретным примером (рис. 6а). Анализ экспрессии CD21 указывал на наличие четкой отрицательной фракции (рис. 6б). Содержание CD21-негативных В-клеток составило 9,7 % от В-лим-фоцитов. При оценке размера CD21-негативных В-лимфоцитов отчетливо определяется фракция более крупных клеток (в приведенном примере — 9,53 %, т. е. 0,01 % от общего числа миелокарио-цитов).

Таким образом, в пределах клеток костного мозга цитометрически можно выделять фракцию крупных клеток с фенотипом ДВКЛ даже при их очень низком содержании (в представленном случае 0,01 %).

Последующие исследования клональности и сопоставление с первичным иммунофенотипом необходимы для подтверждения взаимосвязи этих клеток с первичной ДВКЛ. Интересно отметить, что в целом популяция зрелых В-клеток (CD19+) у этого больного была поликлональной (рис. 6в). Популяцию более крупных клеток (CD21—) оценить с позиций клональности не удалось, так как не было подходящих флуорохромов.

Таким образом, оценка минимального поражения костного мозга при ДВКЛ должна базироваться на выявлении клональности В-лимфоцитов костного мозга по каппа- и лямбда-цепям иммуноглобулинов, степени зрелости клеток и особенностях их им-мунофенотипа.

Использование маркеров зрелых В-клеток (CD20+CD45++) позволяет выявить поликлональность

б

а

в

Рис. 6. Гейт зрелых В-лимфоцитов (CD45++CD19+) в костном мозге больного ДВКЛ (а); в пределах зрелых В-клеток присутствует фракция CD21-негативных лимфоцитов — 9,7 % (б); общая популяция В-клеток (CD19+) костного мозга больного поликлональна по каппа-и лямбда-цепям иммуноглобулинов (в)

Оригинальные статьи

63

В-клеток и тенденцию к моноклональности. Исключение из состава этих клеток CD5- позволяет с большей точностью оценить клональность зрелых В-кле-ток. Из 7 оцененных случаев в 2 возможно было установить моноклональность В-лимфоцитов.

Подробный анализ иммунофенотипа В-лимфо-цитов костного мозга больных ДВКЛ по экспрессии мембранных CD19, CD20, CD21, CD22, CD24 позволил установить особую группу пациентов с наличием CD21-негативных В-клеток. Это типично для первичной ДВКЛ. Для подобного анализа необходима многоцветная проточная цитометрия — CD45++CD19+ CD21—. Эти зрелые В-клетки наиболее напоминают по иммунофенотипу ДВКЛ, в пределах них присутствует фракция крупных клеток.

Дальнейший анализ минимального поражения костного мозга при ДВКЛ целесообразно вести имен-

но в этом направлении - поиска CD21-негативных В-лимфоцитов крупного размера, моноклональных.

Заключение

У большинства больных ДВКЛ повышено содержание бластных клеток в костном мозге. Эта группа больных характеризуется менее благоприятным прогнозом в сравнении с больными, у которых содержание бластных клеток нормальное. В связи с этим предпринята попытка установления минимального поражения костного мозга при ДВКЛ. Наиболее информативными оказались 2 подхода: исследование клональности В-клеток по каппа- и лямбда-цепям мембранных иммуноглобулинов в пределах популяции CD45++CD20+CD5- зрелых В-лимфоцитов, оценка аберрантности зрелых В-клеток (отсутствие экспрессии CD21).

Л И Т Е Р А Т

1. Shipp M.A., Harrington D.P., Anderson J.R. et al. A predictive model for aggressive non-Hodgkin's lymphoma. The international non-Hodgkin's lymphoma prognostic factors project. N Engl J Med 1993;329 (14):987-94. DOI: 10.1056/NEJM199309303291402. PMID: 8141877.

2. Campbell J., Seymour J.F., Matthews J. et al. The prognostic impact of bone marrow involvement in patients with diffuse large cell lymphoma varies according to the degree of infiltration and presence of discordant marrow involvement. Eur J Haematol 2006;76:473-80. DOI: 10.1111/j.1600-0609.2006.00644.x. PMID: 16529599.

У Р А / R E F E

3. Тупицын Н.Н., Зейналова П. А., Френкель М.А., Османов Е.А. Роль костного мозга в прогнозе диффузной В-крупноклеточной лимфомы. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии 2015;1:72-7. [Tupitsyn N.N. Zeynalova P.A., Frenkel M.A., Osmanov E.A. The role of the bone marrow in the prognosis of diffuse B-large cell lymphoma. Voprosy biologicheskoj, medicinskoj i farma-cevticheskoj himii = Questions of biological, medical and pharmaceutical chemistry 2015;1:72-7. (In Russ.)].

4. Зейналова П.А. Диагностическая

и прогностическая роль активацион-

R E N C E S

ных антигенов опухолевых клеток при диффузной В-крупноклеточной лимфоме. Автореф. дис. ... докт. мед. наук. М., 2015. 47 с. [Zeynalova Р.А. Diagnostic and prognostic role of activation antigens of tumor cells in diffuse large B-cell lymphoma. Author's abstract dis. ... of doctor of medical sciences. M., 2015. 47 p. (In Russ.)].

5. Stein H., Warnke R.A., Chan W.C. et al. Diffuse large B-cell lymphoma not otherwise specified. In: WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues (Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L. et al. -Eds). WHO Press, 2008. 233-7.

ORCID авторов /ORCID of authors

Цзяо Чэн/Cheng Jiao: https://orcid.org/0000-0002-9916-1992

П.А. Зейналова/P.A. Zeynalova: https://orcid.org/0000-0003-1564-424X

конфликт интересов. Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.