CC BY
44
ПРОЕКТ ГОСТ Р ИСО 19001
Изделия медицинские для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем с диагностическими реагентами in vitro для окрашивания в биологии
In vitro diagnostic medical devices - Information supplied by the manufacturer with in vitro diagnostic
reagents for staining in biology
1. Область применения
Настоящий стандарт устанавливает требования к информации, предоставляемой изготовителями с реагентами, применяемыми для окрашивания в биологии. Требования относятся к изготовителям, поставщикам и продавцам красителей, красок, хромогенных реагентов и других реагентов, применяемых для окрашивания в биологии. Требования к информации, предоставляемой изготовителями, устанавливаемые настоящим стандартом, являются необходимым условием получения сравнимых и воспроизводимых результатов во всех сферах окрашивания в биологии.
2. Нормативные ссылки
В настоящем стандарте приведены ссылки на следующие нормативные документы:
ISO 31-8. Величины и единицы - Часть 8: Физическая химия и молекулярная физика
ISO 1000. Единицы СИ и рекомендации по использованию их кратных и других единиц
EN 375:2001. Информация, предоставляемая изготовителем с регентами для диагностики in vitro для профессионального применения
ЕН 376:2001. Информация, предоставляемая изготовителем с регентами для диагностики in vitro для самотестирования
3. Термины и определения
Для целей настоящего стандарта применены следующие термины и соответствующие им определения:
3.1. информация, предоставляемая изготовителем (information supplied by the manufacturer): Вся печатная, письменная, графическая или иная информация, приданная или сопровождающая реагент для диагностики in vitro.
3.2. маркировка (label): Любая печатная, письменная или графическая информация, нанесенная на упаковку.
[EN 375]
3.3. реагент для диагностики in vitro (in vitro diagnostic reagent): Реагент, используемый самостоятельно или в комбинации с другими медицинскими изделиями для диагностики in vitro, предназначенный изготовителем для исследований in vitro веществ человеческого, животного или растительного происхождения с целью получения информации, относящейся к обнаружению, диагностике, мониторингу или лечению физиологических состояний, состояний здоровья или болезни иди врожденной аномалии.
3.4. окрашивание (staining): Придание цвета материалу с помощью реакции с красителем или хромогенным реагентом.
3.5. красящее вещество (dye): окрашенное органическое соединение, которое, будучи растворенным в подходящем растворителе, способно придать цвет материалу.
Примечание. Физической природой цвета является избирательная абсорбция (и/или эмиссия) в видимой области электромагнитного спектра между 400 нм и 800 нм. Красящие вещества являются молекулами с большими системами делокализованных электронов (связанных п-электронных систем). Характеристики абсорбции света красящих веществ представлены спектром абсорбции в форме диаграммы, на которой сопоставлены абсорбция света и длина волны. Спектр и длина волны при максимальной абсорбции зависят от химической структуры красящего вещества, растворителя и от условий спектрального измерения.
3.6. краситель, краска (stain): Раствор одного или нескольких красящих веществ в определенных концентрациях в определенном растворителе, используемый для окрашивания.
Примечание. Краска может быть приготовлены путем прямого растворения красящего вещества в растворителе или разведения готового основного раствора подходящими агентами.
3.6.1. основной раствор красителя (stock solution of stain): Стабильный определенный раствор одного или нескольких красящих веществ в более высокой концентрации, чем используемая при окраске.
Примечание. Стабильность означает постоянство свойств красящего вещества даже в присутствии других красящих веществ.
3.7. хромогенный реагент (chromogenic reagent): Реагент, который реагирует с химическими группами, присутствующими или вызванными в клетках и тканях, с образованием окрашенного соединения in situ.
Пример. Типичные хромогенные реагенты:
a) соль диазония;
b) реагент Шиффа.
3.8. флюорохром (fluorochrome): Реагент, который испускает видимый свет при облучении возбуждающим светом более короткой длины волны.
3.9. антитело (antibody): Специфический иммуноглобулин, образованный В-лимфоцитами в ответ на воздействие иммуногенным веществом и способный связываться с ним.
Примечание. Молекула иммуногенного вещества содержит одну или несколько частей с характерным химическим составом, эпитоп.
3.9.1. поликлональное антитело (polyclonal antibody): Смесь антител, способных специфически реагировать с определенным иммуногенным веществом.
3.9.2. моноклональное антитело (monoclonal antibody): Антитело, способное специфически реагировать с одиночным эпитопом определенного иммуногенного вещества.
3.10. зонд нуклеиновой кислоты (nucleic acid probe): Од-носпиральный олигонуклеотид или полинуклеотид определенной длины, комплементарный со специфической последовательностью нуклеотидов нуклеиновых кислот.
3.11. лектин (lectin): Белок неиммуногенного происхождения с двумя или несколькими связывающими участками, который распознает и связывается со специфическими остатками сахаридов.
4. Требования к информации, предоставляемой изготовителем
4.1. Общие требования
4.1.1. Информация, предоставляемая изготовителем с реагентами, используемыми для окрашивания в биологии
Информация, предоставляемая изготовителем с реагентами, используемыми для окрашивания в биологии, должна соответствовать ИСО 31-8, ИСО 1000, ЕН 375 и ЕН 376. Особое внимание следует уделить предупреждениям, приведенным в ЕН 375. Кроме того, если это применимо, требования, установленные в 4.1.2, 4.1.3 и 4.1.4, должны быть применены к различным реагентам, используемым для окрашивания в биологии.
4.1.2. Наименование продукта
Наименование продукта должно включать в себя регистрационный номер в CAS и наименование и номер индекса красителя, если это применимо.
Примечание 1. Регистрационные номера в СAS являются регистрационными номерами в Химической справочной службе (CAS). Они представляют собой числовые кодовые номера веществ, получивших индекс в Химической справочной службе приписанные химическим веществам.
Примечание 2. Индекс красок дает 5-значный номер, номер С.1 и специально составленное наименование большинства красящих веществ.
4.1.3. Описание реагента
Описание реагента должно включать в себя соответствующие физико-химические данные, сопровождаемые данные, применительно в каждой партии. Данные должны содержать, по крайней мере, следующую информацию:
a) молекулярную формулу, включая противо-ион;
b) молярную массу (г/моль) точно обозначенную, с включением противо-иона или без него;
c) допускаемые пределы интерферирующих веществ;
Для окрашенных органических соединений данные должны содержать:
d) молярную абсорбцию (вместо этого может быть приведено содержание молекулы чистого красящего вещества, но не содержание общего красящего вещества);
e) длина волны или число волн при максимальной абсорбции;
Г данные тонкослойной хроматографии, высоко производительной жидкостной хроматографии или высоко производительной тонкослойной хроматографии.
4.1.4. Предназначенное применение
Должно быть приведено описание, содержащее руководство по окрашиванию в биологии и количественные и качественные процедуры (если это применимо).
Информация должна включать сведения относительно следующего:
a) тип (типы) биологического материала, обращение и обработку перед окрашиванием, например:
1) могут ли быть использованы пробы клеток или тканей;
2) может ли быть использован замороженный или химически-фиксированный материал;
3) протокол для обращения с тканью;
4) какая закрепляющая среда может быть применена;
b) детали соответствующей методики реакции, использованной изготовителем для исследования реактивности красящего вещества, краски, хромогенного реагента, флюо-рохрома, антитела, зонда нуклеиновой кислоты или лектина, применяемых для окрашивания в биологии;
c) результат (результаты), ожидаемые при методике реакции на предполагаемом типе (типах) материала при способе, намеченном изготовителем;
d) замечания о подходящем положительном или отрицательном контроле ткани и об интерпретации результата (результатов);
e) ссылки на опубликованные результаты, полученные при использовании продукта способом, предлагаемым изготовителем.
4.2. Дополнительные требования к специфическим видам реагентов
4.2.1. Флюорохромы
Независимо от типа применения, флюорохромы, предлагаемые для окрашивания в биологии, должны сопровождаться следующей информацией:
a) избирательность, например, описание мишени (мишеней), которые могут быть продемонстрированы, используя специфические условия;
b) длины волн света возбуждения и испускания;
c) для флюорохромов, связанных с антителами, отношение флюорохром/белок (Ф/Б);
4.2.2. Соли металлов
В случае если предлагаются металлсодержащие соединения для применения в поглощающей металл методике при окрашивании в биологии, должна быть приведена следующая дополнительная информация:
a) систематическое наименование;
b) чистота (отсутствие примесей).
4.2.3. Антитела
Антитела, предлагаемые для окрашивания в биологии, должны сопровождаться следующей информацией:
a) описанием антигена (иммуногенного вещества), против которого направлено антитело и если антиген определен кластером системы дифференциации, номер СБ. Описание должно содержать, если это приемлемо, тип обнаруживаемой (макро) молекулы, часть которой должна быть обнаружена, клеточная локализация и клетки или ткани, в которых она находится и любая перекрестная реактивность с другими эпитопами;
b) для моноклональных антител - клон, метод образования (супернатант культуры ткани или асцитическая жидкость), подкласс иммуноглобулина и идентичность легкой цепи;
c) для поликлональных антител животное-хозяин, и используется цельная сыворотка или фракция иммуноглобулина;
d) описание формы (раствор или лиофилизированный порошок), количество общего белка и специфическое антитело и для раствора природа и концентрация растворителя или среды;
e) если применимо, описание любых молекулярных связующих веществ или наполнителей, добавленных к антителу;
Г) заявление о чистоте, технике очищения и методах обнаружения примесей (например, вестерн-блоттинг, иммуно-гистохимия);
g) соответствующие ссылки на публикации, посвященные применению антитела.
4.2.4. Зонды нуклеиновой кислоты
Зонды нуклеиновой кислоты, предлагаемые для окрашивания в биологии, должны сопровождаться следующей информацией:
a) последовательность оснований и является зонд одно-или двухспиральным;
b) молярная масса зонда или число оснований и, если приемлемо, число фракций (в процентах) пар оснований гуанин-цитозин;
c) использованный маркер (радиоактивный изотоп или нерадиоактивная молекула), точка прикрепления к зонду (3' и/или 5') и доля вещества в процентах меченого зонда;
d) обнаруживаемая генная мишень (последовательность ДНК или РНК);
e) описание формы (лиофилизированный порошок или раствор) и количество (пг или пмоль) или концентрация (пг/ мл или пмоль/мл), если соответствует, и в случае раствора, природа и концентрация растворителя или среды:
Г) заявление о чистоте, методиках очистки и методах обнаружения примесей, например, высокопроизводительная жидкостная хроматография;
g) соответствующие ссылки на публикации, касающиеся источников описания последовательности ДНК, существования любых известных патентов и информации по применению зондов нуклеиновой кислоты.
Приложение А (справочное)
Примеры информации, предоставляемой изготовителем с реагентами, обычно применяемыми в
методиках биологического окрашивания
А.1. Общие положения
Следующая информация представляет собой примеры процедур и не должна рассматриваться как единственный способ процедуры, которая должна быть проведена. Эти процедуры могли быть использованы изготовителем для исследования реактивности красящих веществ и иллюстрируют то, каким образом изготовитель может представить информацию, чтобы соответствовать настоящему стандарту.
А.2. Краситель метиловый зеленый-пиронин Y
А.2.1. Красящее вещество метиловый зеленый
Информация, касающаяся красящего вещества метиловый зеленый, следующая:
a) Идентичность продукта: Product identity:
- метиловый зеленый (синонимы: двойной зеленый SF, легкий зеленый);
- регистрационный номер CAS: 22383-16-0;
- наименование и номер индекса цвета: основной голубой 20, 42585.
b) Состав:
- молекулярная формула, включающая противо-ион:
С2бВД2+2В^
- молярная масса с (или без) противо-иона: 561,17 г моль-1 (387,56 г моль-1);
- массовая доля (содержание) метилового зеленого катиона: 85%, определено с помощью абсорбционной спектрометрии;
- допустимые пределы интерферирующих веществ, приведенные как массовые доли:
1) вода: меньше 1%;
2) неорганические соли: меньше 0,1%;
3) детергенты: не присутствуют;
4) окрашенные примеси, включая кристаллы виолета: не определимы с помощью тонкослойной хроматографии;
5) индифферентные соединения: 14% растворимого крахмала;
c) длина волны максимально абсорбции раствора красящего вещества: 633 нм;
d) тонкослойная хроматография: присутствует только один основной компонент, соответствующий метиловому зеленому;
e) обращение и хранение: стабильно при хранении в тщательно закупоренной коричневой бутылке при комнатной температуре (от 18 до 28oC).
А.2.2. Красящее вещество этиловый зеленый
Информация, относящаяся к красящемуся веществу этиловому зеленому, следующая:
a) Идентичность продукта:
1) этиловый зеленый (синоним: метиловый зеленый);
2) регистрационный номер CAS: 7114-03-6;
3) наименование и номер индекса красок: наименования в индексе красок нет, 42590;
b) Композиция:
1) молекулярная формула, включающая противо-ион:
C27H35n32+2BF4-;
2) молярная масса с (или без) противо-ионом: 575,19 г/моль-1 (401,58 г/моль-1);
3) массовая доля этилового зеленого катиона: 85%, определена с помощью абсорбционной спектрометрии;
4) допустимые пределы интерферирующих веществ, приведенные как массовые доли:
- вода: менее 1%;
- неорганические соли: менее 0,1%;
- детергенты: отсутствуют;
- окрашенные примеси, включая кристаллы виолета: не
обнаруживаются с помощью тонкослойной хроматографии;
- индифферентные соединения: 14% растворимого крахмала;
c) длина волны максимальной абсорбции раствора красящего вещества: 633 нм;
d) тонкослойная хроматография: присутствует только один основной компонент, совпадающий с этиловым зеленым;
e) обращение и хранение: стабильно при хранении в тщательно закрытой бутылке из коричневого стекла при комнатной температуре (от 18 до 28oC).
А.2.3. Красящее вещество пиронин Y
Следующая информация относится к красящему веществу пиронин Y:
a) идентичность продукта:
1) пиронин Y (синонимы: pyronine Y, пиронин G, pyronine
G);
2) регистрационный номер CAS: 92-32-0;
3) наименование и номер в индексе красок: наименование в индексе красок отсутствует, 45005.
b) Композиция:
1) молекулярная формула, включающая противо-ион:
C17H19n20+Cl-;
2) молярная масса с (или без) противо-ионом: 302,75 г/моль-1 (267,30 г/моль-1);
3) массовая доля пиронина Y катиона: 80%, определена с помощью абсорбционной спектрометрии;
4) допустимые пределы интерферирующих веществ, приведенные как массовые доли:
- вода: менее 1%;
- неорганические соли: менее 0,1%;
- детергенты: отсутствуют;
- окрашенные примеси, включая кристаллы виолета: не обнаруживаются с помощью тонкослойной хроматографии;
- индифферентные соединения: 19% растворимого крахмала.
c) длина волны максимальной абсорбции раствора красящего вещества: 550 нм.
d) тонкослойная хроматография: присутствует только один основной компонент, совпадающий с пиронином Y.
e) обращение и хранение: стабильно при хранении в тщательно закрытой бутылке из коричневого стекла при комнатной температуре (от 18 до 28oC).
А.2.4. Предназначенное применение метода окрашивания метиловым зеленым - пиронином Y
А.2.4.1. Тип (типы) материала
Краска метиловый зеленый-пиронин Y применяется для окрашивания свежезамороженных, парафинированных или пластиковых срезов различных видов тканей.
A.2.4.2. Обращение и обработка перед окрашиванием
Возможные фиксирующие средства включают в себя:
- жидкость Карноя [этанол (объемная доля 99 %) + хлороформ + уксусная кислота (массовая доля 99%), смешанные в объемах (60 + 30 + 10) мл]; или
- формальдегид (массовая доля 3,6%) забуференный фосфатом (рН 7,0); рутинное высушивание, очистка, пропитывание и покрытие парафином, обычное приготовление срезов с помощью микротома.
А.2.4.3. Рабочий раствор
Приготовить раствор этилового зеленого или метилового зеленого из количества, соответствующего массе 0,15 г чистого красящего вещества, рассчитанного как окрашенный катион (в приведенных выше примерах 0,176 г в каждом случае) в 90 мл горячей (50oC) дистиллированной воды.
Растворить количество, соответствующее массе 0,03 г пи-ронина Y, рассчитанного как окрашенный катион (в примере, приведенном выше, 0,038 г) в 10 мл 0,1 моль/л фталатного буфера (рН 4,0). Смешать последний раствор с раствором этилового зеленого или метилового зеленого.
А.2.4.4. Стабильность
Рабочий раствор стабилен, по крайней мере, одну неделю при хранении в плотно закрытой бутыли из коричневого стекла при комнатной температуре (от 18 до 28oC)
А.2.4.5. Методика окрашивания
А.2.4.5.1. Dewax парафинированные срезы.
А.2.4.5.2. Смочить срезы.
А.2.4.5.3. Окрашивать в течение 5 min при комнатной температуре (около 22oc) в рабочем растворе.
А.2.4.5.4. Промыть в двух сменах дистиллированной воды, от 2 до 3 с в каждой.
А.2.4.5.5. Стряхнуть излишнюю воду.
А.2.4.5.6. Активировать в трех сменах 1-бутанола.
А.2.4.5.7. Перенести непосредственно из 1-бутанола в гидрофобную синтетическую смолу.
А.2.4.6. Ожидаемый результат (результаты)
Следующие результаты ожидается получить с типами материалов, перечисленными в А.2.4.1:
a) для ядерного хроматина: зеленый (фиксатор Карнов) или голубой (фиксатор формальдегид);
b) для нуклеол и богатой рибосомами цитоплазмы: красный (фиксатор Карнов) или лиловато-красный (фиксатор формальдегид);
c) для матрицы хрящей и гранул тучных клеток: оранжевый;
d) для мышц, коллагена и эритроцитов: не окрашенные.
А.3. Реакция Фельгена-Шиффа
А.3.1. Красящее вещество парарозанилин
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ. Для R 40: возможный риск необратимых эффектов; для S 36/37: необходима защитная одежда и перчатки.
Следующая информация относится к красящему веществу парарозанилин.
a) Идентичность продукта:
1) парарозанилин (синонимы: основной рубиновый, па-рафуксин, парамагента, магента 0);
2) регистрационный номер САS: 569-61-9;
3) наименование и номер индекса красок: основной красный 9, 42500;
b) Композиция n:
1) молекулярная формула, включающая противо-ион:
c19H18N3+cl-;
2) молярная масса с (и без) притиво-иона: 323,73 г/моль-1 (288,28 г/моль-1);
3) массовая фракция парарозанилина катиона: 85%, определенная с помощью абсорбционной спектрометрии;
4) допустимые пределы интерферирующих веществ, приведенные как массовые доли:
- вода: меньше 1%;
- неорганические соли: меньше 0,1%;
- детергенты: не присутствуют;
- окрашенные примеси: метилированные гомологи пара-розанилина могут присутствовать в следовых количествах, определяемые с помощью тонкослойной хроматографии, но акридин отсутствует;
- индифферентные соединения: 14% растворимого крахмала.
c) длина волны максимально абсорбции раствора красящего вещества: 542 нм.
d) тонкослойная хроматография: присутствует один основной компонент, соответствующий парарозанилину; метилированные гомологи парарозанилина в следовых количествах.
e) обращение и хранение: стабильно при хранении в тщательно закупоренной коричневой бутылке при комнатной температуре (от 18 до 28oc).
А.3.2. Предназначенное применение реакции Фельгена-Шиффа
А.3.2.1. Тип (типы) материала
Реакция Фельгена-Шиффа применяется для парафинированных или пластиковых срезов различных видов тканей или цитологического материала (мазок, отпечаток ткани, культура клеток, монослой)
А.3.2.2. Обращение и обработка перед окрашиванием
А.3.2.2.1. Возможные фиксирующие вещества
Возможные фиксирующие вещества включают в себя:
a) гистология: формальдегид (массовая доля 3,6%), забу-ференный фосфатом (рН 7,0);
b) цитология:
1) жидкий фиксирующий материал: этанол (объемная доля 96%);
2) высушенный на воздухе материал:
- формальдегид (массовая доля 3,6%), забуференный фосфатом;
- метанол + формальдегид (массовая доля 37%) + уксусная кислота (массовая доля 100%) смешанные в объемах (85 + 10 + 5) мл.
Материал, фиксированный в фиксаторе Буина, непригоден для этой реакции.
Детали методики, примененной изготовителем для исследования реактивности хромогенного реагента, следующие:
А.3.2.2.2. Реагент парарозанилин-Шифф
Растворить 0,5 г парарозанилин-хлорида в 15 мл 1 моль/л соляной кислоты. Добавить 85 мл водного раствора К^205 (массовая доля 0,5%). Ожидать 24 ч. Взболтать 100 мл этого раствора с 0,3 г древесного угля в течение 2 мин и профильтровать. Хранить бесцветную жидкость при температуре не ниже 50С. Раствор стабилен в течение, по крайней мере, 12 мес в плотно закрытой посуде.
А.3.2.2.3. Раствор для промывания
Растворить 0,5 г К^205 в 85 мл дистиллированной воды. Добавить 15 мл 1 моль/л соляной кислоты. Раствор готов к немедленному применению и может быть использован до 12 часов.
А.3.2.3. Методика окрашивания
А.3.2.3.1. Депарафинировать парафинированные срезы в ксилене в течение 5 мин, затем промывать в течение 2 мин, прежде всего в этаноле с объемной долей 99% и затем в этаноле с объемной долей 50%.
А.3.2.3.2. Смочить пластиковые срезы, депарафинирован-ные парафинированные срезы и цитологический материал в дистиллированной воде в течение 2 мин.
А.3.2.3.3. Гидролизовать материал в 5 моль/л соляной кислоте при 220С в течение от 30 до 60 мин (точное время гидролиза зависит от типа материала).
А.3.2.3.4. Промывать дистиллированной водой в течение 2 мин.
А.3.2.3.5. Окрашивать реагентом парарозанилин в течение 1 ч.
А.3.2.3.6. Промыть в трех последовательных сменах промывного раствора, по 5 мин в каждой.
А.3.2.3.7. Промыть дважды дистиллированной водой по 5 мин каждый раз.
А.3.2.3.8. Дегидратировать в этаноле сной долей 50%, затем с 70% и, наконец, в 99% этаноле, по 3 мин каждый раз.
А.3.2.3.9. Промыть дважды в ксилене, по 5 мин каждый
раз.
А.3.2.3.10. Извлечь синтетическую гидрофобную смолу.
А.3.2.4. Ожидаемые результаты
Следующие результаты ожидаются с типом материалов, перечисленных в А.3.2.1: для ядер клеток (ДНК): красный цвет.
А.4. Иммунохимическая демонстрация рецепторов эстрогенов
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ. Реагент, содержащий азид натрия (15 ммоль/л). N¿N3 может реагировать со свинцом или медью, образуя взрывчатые азиды металлов. При удалении смыть большим объемом воды.
А.4.1. Моноклональный мышиный античеловеческий рецептор эстрогенов.
Следующая информация относится к моноклональному мышиному античеловеческому рецептору эстрогенов.
a) Идентичность продукта: Моноклональный мышиный античеловеческий рецептор эстрогенов. Клон 1D5.
b) Клон: 1D5.
c) Иммуноген: рекомбинантный человеческий белок рецептора эстрогенов.
d) Источник антител: моноклональное мышиное антитело, поставленное в жидкой форме как супернатант тканевой культуры.
e) Специфичность: антитело реагирует с N-концевым доменом (А/В регион) рецептора. При иммуноблоттинге оно реагирует с 67 kDa полипепетидной цепью, полученной путем трансформации Escherichia coli и трансфекции COS клеток плазмидными векторами, экспрессирующими рецептор эстрогенов. Кроме того, антитело реагирует с цитозольны-ми экстрактами лютеального эндометрия и клетками линии MCF-7 рака грудной железы человека.
f) Перекрестная реактивность: антитело реагирует с рецепторами эстрогенов крыс.
g) Композиция: супернатант культуры ткани (среда RPMI 1640, содержащая сыворотку плода теленка), диализирован-ный против 0,05 ммоль/л Tris/HCl, рН 7,2, содержащий 15 ммоль/л NaN3.
- концентрация Ig: 245 мг/л;
- изотип Ig: IgGl;
- идентичность легкой цепи: каппа;
- концентрация общего белка: 14,9 г/л.
h) Обращение и хранение: стабильна до трех лет при температуре хранения: от 2 до 8oC.
А.4.2. Предназначенное применение
А.4.2.1. Общие положения
Антитело применяется для качественного и полуколичественного обнаружения экспрессии рецептора эстрогенов (например, рак грудной железы).
А.4.2.2. Тип (типы) материала
Антитело может быть применено на фиксированных формалином, парафинированных срезах, фиксированных ацетоном замороженных срезах и на мазках клеток. Кроме того, антитело может быть применено для детекции антител фер-ментсвязанным иммуносорбентным исследованием (ELISA).
А.4.2.3. Методика окрашивания для иммуногистохимии
А.4.2.3.1. Общие положения
Для фиксированных формалином, парафинированных срезов тканей применяются разнообразные чувствительные технологии окрашивания, в том числе иммунопероксидазная методика, технология АРААР (щелочная фосфатаза антищелочная фосфатаза) и авидин-биотиновые методы, например, методы LSAB (Меченые СтрептАвидин-биотин). Изменения антигена, такие, как нагревание в 10 ммоль/л цитратном буферном растворе, рН 6,0, являются обязательными. Слайды не должны высушиваться при такой обработке или при следующей процедуре иммуногистохимического окрашивания. Для окрашивания мазков клеток предложен метод АРААР.
Детали методики, использованной изготовителем на фиксированных формалином парафинированных срезах тканей для исследования реактивности антитела для иммуногисто-химии, приведены в разделах от А.4.2.3.2 до А.4.2.3.4.
А.4.2.3.2. Реагенты
А.4.2.3.2.1. Перекись водорода, массовая доля 3% в дистиллированной воде.
А.4.2.3.2.2. Трис-буфер солевой (TBS), состоящий из 0,05 моль/л Tris/Hcl и 0,15 моль/л.
А.4.2.3.2.3. Первичное антитело, состоящее из монокло-нального мышиного античеловеческого рецептора эстрогенов, разведенного оптимально в TBS (см. А.4.2.3.4).
А.4.2.3.2.4. Биотинилированное козье антитело к мышиным/кроличьим иммуноглобулинам, рабочий раствор.
Приготовить этот раствор по меньшей мере за 30 мин, но не раньше, чем за 12 ч перед применением, следующим образом:
- 5 мл TBS, рН 7,6;
- 50 мкл биотинилированного, изолированного от аффинитета козьего антитела против мышиных/кроличьих иммуноглобулинов в 0,01 моль/л фосфатном буферном растворе, 15 ммоль/л NaN3, в количестве, достаточном, чтобы довести конечную концентрацию от 10 до 20 мг/мл.
А.4.2.3.2.5. Комплекс СтрептАвидин-биотин/пероксидаза хрена (StreptABComplex/HRP), рабочий раствор.
Приготовить данный раствор следующим образом:
- 5 мл TBS, рН 4 7,6;
- 50 мкл СтрептАвидина (1 мг/л) в 0,01 моль/л фосфатном буферном растворе, 15 ммоль/л NaN3;
- 50 мкл биотинилированной пероксидазы хрена (0,25 мг/л) в 0,01 моль/л фосфатном буферном растворе, 15 ммоль/л NaN3.
А.4.2.3.2.6. Раствор диаминбензидинового субстрата (DAB).
Растворить 6 мг 3,3'-диаминбензидинтетрагидрохлорида в 10 мл 0,05 моль/л TBS, рН 7,6. Добавить 0,1 мл перекиси водорода массовой долей 3% в дистиллированной воде. Если произошла преципитация, профильтровать.
А.4.2.3.2.7. Гематоксилин.
Растворить 1 г гематоксилина, 50 г алюминий калий сульфата, 0,1 г йодата натрия и 1,0 г лимонной кислоты в 750 мл дистиллированной воды. Довести до 1000 мл дистиллированной водой.
А.4.2.3.3. Методика окрашивания.
А.4.2.3.3.1. Депарафинировать и регидратировать срезы ткани; провести изменение антигена (см. вышеприведенную методику окрашивания).
А.4.2.3.3.2. Инкубировать с перекисью водорода массовой долей 3% в дистиллированной воде в течение 5 мин.
А.4.2.3.3.3. Промыть дистиллированной водой и поместить в TBS на 5 мин.
А.4.2.3.3.4. Инкубировать с моноклональным мышиным античеловеческим рецептором эстрогенов, разведенным оптимально в TBS (см. А.4.2.3), в течение от 20 до 30 мин.
А.4.2.3.3.5. Промыть TBS и поместить в баню TBS на 5 мин.
А.4.2.3.3.6. Инкубировать с рабочим раствором биотинилированного козьего антитела к мышиным/кроличьим иммуноглобулинам в течение от 20 до 30 мин.
А.4.2.3.3.7. Промыть TBS и поместить в баню TBS на 5 мин.
А.4.2.3.3.8. Инкубировать с рабочим раствором комплекса СтрептАвидин-биотин/пероксидаза хрена в течение от 20 до 30 мин.
А.4.2.3.3.9. Промыть TBS и поместить в баню TBS на 5 мин.
А.4.2.3.3.10. Инкубировать с раствором DAB в течение 5-15 мин (при обращении с DAB использовать перчатки).
А.4.2.3.3.11. Промыть дистиллированной водой.
А.4.2.3.3.12. Контрастное окрашивание раствором гематоксилина в течение 30 с.
А.4.2.3.3.13. Промыть водой из-под крана в течение 5 мин.
А.4.2.3.3.14. Промыть дистиллированной водой в течение 5 мин.
А.4.2.3.3.15. Дегидратировать этанолом с объемной долей 50% в течение 3 мин, затем 3 мин с объемной долей 70% и, наконец, 3 мин с объемной долей 99%.
А.4.2.3.3.16. Промыть в двух сменах ксилена по 5 мин в каждой.
А.4.2.3.3.17. Извлечь в синтетическую гидрофобную смолу.
А.4.2.3.4. Предлагаемые разведения
Оптимальное окрашивание может быть получено путем разведения антитела в TBS с рН 7,6, смешанным по объему
от 1 + 50 мкл до 1 + 75 мкл при исследовании на фиксированных формалином парафинированных срезах раковой опухоли грудной железы человека. Антитело может быть разведено TBS, смешанным по объемам от 1 + 50 мкл до 1 + 100 мкл для использования в технологии АРААР и авидин-биотиновых методах при исследовании фиксированных ацетоном срезах замороженной ткани раковой опухоли грудной железы.
А.4.2.3.5. Ожидаемые результаты
Антитело интенсивно метит ядра клеток, которые, как известно, содержат обильное количество рецепторов эстрогенов, например, эпителиальные и миометриальные клетки матки и нормальные и гиперплазированные эпителиальные клетки молочных желез. Окрашивание преимущественно локализовано в ядрах без окрашивания цитоплазмы. Однако, на срезах криостата, содержащих небольшие или неопределимые количества рецепторов эстрогенов (например, эпителий кишечника, клетки сердечной мышцы, клетки мозга и соединительной ткани), отмечают отрицательные результаты с антителом. Антитело метит эпителиальные клетки карциномы грудной железы, которые экспрессируют рецептор эстрогенов.
Окрашивание ткани зависит от обращения и обработки ткани до окрашивания. Неправильная фиксация, замораживание, оттаивание, промывание, высушивание, нагревание, срезание или загрязнение другими тканями или жидкостями может вызвать артефакты или ложноотрицательные результаты.
А.5. Демонстрация Т-клеток с помощью проточной ци-тометрии
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ. Реагент содержит азид натрия (15 ммоль/л). №N3 может реагировать со свинцом или медью, образуя взрывоопасные азиды металлов. При удалении смыть большим объемом воды.
А.5.1. Моноклональные мышиные античеловеческие Т-клетки
Следующая информация относится к моноклональным мышиным античеловеческим Т-клеткам:
a) идентичность продукта: Моноклональные мышиные античеловеческие Т-клетки, СБ3.
b) клон: иСНТ1.
c) иммуноген: человеческие детские тимоциты и лимфоциты от пациента с болезнью Сезари (Sezary).
d) источник антител: очищенные моноклональные мышиные антитела.
e) специфичность: антитело реагирует с Т-клетками в тимусе, костном мозге, периферической лимфоидной ткани и крови. Большинство Т-клеток опухолей также экспрессиру-ют антиген СБ3, но он отсутствует в не Т-клеточных лимфо-идных опухолях. Согласуется с моделью синтеза антигена в нормальных тимоцитах, наиболее ранним местом определения в опухолевых клетках является цитоплазма клетки.
Г композиция:
- 0,05 моль/л Тт/НС1 буфер, 15 ммоль/л №а№3, рН 7,2, альбумин бычьей сыворотки, массовая доля 1%;
- изотип IgG1;
- идентичность легкой цепи: каппа;
- концентрация общего белка: 14,9 г/л;
- очистка белок А колонка сефарозы;
- чистота: массовая доля приблизительно 95%;
- молекула конъюгата: флюоресцеин изотиоцианат изомер 1 (РГГС);
- (Р/Р)-отношение: Е495 нм/Е278 нм = 1,0± ,1 соответственно молярному отношению РГТС/белок приблизительно 5.
g) обращение и хранение: стабильны в течение трех лет после выделения при температуре от 2 до 80С.
А.5.2. Предназначенное применение
А.5.2.1. Общие положения
Антитело предназначено для применения в проточной цитометрии. Антитело может быть использовано для качественного и количественного обнаружения Т-клеток.
А.5.2.2. Тип (типы) материала
Антитело может быть применено на суспензиях свежих и фиксированных клеток, фиксированных ацетоном срезах криостата, на клеточных мазках.
А.5.2.3. Методика исследования реактивности антитела для проточной цитометрии
Детали методики, использованной изготовителем, следующие.
a) собрать венозную кровь в пробирку, содержащую антикоагулянт.
b) изолировать одноядерные клетки путем центрифугирования на разделительной среде; в ином случае лизировать эритроциты после стадии инкубации, указанной в d).
c) промыть одноядерные клетки дважды с RPMI 1640 или забуференным фосфатом солевым раствором (PBS) (0,1 моль/л фосфата, 0,15 моль/л NaCl, рН 7,4).
d) к 10 мкл конъюгированным FITC моноклональным мышиным античеловеческим Т-клеткам, реагент CD3 добавить суспензию клеток, содержащую 1 x 106 клеток (обычно около 100 мл), и перемешать. Инкубировать в темноте при 4oC в течение 30 мин [для двойного окрашивания в то же время должно быть добавлено антитело, конъюгированное R-фикоэритрином (RPE)].
e) промыть дважды PBS + 2% альбумин бычьей сыворотки; ресуспендировать клетки в соответствующей жидкости для анализа на проточном цитометре.
f) использовать в качестве негативного контроля иное моноклональное антитело, конъюгированное FITC (флюо-ресцеинизотиоцианатом).
g) фиксировать осажденные клетки, перемешивая с 0,3 ml параформальдегида массовая доля 1% в PBS. При хранении в темноте при 4oC фиксированные клетки могут содержаться до двух недель.
h) провести анализ на проточном цитометре. А.5.2.4. Предлагаемое разведение
Антитело должно использоваться для проточной цитоме-трии в концентрированной форме (10 мкл/тест). Для применении на срезах криостата и мазках клеток антитело должно быть смешано с подходящим разбавителем в соотношении объемов (1 + 50) мкл.
А.5.2.5. Ожидаемые результаты
Антитело обнаруживает cD3 молекулу на поверхности Т-клеток. При оценке окрашивания срезов криостатов и мазков клеток продукт реакции должен быть локализован на мембране плазмы.
Окрашивание ткани зависит от обращения и обработки ткани до окрашивания. Неправильная фиксация, замораживание, оттаивание, промывание, высушивание, нагревание, получение срезов или загрязнение другими тканями или жидкостями может вызвать образование артефактов или ложноотрицательные результаты.
ЛИТЕРАТУРА
1. The Colour Index. 3rd ed. Bradford, U.K.: The Society of Dyers and Colourists; 1971.
2. Council Directive of 27th June 1967 on the approximation of laws, regulations and administrative provisionsrelating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances (67/548/EEC).
3. ECCLS: Dye standards, Part II.5: Pararosaniline (CI 42500). His-tochem J. 1992; 24; 233-5.
4. AlSaati T., Clamens S., Cohen-KnafoE., Faye J. C., PratsH., Coin-dre J. M. Production of monoclonal antibodies to human oestrogen receptor protein (ER) using recombinant ER (RER). Int. J. Cancer. 1993; 55: 651-4.
5. Вeverley P. С. L., Callard R. E. Distinctive functional characteristics of human T lymphocytes definedby E rosetting or a monoclonal anti-T cell antibody. Eur. J. Immunol. 1981; 11; 329-34.
6. Campana D., Thompson J. S., Amlot P., Brown S., Janossy G. The cytoplasmic expression of CD3 antigens in normal and malignant cells of the T lymphoid lineage. J. Immunol. 1987l 138; 648-55.
официальные документы
7. EC Commission Directive 1976-07-14 76/907/EEC. Off. J. Eur. Comm. 1996; 360: 1-18; 405-24.
8. EC Commission Directive 1983-07-29 83/467/EEC. Off. J. Eur. Comm. 1983; 257; 1-33.
9. Erber W. N., Pinching A. J., Mason D. Y. Immunocytochemical detection of T cell and B cell populations in routine blood smears. Lancet. 1984; 1042-5.
10. Erber W. N, MynheerL. С, Mason D. Y. APAAP. Labelling of blood and bone-marrow samples forphenotynng leukaemia. Lancet. 1986; 1: 761-5.
11. Hoyer P. E., Lyon H., Jakobsen P., Andersen A. P. Standardized Methyl Green-Pyronin Y procedures using pure dyes. Histochem. J. 1986; 18: 90-4.
12. Jakobsen P., Andersen A. P., Lyon H. Preparation and characteriza-
tion of methyl green tetrafluoroborate. Histochemistry. 1984; 81; 177-9.
13. Jakobsen P., LyonH., TreppendahlS. Spectrophotometry characteristics and assay of pure pyronin Y. Histochemistry. 1984; 81: 99-101.
14. Kumar V., Green S., Stack G., Berry M., Jin J. R., Chambon P. Functional domains of the humanoestrogen receptor. Cell. 1987; 51; 941-51.
15. LalR. B., Edison L. J., ChusedT. M. Fixation and long-term storage of human lymphocytes for surfacemarker analysis by flow cytometry. Cytometry. 1988; 9: 213-9.
16. Swerdlow S. H., Angermeier P. A., Hartman A. L. Intrathymic ontogeny of the T-cell receptor associated CD3 (T3) antigen. Lab. Invest. 1988; 58; 421-7.
Перевод В. В. меньшикова
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ДОКУМЕНТЫ
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ПРиКАЗ от 6 июня 2012 г. № 4н об утверждении номенклатурной классификации медицинских изделий
В соответствии с частью 2 статьи 38 Федерального закона от 21 ноября 2011 г. № 323-ФЗ "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации" (Собрание законодательства Российской Федерации, 2011, № 48, ст. 6724) и Указом Президента Российской Федерации от 21 мая 2012 г. № 636 "О структуре федеральных органов исполнительной власти" ("Российская газета", 2012, № 114) приказываю:
Утвердить:
номенклатурную классификацию медицинских изделий по видам согласно приложению № 1; номенклатурную классификацию медицинских изделий по классам в зависимости от потенциального риска их применения согласно приложению № 2.
министр
в. и. скворцова
Приложение 1 к приказу Министерства здравоохранения Российской Федерации от 6 июня 2012 г. № 4н
номенклатурная классификация медицинских изделий по видам
Номенклатурная классификация медицинских изделий (далее - классификация) по видам содержит числовое обозначение (номер) вида медицинского изделия, наименование вида медицинского изделия, а также девятизначные цифровые коды (AAA ББ ВВ ГГ), используемые для определения видов медицинских изделий.
При классификации на первой позиции располагается числовое обозначение (шестизначный номер) вида медицинского изделия (№), на второй позиции - наименование вида медицинского изделия (Вид), на третьей позиции -трехзначные цифровые коды (AAA 00 00 00) по классификационному признаку "Назначение медицинских изделий"
(табл. 1), на четвертой позиции - двузначные цифровые коды (000 ББ 00 00) по классификационному признаку "Требования стерилизации медицинских изделий" (табл. 2), на пятой позиции - двузначные цифровые коды (000 00 ВВ 00) по классификационному признаку "Технологии применения медицинских изделий" (табл. 3), на шестой позиции - двузначные цифровые коды (000 00 00 ГГ) по классификационному признаку "Области применения медицинских изделий" (табл. 4).
Алгоритм кодирования, применяемый для классификации медицинских изделий по видам, представлен на схеме.
N Вид ААА ББ ВВ ГГ
^-► Области применения медицинских изделий
1-► Технологии применения медицинских изделий
'-► Требования стерилизации медицинских изделий
'-► Назначение медицинских изделий
'-► Наименование вида медицинского изделия
I-► Номер вида медицинского изделия
