CC BY
30
КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 616-006.441-071:615.37
ДИФФУЗНАЯ В-КРУПНОКЛЕТОЧНАЯ ЛИМФОМА CD20-:
НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ДИАГНОСТИКИ И КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ
Исследование выполнено на базе отделения химиотерапии гемобластозов НИИ клинической онкологии Российского онкологического научного Центра имени Н.Н. Блохина (директор - академик М.И. Давыдов) у 338 больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой (164 мужчины и 174 женщины) в возрасте 14^90 лет (медиана 58). Диагноз диффузной В-крупноклеточной лимфомы во всех случаях установлен иммуноморфологиче-ским методом в 1995-2009 гг. В исследование включены только больные неспецифицированной ДВКЛ.
В исследование включены только больные неспецифицированной диффузной В-крупноклеточной лимфомой (ДВКЛ), больные со специфическими вариантами ДВКЛ (лимфомы ЦНС, первичная медиастинальная В-клеточная лимфома и т.д.) были исключены из анализа.
Морфологическая диагностика проводилась в отделе патологической анатомии опухолей человека РОНЦ им. Н. Н. Блохина (зав. - проф. А.И. Карселадзе) по результатам гистологического исследования опухолевой ткани в соответствии с критериями классификации опухолей кроветворной и лимфоидной тканей ВОЗ 2008 года [13].
Иммунофенотипирование клеток материала биопсии опухоли выполнена методом иммунофлуоресцент-ного окрашивания свежезамороженных (криостатных) срезов в лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ клинической онкологии РОНЦ. Панель МКА включала антитела к В-линейным антигенам опухолевых клеток и клеткам микроокружения - Т-лимфоцитам (CD3, CD5, CD7), макрофагам (CD163), фолликуляным дендритным клеткам (CD21, CD23), плазматическим клеткам (CD38).
Пациенты получали конвенциональную полихимиотерапию, применяемую при лечении ДВКЛ. В последние годы обязательным компонентом проводимого лечения были моноклональные антитела к CD20 (Ри-туксимаб).
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием программы SPSS 16.0 for Windows. Статистический анализ общей выживаемости производился по методике Kaplan-Meier (1958).
П.А. Зейналова, Е.Н. Шолохова, Е.А. Османов, Н.Н.Тупицын I. ВЕРИФИКАЦИЯ И ДЕТАЛИЗАЦИЯ ДИАГНОЗА
Резюме
Частота случаев ДВКЛ с отсутствием на мембране клеток антигена CD20 составила 1,5%. Уровни экспрессии мембранного антигена CD20 высоко коррелировали с экспрессией обще-В-клеточного антигена CD19. Верификация диагноза ДВКЛ в этих случаях возможна на основании экспрессии цитоплазматической детерминанты CD20 (антитела L26). CD20- и CD19- ДВКЛ формируют особую группу ДВКЛ и наблюдаются достоверно чаще при CD45--вариантах лимфом. Возможность применения препарата Ритуксимаб при CD20- лимфомах нуждается в дальнейшем изучении.
Ключевые слова: CD20- диффузные В-крупноклеточные лимфомы, CD19, CD45, L26, Ритуксимаб.
P.A. Zeinalova, E.N. Sholokhova, E.A. Osmanov, N.N. Tupitsyn I. VERIFICATION OF DIAGNOSIS AND DETAILS
Summary
CD20 negativity was noted in 1,5% of cases. Levels of membrane CD20 expression was highly correlated with the levels of expression of CD19. Diagnosis verification in that cases was possible on the basis of cytoplasmic CD20 expression by antibodies L26. CD20- and CD19- or weakly positive DLBCL has some specific features and was much frequently diagnosed in CD45- cases. Possibility of Rituximab treatment of CD20- DLBCL should be crefully studied.
Key words: CD20- diffuse large B-cell lymphoma, CD19, CD45, Rituximab.
Введение
Иммуногистохимическая диагностика диффузной В-крупноклеточной лимфомы в настоящее время является комплексной и в то же время чрезвычайно упрощена. Комплексность диагностики включает, в первую очередь, разграничение терминального и АВС-типов. Упрощение состоит в том, что на практике зачастую при морфологический картине диффузной крупноклеточной лимфомы вполне достаточно подтвердить ее В-клеточную природу на основании иммуногистохимического
обнаружения антигена СБ20. Поскольку подтверждение проводится по парафиновым блокам, чаще всего используют наиболее надежные антитела Ь26 (СБ20). Это необходимо для выбора правильного лечения, которое при ДБКЛ включает применение Мабтеры (Ритуксимаба).
Моноклональные антитела к СБ20 взаимодействуют с внеклеточным доменом антигена и вызывают гибель этих клеток различными механизмами. Парадокс состоит в том, что диагностические антитела Ь26 распознают не внеклеточный домен СБ20, а цитоплазматическую углеводную
детерминанту антигена. Примеры практически полного отсутствия антигена на мембране, но четкой реакции с антителами L26 на срезах хорошо известны. Наиболее типичный из них - В-ХЛЛ. При ДВКЛ слабая экспрессия CD20 на мембране злокачественных клеток зарегистрирована. При диагностике таких редких вариантов ДВКЛ очень важно использовать несколько антител к В-клеточным антигенам, так как экспрессия CD20 может быть достаточно слабой или даже отсутствовать [1; 2].
Существуют два варианта отсутствия CD20-антигена на мембране клеток диффузной В-крупноклеточной лимфомы:
1. Отсутствие при диагностике.
2. Отсутствие, индуцируемое терапией ан-ra-CD20 МКА (Мабтерой).
Второй вариант является более частым и может носить как обратимый характер, когда экспрессия антигена восстанавливается в сроки от 1 до 7 мес., так и быть необратимым в течение периода наблюдения [3-7]. В процессе терапии Мабтерой описана утрата CD20, которая явилась результатом делеции гена CD20 [9].
Первичные (de novo) CD20- ДВКЛ встречаются, главным образом, у HIV+ больных, но могут иметь место и при HIV- статусе [10-11]. Наибольшая выборка (28 больных; 1,9% от всех изученных ДВКЛ) представлена китайскими исследователями [ibid]. CD20- лимфомы имели ряд особенностей и характеризовались худшим прогнозом в сравнении с обычными CD20+ ДВКЛ. Важным параметром для прогноза ДВКЛ является оценка уровней мембранной экспрессии молекулы CD20 на злокачественных клетках [12].
Результаты
Имуногистохимический метод на криостат-ных срезах позволяет использовать различные типы антител к антигену CD20, включая антитела к мембранному экстрацеллюлярному домену этой молекулы. В числе таких антител - отечественные антитела LT20 (А.В. Филатов, «Сорбент», Россия). Следует отметить, что реакция антител LT20 в ряде случаев была слабой и невыразительной, не дающей оснований подтвердить В-клеточную природу лимфомы. При использовании антител L26 к цито-плазматической детерминанте антигена CD20 для подтверждения диагноза реакция во всех случаях была положительной. Сопоставление использования антител двух типов дано в табл. 1.
Таблица 1
Сопоставление двух антител к CD20 при диагностике ДВКЛ__
МКА Тип реакции Реакция L26 Итого
слабая яркая
Отрицательная 1* 3 4
LT-20 Слабая 0 18 18
Яркая 1 20 21
Итого 2 41 43
*Количество больных
В трех случаях отсутствия мембранного антигена и в 18 случаях слабой реакции с мембранным СБ20 цитоплазматическая детерминанта Ь26 четко выявлялась и позволяла подтвердить диагноз. Эти данные подтверждают хорошо известное по-
ложение о том, что антитела Ь26 являются наилучшими для верификации В-клеточной природы крупноклеточных лимфом.
Но встает серьезный вопрос о том, насколько правомочно применять Ритуксимаб в этих случаях, ведь уровни мембранной экспрессии СБ20 у данной категории больных крайне низкие или отрицательные. По-видимому, потребуются дополнительные исследования для оценки мембранной экспрессии антигена и соотнесения полученных данных с чувствительностью ДВКЛ к Ритуксимабу.
Хорошо известно, что уровни мембранной экспрессии пан-В-клеточных (СБ 19) и пан-Т-клеточных (СБ7) маркеров убывают по мере диф-ференцировки клеток от незрелых предшественников к эффекторным этапам периферических лимфоцитов.
ДВКЛ является периферической лимфомой, и мы оценили диагностическую значимость антител к СБ19 (в сопоставлении с антителами Ь26) у больных диффузной В-крупноклеточной лимфо-мой. В основном, использование антител Ь26 было продиктовано необходимостью верификации диагноза в случаях отрицательной или слабой реакции опухолевых клеток с антителами к СБ 19 или мембранным СБ20, табл. 2.
Таблица 2
Сопоставление антител к CD19 и CD20 (L26) в диагностике ДВКЛ__
МКА Тип реакции Реакция CD20 (L26) Итого
Слабая Яркая
Отрицат. 1* 7 8
CD19 Слабый 1 36 37
Сильный 0 16 16
Итого 2 59 61
*Количество больных
Во всех 45 случаях отрицательной или слабой реакции с антителами к СБ19 В-клеточная природа опухоли была подтверждена на основании выявления экспрессии СБ20 антителами Ь26. В данной выборке больных признаки (Ь26, СБ 19) не были взаимосвязаны, р=0,26.
При параллельном использовании антител к СБ19 и СБ20 (к мембранному домену) у 270 больных ДВКЛ выявлено высокое совпадение результатов (р=0,000), табл. 3.
Таблица 3
Параллельное использование антител СБ19 и антител к мембранному домену СБ20 в диагностике ДВКЛ____
Тип реакции Реакция CD20 (LT-20)
МКА отрицательная слабая сильная Итого
CD19 отрицательная 3* 2 1 6
слабая 1 22 48 71
сильная 0 0 193 193
Итого 4 24 242 270
*Количество больных
У 193 из 270 больных (71,5%) выявлена выраженная экспрессия обоих антигенов. У 22 пациентов (8,1%) она была слабой и лишь в 3 случаях (1,1%).
Частота различных типов экспрессии СБ 19 и СБ20 суммирована в табл. 4.
Таблица 4
Частота подтверждения В-клеточной природы ДВКЛ антителами к CD19 и CD20__
Маркер Тип реакции антител Всего
отрицательный слабый выраженный
CD19 10 (3%)* 81 (24,6%) 238 (70%) 329 (100%)
CD20 4 (1,5%) 24 (8,8%) 244 (71,8%) 272 (100%)
CD20 (L26) 0 2 (2,9%) 67 (97,1%) 69 (100%)
* Количество больных (%)
Таким образом, в целом частота отрицательных и слабоположительных по CD20 случаев ДВКЛ невелика, составляет -10%. Однако именно эти случаи нуждаются в дополнительной верификации перед назначением Ритуксимаба. Как показали наши исследования, для подтверждения В-клеточной природы ДВКЛ и ее периферического происхождения очень полезны антитела к CD37.
Насколько экспрессия CD19 и CD20 соотносится с экспрессией CD45? Проанализируем. Экспрессия антигена CD19 высоко коррелирует с таковой CD45. В пределах CD45- опухолей частота случаев отрицательных или слабоположительных по CD19 достоверно выше (77%), чем в группе CD45+ ДВКЛ (только 25%). Связь между этими признаками высоко достоверна (х2=16,4; р=0,000).
Еще более высокая степень корреляции получена для мембранного антигена CD20. Частота случаев отрицательной или слабо положительной реакции на CD20 в пределах CD45- ДВКЛ была в 7 раз выше, чем при CD45+ опухолях (50 и 8,2%, соответственно). Признаки достоверно взаимосвязаны (х2=22,2; р=0,000).
Следовательно, уменьшение экспрессии мембранных молекул CD20 и CD 19 на клетках ДВКЛ может являться следствием иммунологической ана-пазии и чаще наблюдается в CD45- опухолях. Как мы уже отмечали, зрело-В-клеточная природа во всех этих случаях была верифицирована на основании цитоплазматической экспрессии CD20 (L26).
При обсуждении иммунологического аспекта необходимо отметить следующее. Верификация ДВКЛ на основании крупного размера клеток, диффузного характера роста опухоли и экспрессии специфического маркера В-клеток CD20 (L26) стала рутинной практикой в диагностике ДВКЛ. В программы лечения широко вошел Ритуксимаб (протокол R-CHOP (Rituximab + CHOP), который позволил существенно улучшить результаты терапии. Для назначения данного препарата вполне достаточно верифицировать В-клеточную природу опухоли на основании экспрессии CD20 (L26) иммуно-гистохимически при окраске парафиновых срезов биопсийного материала опухоли. Наши исследования подтвердили, что наилучшим реагентом для
установления В-клеточной природы крупноклеточных лимфом, то есть для установления диагноза ДВКЛ, являются антитела Ь2б.
Вместе с тем, важно помнить, что антитела Ь26 распознают внутрицитоплазматическую детерминанту СБ20, а Ритуксимаб связывается с внеклеточной мембранной детерминантой. Может ли наблюдаться такая ситуация, когда антигенная детерминанта в цитоплазме присутствует, а мембранная экспрессия белка является слабой или даже отрицательной? Ответ на этот вопрос утвердительный - такая ситуация имеет место при такой периферической В-клеточной лимфоме как В-ХЛЛ. При ДВКЛ этот вопрос систематически не изучался. Единичные публикации свидетельствуют о том, что в редких случаях ДВКЛ экспрессия СБ20 и СБ19 на мембране опухолевых клеток может быть слабой или отсутствовать [1]. При проведении расширенного исследования СБ19 (329 больных) и мембранного СБ20 (272 больных) мы установили, что отсутствие мембранного антигена СБ20 может наблюдаться в 1,5% случаев ДВКЛ (4 наблюдения). Наши данные практически полностью совпадают с данными китайских исследователей, которые установили, что частота СБ20- лимфом составляет 1,9%.
Показания к назначению Ритуксимаба у этой крайне редкой категории больных могут явиться предметом дальнейшего изучения. Важно то, что нами впервые показана необходимость оценки мембранного СБ20 при ДВКЛ. Интересно отметить, что случаи отсутствия или слабой экспрессии СБ19 и мембранного СБ20 достоверно чаще встречаются при СБ45- ДВКЛ, что, по-видимому, является отражением их иммунологической анаплазии.
Практические выводы
1. Наилучшим реагентом при выявлении В-клеточной природы крупноклеточных лимфом, то есть, для установления диагноза ДВКЛ, являются антитела Ь26. Для установления диагноза ДВКЛ методом выбора является иммуногистохимическое окрашивание по парафиновым блокам.
2. Для установления мембранной экспрессии антигена с целью назначения Маб-теры целесообразно использовать метод флуоресцентной иммуногистохимии по криостатным срезам или метод проточной циофлуориметрии с использованием любых коммерческих антител к СБ20 за исключением Ь26.
3. Возможность использования иммуноги-стохимического окрашивания по парафиновым блокам с использованием антител Ь26 с целью назначения препарата Ритуксимаб нуждается в дальнейшем изучении.
Литература
1. Bertram H.C., Check I.J., Milano A.M. Immunophenotyping large B-cell lymphomas. Flow cytometric pitfalls and pathologic correlations. //Am. J. Clin. Pathol. -2001. -V.116. - P.191-203.
2. Hoeller S, Tzankov A, Feichter G, Obermann E, Dirnhofer S. Analysis of CD20 alone could be misleading in lineage determination of B-cell lymphomas: a case of CD20 negative diffuse large B-cell lymphoma in abdominal effusion //Cytopathology. 2009 Aug;20(4):273-4.
3. Maeshima A.M., Taniguchi H., Fukuhara S., Morikawa N., Munakata W., Maruyama D., Kim S.W., Watanabe T., Kobayashi Y., Tobinai K., Tsuda H. Follow-up data of 10 patients with B-cell non-Hodgkin lymphoma with a CD20-negative phenotypic change after rituximab-containing therapy //Am. J. Surg. Pathol. 2013 Apr;37(4):563-70.
4. Duman BB, Sahin B, Ergin M, Guvenc B. Loss of CD20 antigen expression after rituximab therapy of CD20 positive B cell lymphoma (diffuse large B cell extranodal marginal zone lymphoma combination): a case report and review of the literature//Med Oncol. 2012 Jun; 29(2): 1223-6.
5. Hiraga J, Tomita A, Sugimoto T, Shimada K, Ito M, Nakamura S, Kiyoi H, Kinoshita T, Naoe T. Down-regulation of CD20 expression in B-cell lymphoma cells after treatment with rituximab-containing combination chemotherapies: its prevalence and clinical significance//Blood. 2009 May 14;113(20): 4885-93.
6. Ferreri AJ, Dognini GP, Verona C, Patriarca C, Doglioni C, Ponzoni M. Re-occurrence of the CD20 molecule expression subsequent to CD20-negative relapse in diffuse large B-cell lymphoma //Haematologica. 2007 Jan; 92(1): e1-2.
7. Iguchi T, Miyazawa K, Okabe S, Kawakubo K, Shimamoto T, Kuriyama Y, Ito Y, Kimura Y, Ohyashiki K, Serizawa H, Iwaya K, Mukai K. Relapse of diffuse large B cell lymphoma to CD20-negative multiple cutaneous tumors immediately after anti-CD20 monoclonal antibody (rituximab) therapy //Rinsho Ketsueki. 2004 0ct;45(10): 1129-34.
8. Venugopal P, Leslie WT, O'Brien T, Gregory SA. CD20-negative relapse after (131)I-anti-CD20 therapy //J Clin Oncol. 1999 Nov;17(11):3692-3.
9. Nakamaki T, Fukuchi K, Nakashima H, Ariizumi H, Maeda T, Saito B, Yanagisawa K, Tomoyasu S, Homma M, Shiozawa E, Yamochi-Onizuka T, Ota H.//Eur. J. Haematol. 2012 0ct;89(4):350-5.
10. Teruya-Feldstein J, Chiao E, Filippa DA, Lin O, Comenzo R, Coleman M, Portlock C, Noy A. CD20-negative large-cell lymphoma with plasmablastic features: a clinically heterogenous spectrum in both HIV-positive and -negative patients //Ann Oncol. 2004 Nov;15(11): 1673-9.
11. Li Y.J, Li Z.M., Rao H.L., Xia Y, HuangH.Q., Xia Z.J., Li S., Li W.Y., Jiang W.Q.. CD20-negative de novo diffuse large B-cell lymphoma in HIV-negative patients: a matched case-control analysis in a single institution //J. Transl. Med. 2012 May 3;10: 84
12. Suzuki Y, Yoshida T, Wang G, Togano T, Miyamoto S, Miyazaki K, Iwabuchi K, Nakayama M, Horie R, Niitsu N, Sato Y, Nakamura N. Association of CD20 levels with clinicopathological parameters and its prognostic significance for patients with DLBCL //Ann Hematol. 2012 Jul;91(7): 997-1005.
13. Stein H., Warnke R.A., Chan W.C. et al. Diffuse large B-cell lymphoma not otherwise specified. In: WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues (Swerdlow S.H., Campo E. Harris N.L. et al. -Eds). -WHO Press. -2008. -P.233-237
Е.Н.Шолохова, П.А.Зейналова, Е.А.Османов, Н.Н.Тупицын II. ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
РЕДКИХ ВАРИАНТОВ ДИФФУЗНОЙ В-КРУПНОКЛЕТОЧНОЙ ЛИМФОМЫ
Резюме
Иммунофенотипирование опухолевой ткани 338 больных диффузной В-крупноклеточной лимфомой позволило выделить особые варианты заболевания, встречавшиеся с различной частотой: HLA-DR- - 9,3 % (32/331), CD45- - 3,9% (13/332), CD38+ - 55,9 (184/329), CD21+ - 12,4 (33/266), CD23+ - 12% (39/326), CD10+ -6,3% (15/238), CD30+ - 23,9% (21/88). Экспрессия ряда антигенов была взаимсвязана. Так, наличие на клетках ДВКЛ CD38 коррелировало с экспрессией рецепторов CD21 и CD23 (экспрессия этих двух антигенов также была достоверно взаимосвязана); в CD45- группе отмечена высокая экспрессия Ki-1 антигена (CD30), а при CD21+ фенотипе антиген CD30 не встречался. Наибольшую связь с клетками микроокружения имели CD38+ фенотипы - в этих случаях отмечена более выраженная реакция макрофагов, плазмоцитов, Т-лимфоцитов, присутствие в опухолевой ткани фолликулярных дендритных клеток (CD23+). Экспрессия маркеров светлых центров CD23 ассоциировалось с Т-клеточной реакцией, а CD10 - с макрофагальной. Для случаев CD30+ была нехарактерна плазмоклеточная реакция, а для HLA-DR- - Т-клеточная.
Ключевые слова: диффузная В-крупноклеточная лимфома, CD45, CD23, CD21, CD30, HLA-DR, CD10, CD38.
E.N.Sholokhva, P.A.Zeinalova, E.A.Osmanov, N.N.Tupitsyn
II. IMMUNOPHENOTYPIC PECULIARITIES
OF RARE VARIANTS OF DIFFUSE LARGE B-CELL LYMPHOMA
Summary
We have identified some specific variants of diffuse large B-cell lymphoma which take place with different frequency: HLA-DR- - 9,3% (32/331), CD45- - 3,9% (13/332), CD38+ - 55,9 (184/329), CD21+ - 12,4 (33/266), CD23+ - 12% (39/326), CD10+ - 6,3% (15/238), CD30+ - 23,9% (21/88). CD38+ variant correlated with expression of CD21 and CD23 (correlation between CD21 and CD23 was also noted); CD45- DBCL was characterized of high frequency of СD30-expression, and in CD21+ phenotype CD30 antigen was absent. In CD38-phenotype most of tumor microenvironment cells were prominent: macrophages, plasmacytes, T-lymphocytes, CD23+ follicular dendritic cells. Follicular center cell markers CD23 were associated with T-cell reaction, and CD10 - with macrophage infiltration. Prominent plasma cell reaction was not characteristic for CD30+ cases, and T-cell reaction - for HLA-DR- cases.
Key words: diffuse large B-cell lymphoma, CD45, CD23, CD21, CD30, HLA-DR, CD10, CD38
Введение
ДВКЛ является достаточно гетерогенным заболеванием. В основе диагностики редких вариантов лежит установление В-линейной принадлежности и
периферического иммунофенотипа опухоли. Чаще всего для этих целей используется маркер СБ20. Наибольшую популярность и клиническую значимость получила оценка профилей вЕР, позволившая выделить варианты ДВКЛ из клеток типа вСВ и из
