CC BY
21
УДК. 636.2:636.082:591.3
Профилактика эмбриональной смертности у коров-реципиентов
Зубова Татьяна Владимировна, доктор биологических наук, профессор
е-таИ: suta54@mail.ru
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия»
Смоловская Оксана Владимировна, кандидат биологических наук, доцент
е-таИ: smol_vet@mail.ru
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия»
Плешков Владимир Александрович, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент
е-таИ: 6110699@mail.ru
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия»
Миронов Александр Николаевич, аспирант
е-mail: mironvet@mail.ru
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия»
Ключевые слова: коровы-реципиенты, стресс, эмбрионы, гормоны стресса, УЗИ-диагностка.
Аннотация. Представлены результаты исследований по профилактике эмбриональной смертности у коров-реципиентов при использовании комбинации средств анестезирующего и седативного действия для снятия стрессовой реакции при проведении трансплантации эмбрионов. Отмечено, что при сакральной анестезии 2%-ным раствором новокаина и внутримышечном введении 0,5 мл/100 кг раствора ксиланита перед трансплантацией эмбрионов физиологические показатели находились в пределах физиологической нормы. Показатели температуры колебались от 38,4±0,42 до 39,0 ±0,14 °С, пульс и дыхание через час после введения препаратов в 1-й опытной группе соответствовали физиологической норме (67,6±0,83 ударов в минуту и 26,0±2,38 дыхательных движений в минуту). Дозу введения раствора новокаина рассчитывали согласно наставлениям по применению препарата, а именно - измеряли длину крупа в см (от маклока до седалищных бугров) и делили ее величину на три, полученное число обозначало количество в мл раствора новокаина, необходимое для анестезии. Уровень кортизола был ниже в группе с применением комбинации средств на 24,6% (Р<0,01), чем в контроле через час после введения эмбрионов в половые пути самок. Показатель уровня адреналина в этой же группе также был ниже на 36,1 % (Р<0,01), чем группе контрольных жи-
вотных. Предположительно введение 2%-го раствора новокаина и ксиланита 0,5 мл/100 кг внутримышечно снизило стрессовую реакцию. По результатам УЗИ диагностики количество стельных коров-реципиентов в 1-й опытной группе составило 83,3%, во 2-ой опытной - 66,6%, в контроле - 50%. У всех животных контрольной группы наблюдали послеродовые осложнения.
Введение
Ученые-практики утверждают, что «приживаемость пересаженных заморожен-но-оттаянных эмбрионов на сегодняшний день колеблется в пределах 40-50%» [1]. Значимой проблемой при трансплантации эмбрионов является необходимость применения средств, которые способствуют профилактике заболеваний половой сферы у коров-реципиентов, а также лекарственных препаратов, повышающих жизнеспособность и приживаемость эмбрионов [2, 3].
Стрессовые воздействия влияют на физиологические и биохимические процессы в организме и как следствие на качество, жизнеспособность и приживаемость зародышей при трансплантации. От темперамента коров-реципиентов зависит частота стельности [4, 5]. На жизнеспособность эмбриона влияют воспалительные процессы в организме реципиента (мастит, пневмония, хромота). Стрессы у животных могут быть связаны с условиями содержания реципиента, а также с манипуляциями при введении эмбрионов [6]. О результате приживаемости эмбриона можно судить по стельности, которую определяют на 21-25-й день со дня введения эмбриона реципиенту [7]. В настоящее время существует практика применения 2%-го раствора новокаина для проведения сакральной анестезии, что положительно сказывается на самочувствии животного при проведении трансплантации. Это связано с тем, что после введения анестетика происходит расслабление мышц тела. Однако такие манипуляции с коровами-реципиентами не всегда оправданы, так как при расслабленном половом аппарате значительно труднее проводить манипуляции с рогом матки во время введения эмбриона. Поэтому зачастую такую анестезию проводят только беспокойным животным. Большинство научных исследований, посвященных трансплантации, проведены без учета стрессового воздействия на коров-реципиентов при введении эмбрионов.
Целью исследований является профилактика эмбриональной смертности у коров-реципиентов.
Задачи:
- провести акушерско-гинекологическую диспансеризацию коров-реципиен-
- установить влияние предложенных схем на физиологическое состояние на коров-реципиентов;
- определить содержание кортизола и адреналина у коров-реципиентов при различных способах подготовки к пересадке эмбрионов;
- провести УЗИ-диагностику коров контрольной и опытных групп.
Объекты, методы и условия проведения испытаний.
Проведен опыт на коровах-реципиентах черно-пестрой породы 3-5 лактации с продуктивностью 3900-4000 кг за лактацию. До начала опыта проводили акушерско-гинекологическую диспансеризацию коров для отбора в группу реципиентов (табл. 1).
Таблица 1 - Результаты диспансеризации коров (п=26)
Заболевания репродуктивных органов
Эндометрит Отрицательная реакция на суперовуляцию Киста яичников
Количество (%)
1(3,84) 6(23,07) 1(3,84)
То есть из 26 предполагаемых коров реципиентов было выбраковано 30,74% по результатам акушерско-гинекологической диспансеризации.
После акушерско-гинекологической диспансеризации из животных без патологии половой сферы было выбрано три группы: две опытных из 12 голов (по 6 голов в группе) и одна контрольная из 6 голов. Учитывали признаки половой охоты только при наличии рефлекса неподвижности и течки, так как рефлекс неподвижности является показателем готовности коровы к спариванию, течка - способствует формированию благоприятной среды во влагалище. Отсутствие одного из этих признаков в нулевой день полового цикла свидетельствует о гормональном сбое, поэтому эмбриопересадку проводили только при наличии обеих признаков. У всех из коров-реципиентов на 7-й день полового цикла до начала процедуры пересадки эмбриона было проведено клиническое обследование с использованием ультразвукового оборудования [8]. При исследовании яичников оценивают «состояние желтого тела по размеру, форме и консистенции, а также соответствию его развития стадии полового цикла. Хорошего качества желтое тело должно иметь основание не менее 1,5 см в диаметре и ясно выраженную головку. При задержке развития желтого тела, отсутствии его, а также при наличии фолликула, кисты или другой патологии яичника пересадку эмбриона реципиенту не проводили» (ГОСТ 28424-2014) [9].
Для благополучия протекающей беременности применяли персональное кормление по нормам и рационам для коров-реципиентов, учитывая изменения массы тела и молочной продуктивности. Нами были разработаны рационы.
Для исключения признаков нарушения обмена веществ у всех животных из яремной вены брали кровь и отправляли в областную лабораторию для биохимических и гематологических исследований.
Перед пересадкой эмбриона корову-реципиента фиксировали в станке, область вульвы и промежность обмывали водой комнатной температуры, проводили санацию половых органов перед проведением трансплантации эмбрионов препаратом Йодпротектин. Наблюдали за проявлением повторной охоты. На наличие стельности животных-реципиентов исследовали ректально на 60 день после пересадки эмбриона. Содержание коров в хозяйстве - беспривязное в типовых коровниках в течение всего года.
Снижение родовой активности устанавливали по времени выведения плода в ходе наблюдения за течением отела.
О задержке последа судили по времени его отделения (в норме 6 часов после отела). Если в течение 14 дней не отходили лохии, ставили предположительный диагноз - субинволюция матки.
Результаты и их обсуждения
Коровам первой опытной группы перед введением эмбрионов в половые пути проводили низкую сакральную анестезию 2%-ным раствором новокаина, подогретым до температуры 35-37 °С + ксиланит 0,5 мл/100кг внутримышечно. Раствор новокаина вводили эпидурально (между последним крестцовым и первым хвосто-
вым позвонками). Дозу новокаина определяли, измерив длину крупа (от маклока до седалищных бугров в см) и делили на три, данное число означало число в мл раствора новокаина, согласно инструкции по применению препарата [4].
Коровам второй опытной группы - ксиланит 0,5 мл/100 кг внутримышечно до проведения пересадки эмбрионов. Животным контрольной группы анестезию не проводили (табл. 2).
Таблица 2 - Схема опыта
Группа Препарат (способ введения)
Контрольная Без анестезии
Опытная 1 Новокаин 2% сакральная анестезия + Ксиланит 0,5 мл/100 кг внутримышечно перед введением эмбрионов
Опытная 2 Ксиланит 0,5 мл/100 кг внутримышечно до проведения пересадки эмбрионов
Ксиланит в дозе 0,5 мл/100 кг вызывает у животных умеренное седативное действие и снижает тонус мышц (однако животное находится в естественном стоячем положении), препарат имеет также обезболивающий эффект. Ксиланит можно использовать при проведении клинических обследований, незначительных хирургических вмешательствах (преимущественно в комбинации с местной анестезией) [12].
Новокаин - анестезирующий препарат, который блокирует натриевые каналы, препятствует формированию импульсов в окончаниях чувствительных нервов, а также проведению их по нервным волокнам.
«2% раствор новокаина по степени воздействия на организм относится к веществам 4 класса опасности (малоопасный) согласно ГОСТ 12.1.007-763» [10].
После введения препаратов, до наступления желаемого эффекта и спустя час после процедуры проводили клиническое обследование животных (табл. 3).
Таблица 3 - Физиологические показатели коров
Группа Температура, °С Пульс, ударов/мин Дыхание, дых. дв./мин Положение тела
Стандартный интервал 37,5-39,0 50-80 15-30 Естественное стоячее или лежачее
После введения препарата
Контрольная 38,8±0,23 88,5±1,09 41,0±2,04 Естественное стоячее
1-я опытная 38,6 ±0,18 78,5±0,93** 29,3±1,19** Естественное стоячее
2-я опытная 39,0 ±0,14 89,17±1,59 40,1±1,48 Естественное стоячее
Через час после введения
Контрольная 38,4±0,42 79,0±1,33 35,5±1,62 Естественное стоячее
1-я опытная 38,5 ±0,44 67,6±0,83** 26,0±2,38** Естественное стоячее
Группа Температура, °С Пульс, ударов/мин Дыхание, дых. дв./мин Положение тела
2-я опытная 38,9 ±0,38 79,3±1,64 33,83±1,53 Естественное стоячее
Различия статистически достоверны по сравнению с контролем: **Р<0,01; ***Р<0,001.
После введения препаратов и до наступления эффекта анестезии проведение клинического обследования показало, что частота пульса у животных 1-й опытной группы находилась на верхней границе физиологической нормы и составила 78,5±0,93 ударов в минуту, тогда как у животных контрольной и во второй опытной группы произошло увеличение частоты пульса до 88,5±1,09 и 89,17±1,59 ударов в минуту соответственно. Через час после введения препарата и проведения трансплантации частота пульса в контрольной и 2-й опытной группах находилась на верхних границах физиологической нормы. У животных 1-й опытной группы пульс был в пределах нормы и составил 67,6±0,83 ударов в минуту.
Отмечено также повышение количества дыхательных движений у животных 2-й опытной и контрольной групп 40,1±1,48 и 41,0±2,04 соответственно, даже через час этот показатель был выше физиологической нормы - 33,83±1,53 и 35,5±1,62 дыхательных движений в минуту соответственно. Показатели температуры у всех групп животных находились в пределах физиологической нормы.
Физиологические показатели указывают на стрессовое воздействие на животных, однако необходимы исследования по содержанию основных гормонов стресса у животных. Для исследований у каждой группы животных было отобрано по 3 пробы крови для исследований уровня кортизола и адреналина. Так как при стрессовой реакции повышается функциональная активность гипоталамо-гипо-физарно-надпочечниковой и симпатоадреналовой систем, увеличивается уровень гормонов кортизола и адреналина [10, 11].
В пробы крови для исследования на количество адреналина вносили 10%-ный раствор антикоагулянта (10% раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты натриевой соли), затем кровь центрифугировали 20 минут при 250 об/мин. В полученной плазме определяли концентрацию адреналина с использованием теста Адреналин ИФА (Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG, Nordhorn).
В сыворотке крови определяли содержание кортизола с использованием тестов СтероидИФА-кортизол-01 (ЗАО «Алкор Био», Россия) (табл. 4).
Таблица 4 - Содержание кортизола и адреналина у коров-реципиентов при различных способах подготовки к пересадке эмбрионов
Гормон, Фоновые пока- Группа
нмоль/л затели нмоль/л контрольная 1-я опытная 2-я опытная
Кортизол 34,22±1,15 35,4±1,33 28,4±1,43* 33,32±1,64
Адреналин 2,39±0,114 3,92±0,091 2,88±0,120* 3,84±0,122
Разность статистически достоверна: *Р<0,01
Через час после введения эмбрионов в половые пути самок показатель уровня кортизола был ниже в первой опытной группе на 24,6% (Р<0,01), чем в контроле и на 17,3%, чем во второй опытной группе.
Показатель уровня адреналина в 1-й опытной группе также был ниже на 36,1%
(Р<0,01), чем в группе контрольных животных и на 33,3 % ниже показателя во 2-й опытной группе. Предположительно введение 2%-го раствора новокаина и ксила-нита 0,5 мл/100 кг внутримышечно снизило стрессовую реакцию.
Эмбрион пересаживали в рог матки на стороне желтого тела в яичнике. После пересадки эмбриона корову-реципиента кормили и содержали в обычных условиях, не допуская стресса. Эффективность способа определяли путем подсчета количества коров-реципиентов, которым провели эмбриотрансплантацию, уровнем приживаемости зародышей. Результаты опыта приведены в таблице 5.
Таблица 5 - Результаты УЗИ-диагностики
Показатель Группа животных (коровы-реципиенты)
1-я опытная 2-я опытная 3-я опытная
Обработано животных, гол. 6 6 6
Число эмбриопересадок, п 6 6 6
Число стельных реципиентов, гол.- % 3/50 5/83,3 4/66,6
Окончательные показатели пересадки эмбрионов учитывали по результатам отела (табл. 6).
Таблица 6 - Послеродовые осложнения у коров-реципиентов
Показатель Группа животных (коровы-реципиенты) (голов)
1-я опытная 2-я опытная 3-я опытная
Обработано животных, гол. 6 6 6
Количество отелов 3 5 4
Осложнение родового процесса - - -
Задержание последа 1 - 1
Субинволюция матки 1 1 -
Послеродовой эндометрит 1 - 1
Итого послеродовых осложнений 3 1 2
Заключение
Проведение сакральной анестезии 2%-ным раствором новокаина в дозе 16,5 мл и внутримышечное введение ксиланита в дозе 0,5 мл/100 кг не вызывает отрицательного влияния на физиологические показатели животных. Через час после введения эмбрионов в половые пути самок показатель уровня кортизола был ниже в первой опытной группе на 24,6% ( Р<0,01), чем в контроле, и на 17,3%, чем во второй опытной группе.
Показатель уровня адреналина в 1-й опытной группе также был ниже на 36,1% (Р<0,01), чем в группе контрольных животных, и на 33,3% ниже показателя во 2-й опытной группе. Предположительно введение 2%-го раствора новокаина и ксиланита 0,5 мл/100 кг внутримышечно снизило стрессовую реакцию.
По результатам УЗИ-диагностики количество стельных коров-реципиентов в 1-й опытной группе составило 83,3%, во 2-ой опытной - 66,6%, в контроле - 50%. У всех животных контрольной группы наблюдали послеродовые осложнения. Проведение анестезии новокаином в комплексе с ксиланитом уменьшает стрессовую реакцию у коров-реципиентов, что способствует снижению эмбриональной смертности.
Статья подготовлена в рамках соглашения с Минобрнауки России № 05.607.21.0208 «Разработка технологии геномного редактирования для воспроизводства высокоценного племенного крупного рогатого скота молочного направления, устойчивого к вирусу лейкоза» уникальный идентификатор соглашения RFMEFI60718X0208.
Список литературы:
1. Alberto M.L.V., Meirelles F.V., Perecin F. et all. Development of bovine embryos derived from reproductive techniques. Reproduction fertility and development, 2013, vol. 25, no. 6, pp. 907-917.
2. Mapletoft R.J. History and perspectives on bovine embryo transfer. Animal Reproduction, 2013, vol. 10, no. 3, рр. 168-173.
3. Эффективность пересадки эмбрионов у телок-рецепиентов с высоким адаптивным потенциалом / А.В. Макаров, А.В. Бригида, В.И. Сорокин, О.А. Скачкова, С.Н. Ковальчук // Ветеринария и кормление. - 2018. - №4. - C. 25-27.
4. Kasimanickam R. , Asay M., Schroeder S., Kasimanickam V. , Gay J.M., Kastelic J.P., Hall J.B., Whittier W.D. Calm Temperament Improves Reproductive Performance of Beef Cows. Reproduction in Domestic Animals, 2014, vol. 49, no. 6. DOI: 10.1111/ rda.12436
5. Kasimanickam R., Schroeder S., Assay M., Kasimanickam V., Moore D.A.,Gay J.M. Whittier Influence of Temperament Score and Handling Facility on Stress, Reproductive Hormone Concentrations, and Fixed Time AI Pregnancy Rates in Beef Heifers. Reproduction in Domestic Animals, 2014, vol. 49, no. 5. DOI: 10.1111/rda.12368.
6. Kasimanickam R.K., Hall J.B., Estill C.T. et all. Flunixin meglumine improves pregnancy rate in embryo recipient beef cows with an excitable temperament. Theriogenology, 2018. vol. 107, pp. 70-77.
7/ Скачкова, О.А. Эффективность пересадки эмбрионов у телок-реципиентов / О.А. Скачкова, А.В. Бригида // Актуальная биотехнология. - 2018. - № 3 (26). - С. 560.
8. Патент РФ на изобретение № 2703104C2 «Способ прогнозирования при-живляемости эмбриона у коровы-реципиента в процессе проведения технологии трансплантации эмбрионов».
9. ГОСТ 28424-2014. Эмбрионы крупного рогатого скота ТУ.
10. GOST 12.1.007-76 System of labor safety standards. Harmful substance. Classification and General Safety requirements.
11. Troshina, T. A. Pharmacocorrection of selenodeficiency in animals with the drug DAPS-25 and its influence on productive qualities: abstract of the dissertation of Dr. vet. nauk / T. A. Troshina. - Saint Petersburg, 2010. -P. 41.
12. Портал Ветторг. URL: https://www.vettorg.net/pharmacyZ6/1342/ (дата обращения 30.04.2020 г.)
References:
1. Alberto M.L.V., Meirelles F.V., Perecin F. Development of bovine embryos derived from reproductive techniques. Reproduction fertility and development, 2013, vol. 25, no.6, pp. 907-917.
2. Mapletoft R.J. History and perspectives on bovine embryo transfer. Animal Reproduction, 2013, vol. 10, no. 3, pp. 168-173.
3. Makarov A.V., Brigida A.V., Sorokin V.I., Skachkova O.A., Kovalchuk S.N. Efficiency of embryo transfer in heifers-recipients with high adaptive potential. Veterinarija i kormlenie [Veterinary and feeding], 2018, no. 4. pp. 25-27.
4. Kasimanickam R., Asay M., Schroeder S., Kasimanickam V., Gay J.M., Kastelic J.P., Hall J.B., Whittier W.D. Calm temperament improves reproductive performance of beef cows Reproduction in domestic animals, 2014, vol. 49, no. 6. DOI: 10.1111/ rda.12436.
5. Kasimanickam R., Schroeder S., Assay M., Kasimanickam V., Moore D.A., Gay J.M., Whittier W.D. Influence of temperament score and handling facility on stress, reproductive hormone concentrations, and fixed time AI pregnancy rates in beef heifers. Reproduction in Domestic Animals, 2014, vol. 49, no. 5. DOI: 10.1111/rda.12368.
6. Kasimanickam R. K., Hall J. B., Estill C. T. Flunixin meglumine improves pregnancy rate in embryo recipient beef cows with an excitable temperament. Theriogenology, 2018, vol. 107, pp.70-77.
7. Skachkova O.A., Brigida A.V. Efficiency of embryo transplantation in heifers-recipients. Aktual'najabiotehnologija [Actual biotechnology], 2018., no. 3 (26), 560p. (in Russian)
8. Sposobprognozirovanija prizhivljaemostijembriona u korovy-recipienta v proc esseprovedenijatehnologiitransplantaciijembrionov [A method for predicting embryo survival in a recipient cow during the implementation of embryo transplant technology], patent RF, no. 2703104C2.
9. State Standard 28424-2014. TU cattle embryos.
10. State Standard 12.1.007-76 System of labor safety standards. Harmful substance. Classification and General Safety requirements.
11. Troshina T.A. Pharmacocorrection of selenodeficiency in animals with the drug DAPS-25 and its influence on productive qualities. Dokt.Diss. Saint Petersburg, 2010. 41p.
12. Vettorg portal. Avaluable at: https://www.vettorg.net/pharmacyZ6/1342/ (accessed 30 April 2020).
Prevention of embryonic mortality in recipient cows
Zubova Tatyana Vladimirovna, Doctor of Biological Sciences, Professor e-mail: suta54@mail.ru
Federal state budgetary educational institution of higher education "Kuzbass state agricultural Academy»
Smolovskaya Oksana Vladimirovna, Candidate of Biological Sciences, Associate Professor
e-mail: smol_vet@mail.ru
Federal state budgetary educational institution of higher education "Kuzbass state agricultural Academy»
Pleshkov Vladimir Alexandrovich, Candidate of Agricultural Sciences, Associate Professor
e-mail: 6110699@mail.ru
Federal state budgetary educational institution of higher education "Kuzbass state agricultural Academy»
Mironov Alexander Nikolaevich, graduate student e-mail: mironvet@mail.ru
Federal state budgetary educational institution of higher education "Kuzbass state agricultural Academy»
Keywords: recipient cows, stress, embryos, stress hormones, ultrasound diagnostics.
Abstract. The results of research on the prevention of fetal mortality in recipient cows using a combination of anesthetic and sedative agents to relieve the stress response conducting embryo transplantation are presented. It is noted that during sacral anesthesia with 2% novocaine solution and intramuscular administration of 0.5 ml/ 100 kg of xylanite solution before embryo transplantation, the physiological parameters were within the limits of the physiological norm. Temperature indicators range from 38.4±0.42 to 39.0 ±0.14 ° C, pulse and respiration an hour after administration of drugs in the first experimental group corresponded to the physiological norm (67.6±0.83 beats per minute and 26.0±2.38 respiratory movements per minute). The dose of novocaine solution is calculated according to the instructions for the use of the drug, namely, the length of the croup is measured in cm (from the mucus to the sciatic tubercles) and divided by three, the resulting number denote the amount in ml of novocaine solution require for anesthesia.The level of cortisol is lower in the group with the use of a combination of drugs by 24.6% (P<0.01) than in the control one hour after the introduction of embryos into the female genital tract.
