CC BY
39
Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное методом максимального правдоподобия на основе выравнивания из программы Mauve. Хозяева фагов указаны в скобках. Значения бутстрап-поддержки в процентах от 2000 реплик приведены рядом с узлами ветвления. На масштабной линейке отражено число нук-леотидных замен на позицию.
Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное с помощью метода ИРОМЛ на основе попарного сравнения геномов по общим используемым 9-мерам. Хозяева фагов указаны в скобках. На масштабной линейке отражено различие между геномами в процентах.
Матрица сходства переводилась в матрицу расстояний по формуле:
dist = 1 - sim,
где dist — расстояние между двумя геномами, а sim — сходство по Сёренсену. Эта матрица расстояний использовалась на входе алгоритма кластеризации UPGMA в MEGA X 64-bit. Полученное филогенетическое дерево показано на рис. 2.
Топология деревьев, представленных на рис. 1 и рис. 2, содержит определённые различия. Во-первых, разное положение генома бактериофага CF1 DK-2017, хозяином которого является Citrobacter. Видно, что на рис. 1 он попал в кладу с тремя саль-монеллёзными фагами (GJL01, YSP2 и FSL SP-126). На рис. 2, где изображено дерево, построенное предложенным нами методом, этот геном находится в кластере с двумя другими геномами фагов Citrobacter (Sazh, Stevie) и двумя геномами сальмонеллёз-ных фагов (phSE-2, phSE-5). Кроме того, геном фага FSL SP-126 на рис. 2 выделился во внешнюю группу.
Выводы. Очевидно, что метод попарного сравнения геномов по общим используемым k-мерам можно использовать для классификации геномов близкородственных организмов и реконструкции филогении.
Работа частично поддержана средствами гранта РФФИ (проект № 18-07-00899).
Список литературы
1. Chen, Y., Sun, E., Song, J., Tong, Y., Wu B. Three Salmonella enterica serovar Enteritidis bacteriophages from the Siphoviri-dae family are promising candidates for phage therapy // Can. J. Microbiol. - 2018. - 64:865-875.
2. Kumar, S., Stecher, G., Li M., Knyaz, C., Tamura, K. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms // Mol. Biol. Evol. - 2018. - 35:1547-1549.
3. Sorensen, T. A method of establishing groups of equal amplitude in plant sociology based on similarity of species content // Kongelige Danske Videnskabernes Selskab. Biol. krifter. — 1948. -4:1-34.
DOI: 10.34617/3z95-8b82 УДК 619:616.155.392:363.22/.28 ПРОФИЛАКТИКА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО
СКОТА ПУТЕМ СТИМУЛЯЦИИ Т-КИЛЛЕРНОЙ ЗАЩИТЫ МАКРООРГАНИЗМА PREVENTION OF BOVINE LEUKEMIA VIRUS INFECTION BY STIMULATION OF PROTECTIVE EFFECTS OF T-KILLER MACROORGANISMS
Полянина Татьяна Ивановна1, канд. биол. наук, Симоненко Наталья Валерьевна1, канд. биол. наук, Кузнецова Анна Евгеньевна2, канд. биол. наук, Ласкавый Владислав Николаевич3, д-р вет. наук 1ООО «БиоДжин-про», Саратов, Российская Федерация, 2ООО «САРБИОТЕХ», Саратов, Российская Федерация, 3Научно-исследовательский институт медико-ветеринарных биотехнологий (НИМБ), Москва, Российская Федерация, Polyanina Tatiana Ivanovna1, Ph.D. Biol. Sci., Simonenko Natalia Valerievna1, Ph.D. Biol. Sci., Kuznetsova Anna Evgenievna2, Ph.D. Biol. Sci., Laskavyi Vladislav Nikolaevich3, Dr. Vet. Sci 1BioGene-pro Co.Ltd, Saratov, Russian Federation, 2SARBIOTECH Co.Ltd, Saratov, Russian Federation, 3Scientific and research Institute of medical and veterinary biotechnologies, Moscow, Russian Federation.
Аннотация: в статье описан способ профилактики лейкоза крупного рогатого скота с помощью экспериментального препарата, стимулирующего выработку естественных Т-киллеров. Препарат представляет собой раствор водорастворимой белковой фракции, фосфатно-солевого буфера, водного раствора муравьиного альдегида и изотонического раствора натрия хлорида, взятых в определенном соотношении компонентов.
Ключевые слова: лейкоз крупного рогатого скота; натуральные киллеры; Т-киллеры.
Abstract: the article describes a method for the prevention of bovine leukemia with an experimental drug that stimulates the pro-
duction of natural T-killers. The preparation is a solution of water-soluble protein fraction, phosphate buffered saline, aqueous solution of formic aldehyde and isotonic sodium chloride solution, combined in a specific ratio of components.
Key words: cattle leukemia; natural killers; T-killers.
Известно, что лейкоз крупного рогатого скота (ЛКРС) -это хроническая болезнь вирусной этиологии и доказана возможность преодоления вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) видовых барьеров. Так, в условиях эксперимента удалось воспроизвести заболевание ВЛКРС у овец, кроликов и свиней [3].
В спонтанных условиях установлено носительство ВЛКРС у овец, зебу, буйволов. С 1997 года эта болезнь занимает первое место в структуре инфекционной патологии крупного рогатого скота (КРС) в России [2].
В соответствии с «Правилами по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота», утвержденными Приказом Министерства сельхозпрода России от 11 мая 1999 года №359, хозяйства, в которых установлено заболевание животных ЛКРС объявляются неблагополучными и в них вводят комплекс ограничений, препятствующих распространению инфекций.
Так, в хозяйстве, где выявлено до 10 % инфицированных ВЛКРС, то их немедленно сдают на убой, а в хозяйствах, где выявлено до 30 % и более инфицированных КРС, зараженных ВЛКРС размещают отдельно от здоровых животных. КРС через каждые 6 месяцев исследуют на ЛКРС.
Эффективные методы лечения ЛКРС до настоящего времени не разработаны, а оздоровительные мероприятия основаны лишь на выявлении зараженных ВЛКРС, изоляции и немедленной сдаче на убой больных животных, что свидетельствует о сложности создания иммунной защиты от данного вируса.
Известно, что основной функцией иммунной системы является обеспечение постоянства генетической и фенотипической гомогенности клеточных популяций организма [4], то в организме должны иметься ресурсы, которые можно активировать и использовать для защиты от вирусов.
Многочисленные данные свидетельствуют о важной роли Т-киллерной защиты в борьбе организма с инфекционными заболеваниями и «естественные киллеры» способны элиминировать инфицированные клетки [1]. Поэтому перспективным направлением является разработка препаратов, активирующих лимфоциты, натуральные киллеры и другие факторы естественной резистентности организма.
Цель исследования - разработка средства для профилактики лейкоза крупного рогатого скота.
Методика. Для приготовления экспериментального средства профилактики ЛКРС из ППД-туберкулина для млекопитающих извлекали белковую фракцию с молекулярной массой 18-20 кДа, 5 мг/мл.
Молекулярную массу белка определяли с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) на жидкостном хроматографе «Стайер». Для разделения на фракции использовали колонку BioSep-SEC-S 2000 5 мкм 145А, 300x7,8 мм. В качестве элюента применяли 0,01 М фосфатно-солевой буфер (ФСБ) с 0,025 % раствором азида натрия, рН 6,8. Затем готовили 0,074 % раствор медицинского муравьиного альдегида (РМА) в 0,85 %-ном растворе хлорида натрия (физиол.р-р).
После чего смешивали все компоненты в разных пропорциях и получили три раствора для инъекций с разными концентрациями белка: раствор №1 - 0,05 % белковой фракции, 9,95 % ФСБ, 0,037 % РМА, физиол.р-р до 100 %; раствор №2 - 0,075 % белковой фракции, 14,925 % ФСБ, 0,037 % РМА, физиол.р-р до 100 %; раствор №3 - 0,125 % белковой фракции, 24,875 % ФСБ, 0,037 % РМА, физиол.р-р до 100 %.
Результаты исследований и их обсуждение. В эксперименте было использовано 120 телят 2-9-дневного возраста в хозяйстве неблагополучном по ЛКРС. Все животные были разделены на девять экспериментальных и одну контрольную группы по 12 голов в каждой. Опытным группам животных вводили экспериментальный препарат для профилактики ЛКРС в различных дозировках (таблица 1).
Из таблицы 1 видно, что наиболее оптимальным соотношением компонентов является раствор №3 в дозировке 4-5 мл.
Таблица 1 - Сохранность и результаты иммунизации телят экспериментальными препаратом (п=12)
Препарат для профилактики ЛКРС Группы телят Доза препарата, на 1 гол. Погибло Выжило
абс. % абс %
Раствор №1 1 4 мл 0 0 12 100
2 5 мл 1 8,3 11 91,7
3 6 мл 3 25,0 9 75,0
Раствор №2 4 4 мл 2 16,7 10 83,3
5 5 мл 0 0 12 100
6 6 мл 2 16,7 10 83,3
Раствор №3 7 4 мл 0 0 12 100
8 5 мл 0 0 12 100
9 6 мл 1 8,3 11 91,7
Физиологический раствор Контроль 5 мл 4 33,3 8 66,7
Наблюдение за телятами продолжалось в течение пяти лет. У животных брали кровь для иммунологических исследований дважды, в 2,5 года и в 5 лет (таблица 2).
Результаты представлены в таблице 2, из которой следует, что у 2,5-годовалых нетелей регистрируется снижение соотношения Т-хелперов к Т-супрессорам (Тх/Тс) и достоверное увеличение ТЬ0 клеток, так называемых «естественных киллеров».
У 5-летних коров регистрировалось достоверное повышение содержания всех фракций лимфоцитов (Т и В) при сохранении повышенного содержания ТЬ0 (киллеров).
Наши результаты подтверждают литературные данные о том, что Т-киллерная защита играет значительную роль в противовирусном иммунитете.
Следует отметить, что, несмотря на то, что все экспериментальные животные содержались совместно с инфицированными, результаты серологических исследований на наличие антител к ВЛКРС в реакции иммунодиффузии у экспериментальных животных всех групп были отрицательные, а у контрольных среди 12 голов было выявлено 4 головы инфицированных ВЛКРС (33,3 %)
Таблица 2 - Иммунологические показатели нетелей (2,5 года) и коров 5-летнего возраста_
Группы Т- лимф. Тх-лимф. Тс-лимф. Тх/Тс Т- актив. В- лимф. ™
Нетели в возрасте 2,5 года
Обработан ные 3081+ 249,9 1522+ 133,1 1559+ 132,3 1,0+ 0,14 1631+ 133,5 517+ 39,5 1616+ 242,7
Контрольные 3343+ 286,1 2054+ 178,2 1295+ 113,8 1,6+ 0,07 1876+ 159,95 459+ 38,3 877+ 97,9
Коровы 5-летнего возраста
Обработан ные 4028+ 586,9 2369,6 + 345,5 1660,7 + 241,4 1,43+ 0,04 2167,9+ 318,2 528,29+ 68,8 1406,0+ 203,9
Контрольные 2421,14 +279,3 1489,0 +157,9 931,29 +127,1 1,66+ 0,11 1315,43 +154,8 288,43+ 32,9 744,43+ 110,6
Вывод: разработанный препарат для профилактики ЛКРС обеспечивает активизацию Т-киллерной защиты и долгосрочную устойчивость животных к заражению ВЛКРС.
Список литературы
1. Абакушина, Е. В. Основные свойства и функции NK-клеток человека / Е.В. Абакушина, Е. Г. Кузьмина, Е. И. Коваленко // Иммунология - 2012. - № 4. - С. 220-225.
2. Гулюкин, М.И. с соавт. Мониторинг эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота в товарных и племенных хозяйствах Российской Федерации за 20014-2015 годы // Ветеринария и кормление - 2016. -№ 4. - С. 5-41.
3. Гулюкин, М.И. с соавт. Межвидовая передача вируса лейкоза крупного рогатого скота в эксперименте // Вопросы вирусологии - 2015 - Т. 60, № 5. - С. 32-37.
4. Семененко, Т.А.Система естественных киллерных клеток как звено неспецифической иммунологически обусловленной резистентности / Т.А. Семененко, Г.М. Мамедов // Биомедицина - 2006, № 4. - С. 40-43
