CC BY
312
Иммунологические
СО 1999, СПб РО РА АКИ МеШОбЫ
СТАНДАРТИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЯ КЛЕТОК КРОВИ И КОСТНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА
Комитет по здравоохранению Администрации Санкт-Петербурга
Санкт-Петербургское Региональное отделение Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов
Настояище методические рекомендации подготовлены рабочей группой по стандартизации иммунологических методой при Санкт-Петербургском Региональном Отделении Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов, одобрены Лабораторным Советом Комитета по здравоохранению Администрации Санкт-Петербурга. Подробно описаны наиболее часто используемые методы иммунофенотипирования лимфоцитов периферической крови и костного мозга человека. Представлены подробные протоколы методов, обсуждены технические особенности каждого из них.
Председатель:
ТОТОЛЯН Арег Артемович -Главный специалист по клинической иммунологии Комитета по здравоохранению Администрации Санкт-Петербурга, д.м.н.
Члены группы:
БАЛДУЕВА Ирина Александровна -Заведующая лабораторией иммунологии Клинического Центра передовых медицинских технологий, К.М.Н.
БУБНОВА Людмила Николаевна -Руководитель лаборатории иммуногематологии Российского НИИ гематологии и трансфузиоло-гии, д.м.н.
ЗАКРЕВСКАЯ Анна Васильевна -Заведующая лабораторией иммунологии Городской больницы №4, к.м.н.
ЗУЕВА Екатерина Евгеньевна -Научный сотрудник лаборатории иммунологии СПбГМУ им.акад.И.И.Павлова, к.м.н. КАЛИНИНА Наталья Михайловна -Заведующая лабораторией клинической иммунологии ВЦЭРМ, д.м.н.
ЛИСИЦИНА Зоя Николаевна -Заведующая лабораторией иммунологии
и диагностики СПИД, к.м.н.
Комитет по .\чр*впохранении> Адмшіистрмцші Смикт-Псгсрбургн Слкігг-ІІстсрбурі скис Реї иоиАлыю* О' /і&ієни* Российской Ассоциации Аллергологов « Клинических Иммунологов
<<УТВ>:К>КДА10»
Стандартизация методов иммунофсттотипировлпия клеток крови 1-т костного мозга человека
МеТ0ЛИ'1«КНе рско.чпщлипи
«СОГЛАСОВАНО»
І Ірсдс-еадтедт, Сгикі>Піггвр6урісі.оісі
регионального отделения Российской Лшшмцип Лллсртлошв н Ктшичйашх Ныыуисыш Ои, член-корр РАМН, профессор, Л
И.С.ФРЕЙДЛИІІ
1999г.
«СОГЛАСОВАНО»
Г.'ШІШШЙ специалист ПП КЛИНИЧЕСКОЙ дабО|ШОриОЙ циішнхшкє Комитет ПП здрлпоохрйнеійііо ЛдЬОШИС-фіЩИи Синкг-І Іотср^урга. профессор, Д.М.ІІ.
В.Я.ЭМАИУЭЛЬ «Л?» їаРЇ/Л__________і999і.
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ...................................."
1. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЙ ЭТАП...................23
1.1. Подготовка больного:................23
1.2. Оборудование, лабораторные
принадлежности и реагенты............24
1.3. Получение периферической крови......24
1.4. Получение костного мозга............24
1.5. Транспортировка и поступление
биоматериала в лабораторию...........24
1.5.1. Бланк направления
биологического материала.............25
1.5.2. Противопоказания для приема
материала в лабораторию..............25
1.6. Выделение фракции мононуклеаров....25
1.6.1. Список реагентов в расчете
на одного больного...................25
1.6.2. Протокол метода.....................25
1.6.3. Карта самоконтроля проведения
этапа выделения мононуклеаров........26
2. МЕТОД НЕПРЯМОЙ
ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ........................26
2.1. Принцип метода......................26
2.2. Оборудование, лабораторные
принадлежности и реагенты............27
2.2.1. Подготовка кроличьей сыворотки......27
2.2.2. Подготовка ЗФФР.....................27
2.2.3. Подготовка антител..................27
2.2.4. Подготовка поли-Ь-лизина............28
2.2.5. Подготовка глицерина................28
2.2.6. Подготовка предметных стекол........28
2.2.7. Приготовление влажной камеры........28
2.3. Протокол метода.....................28
2.4. Оценка результатов..................28
2.5. Типичные ошибки и способы их
устранения...........................29
3. МЕТОД ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ.... 29
3.1. Принцип метода......................29
3.2. Оборудование, лабораторные
принадлежности и реагенты............29
3.3. Протокол анализа....................29
3.4. Учет результатов....................29
4. ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД
(СТРЕПТАВИДИН-БИОТИНОВЫЙ)..................30
4.1. Принцип метода......................30
4.2. Оборудование, расходные материалы
и реагенты...........................30
4.3. Подготовительный этап...............31
4.3.1. Поли-Ь-лизин........................31
4.3.2. Предметные стекла...................31
4.3.3. Покровные стекла....................31
4.3.4. Буфер...............................31
4.3.4.1 Трис-буфер...........................31
4.3.4.2 TBST.................................31
4.3.4.3 PBS..................................31
4.3.5. Определение рабочего разведения
антител...............................31
4.3.6. Хромогены............................33
4.3.6.1.ДА Б.................................33
4.3.6.2. АЭК...............................33
4.3.7. Водорастворимая среда
для заключения препаратов.............34
4.4. Ход реакции..........................34
4.4.1. Этап нанесения клеток
на предметные стекла..................34
4.4.2. Этап выявления специфических антигенов на поверхностной
мембране клеток.......................34
4.4.3. Карта самоконтроля
выполнения протокола..................35
4.5. Учет результатов.....................35
4.6. Типичные ошибки и способы их
устранения............................35
5. МИКРОЛИМФОЦИТОТОКСИЧЕСКИЙ ТЕСТ
5.1. Принцип метода.......................35
5.2. Оборудование, расходные материалы
и реагенты............................35
5.3. Подготовительный этап................38
5.4. Протокол анализа.....................38
5.5. Ограничения метода...................38
6. ЗНАЧЕНИЯ НОРМЫ............................38
6.1. Периферическая кровь (взрослые)......39
6.2. Периферическая кровь (дети)..........39
6.3. Периферическая кровь
(дети раннего возраста - до 1,5 лет).39
6.4. Костный мозг (взрослые)..............39
G.5. Костный мозг (дети)..................39
ВНЕШНИЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА....................39
ПРИЛОЖЕНИЯ...................................39
Приложение 1: подготовка пробирок............39
Приложение 2: градиент плотности
для выделения мононуклеаров..................40
Приложение 3: подготовка растворов для определения жизнеспособности клеток
с помощью суправитальных красителей..........40
Приложение 4: перечень оборудования..........41
Приложение 5: перечень лабораторных
принадлежностей..............................41
Приложение 6: перечень реагентов.............42
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................42
ВВВДЕНИЕ
В настоящее время иммунологические анализы являются неотъемлемой частыо лабораторного диагностического процесса. Одним из ключевых направлений работы иммунологической лаборатории является иммунофеноти-нирование лимфоцитов. Известно, что большинство им-мупокомпетентных клеток, и прежде всего лимфоциты, несут на своей мембране поверхностные маркеры - кластеры дифференцировки (CD - Cluster of Differentiation), отражающие фенотип меток. В зависимости от задач иммунологического обследования, его объем может и должен существенно различаться. Так, для оценки иммунного статуса необходимо определять популяции и субпопуляции лимфоцитов в объеме, представленном в табл. 1. Таблица 1. ПАНЕЛЬ ОСНОВНЫХ МАРКЕРОВ CD ДЛЯ ОЦЕНКИ ИММУННОГО СТАТУСА
Для тонирования лимфопролиферативных заболеваний необходимо проводить обследование в расширенном объеме, представленном в табл. 2.
В основе иммунофеиогииирования лежит использование различных методов визуализации реакции антиген-антитело. Разнообразие современных методических подходов позволяет иммунологической лаборатории выбрать метод иммунофенотипирования в соответствии с:
• материально-технической базой;
• типом анализируемого материала;
• характером патологии;
• необходимой степенью чувствительности анализа;
• планируемым количеством соотвегсгв. анализов. Основные методы иммунофенотипирования в настоящее
время следующие:
• Проточная цитометрия
• Иммуиофлгаоресценптый метод
• Иммуноцигохимический метод
• Лимфоцитотоксический метод
1. ГВДШБШЕЛЬНЫЙ ЭТАП
1.1. Псщлдаа больного:
• Получение крови выполняет процедурная медицинская сестра с соблюдением правил асептики и анти-
Таблица 2. ПАНЕЛЬ ОСНОВНЫХ КЛЕТОЧНЫХ МАРКЕРОВ CD ДЛЯ ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЯ ОСТРОГО ЛЕЙКОЗА
CD маркер Популяция бластных клеток
CD1a Кортикальные тимоциты, гистиоциты
CD3 Т-клетки
CD4 Т-клетки
CD5 Т-клетки, субпопуляция В-клеток
CD7 Т-клетки, ранние миелоидные клетки
CD8 Т-клетки
CD10 Субпопуляция В-клеток, субпопуляция кортикальных тимоцитов, субпопуляция ранних миелондных клеток (САНА - общий антиген острого лимфобластного лейкоза)
CD13 Миелоидные клетки
CD14 Моноцитарные клетки
CD15 Миелоидные клетки
CD19 В-клетки
CD20 В-клетки
CD22 В-клетки
CD33 Миелоидные клетки
CD34 Гемопоэтические клетки-предшественники (вовлечены в миелоидную и лимфоидную пролиферации)
CD41a Мегакариоциты
CD45 Общелейкоцитарный маркер
CD61 Мегакариоциты
CD79a В-клетки
Cylg Цитоплазматический маркер/ иммуноглобулин, преВ-клетки
Sig Поверхностный иммуноглобулин, В-клетки
HLA-DR В-клетки, ранние миелоидные клетки, моноцитарные клетки, активированные Т-клетки
Glyphorin A Ранние эритроидные клетки
TdT Маркер клеточного яда нормальных предшественников Т иВ-клеток (вовлечен в миелоцциую и лимфоидную пролиферацию)
септики. Допустимо наложение больного лежа и сидя.
• Получение костного мозга является врачебной процедурой и проводится подготовленным специалистом.
• Для иммунологического исследования кровь необходимо брать натощак от 8 до 10 часов утра.
• Обязательно проводить клинический анализ крови в день направления материала для иммунологического исследования.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: При работе с периферической кровью соблюдать все меры предосторожности, не-
CD маркер Популяция клеток
CD3 Т-лимфоциты
CD4 Т-хелперы
О о со Цитотоксические Т-лимфоциты
CD19 В-лимфоциты
CD20 В-лимфоциты
CD16 Естественные киллеры, некоторые лимфоциты
CD56 Естественные киллеры
CD25 Нерастворимый рецептор И-2; “ранний” маркер активации
HLA-Dr В-лимфоциты, моноциты, активированные Т- лимфоциты
1.2. Оборудование, лабораторные принадлежности и реагенты
Лабораторные принадлежности и оборудование Реагенты
• Центрифужные пробирки объемом 10мл (вариант А) или системы для забора крови типа “Вакутайнер" (вариант Б) (приложение 1) • Пробки резиновые № 14,5 для герметизации стеклянных пробирок • Микропробирки объемом 1,5 мл • Наконечники для пипеточных дозаторов (до 200 мкл, 200-1000 мкл, 1000-5000 мкл) • Камера Горяева • Спиртовка • Дозаторы одноканальные пипеточные автоматические для объема 0,5-20 мкл, 200 мкл, 1000 мкл, 5000 мкл • Холодильник бытовой(+4'С) • Микроскоп световой типа Биолам • Центрифуга рефрижераторная с ротором-крестовиной (приложение о возможности пересчета об/мин на д -номограмма для расчета центробежного ускорения см. т.1, стр.92 Медтехнологии под ред.Карпищенко) • Штатив для центрифужных пробирок • Штатив для микропробирок • Контейнер для транспортировки пробирок с биоматериалом • Гепарин или ЭДТА • Силикон (при работе со стеклянными пробирками) • Спирт 70'(для хранения пробок при работе со стеклянными пробирками). • Градиент плотности (плотность 1.077 г/л), готовый к использованию, или реагенты для его приготовления (приложение 2) • Трипановый синий (растворы А и Б) или динатриевая соль эозина (приложение 3) • Раствор Хенкса • Фосфатно-солевой буфер (ФСБ)
обходимые при работе с потенциально инфицированным материалом. Все растворы и оборудование, которые контактируют с клетками, должны быть использованы с теми же мерами предосторожности.
1.3. Получение периферической крови
Взятие крови производится ИЗ Л01СГСВ0Й ВС11Ы путем венопункции. Кровь для исследования в количестве 5 мл поместить в стерильную пробирку с предварительно внесенным антикоагулянтом в соответствии с Приложением 1 (вариант А). Могут быть также использованы системы для забора крови типа “Вакутайнер" (вариант Б). Пробирку необходимо:
• тщательно закрыть;
• отмаркировать (ФИО больного, дата взятия крови);
• вращательным движением вокруг горизонтальной оси перемешать содержимое пробирки гак, чтобы избежать образования сгустка;
• поместить в транспортный контеш юр вместе с I «травлением на исследование.
1.4. Получение костного мозга
Получение костного мозга является врачебной процедурой и проводится подготовленным специалистом в условиях стационара. Костный мозг для исследования в
количестве 3 мл поместить в стерильную пробирку с предварительно внесенным антикоагулянтом в соответствии с Приложением 1 (вариант А). Пробирку необходимо:
• тщательно закрыть;
• отмаркировать (ФИО больного, дата взятия костного мозга);
• вращательным движением вокруг горизонтальной оси перемешан, содержимое пробирки так, чтобы избежать образования сгустка;
• і юместить в транспортный контеш іер вместе с направлением на исследование.
1.5. Транспортировка и поступление биоматериала в лабораторию
• Материал (кровь, костный мозг) должен быть доставлен в лабораторию не позднее 2 часов после его получения.
• Недопустимо замораживание биологического материала.
• Биологический материал можно транспортировать только в специальных маркированных небыощихся контейнерах.
• Сопроводители іая докумеї ггация должна быть в упаковке, исключающей возможность ее контаминации кровыо.
1999, Т.1,Я°5
1.5.1. Бланк направления
биологического материала
Учреждение
ФИО
Возраст пол
Отделение палата
История болезни №
Вид материала
СО маркеры
Дща забора материала
на исследование
ФИО лечащего врача подпись
1.5.2. Противопоказания для приема материала в лабораторию
Материал не может быть принят лабораторией б случае:
• отсутствия маркировки на пробирке;
• отсутствия направления;
• при наличии сгустка;
• при использовании иных емкостей, пе предусмотренных пп.1.3 настоящих рекомендаций;
• при несоблюдении С1ХЖОВ ДОС11ШКИ.
Материал может быть принят в лабораторию условно с обязательным указанием в регистрационном журнале и бланке ответа следующих недостатков:
• Частичный гемолиз;
• Недостаточный объем материала;
• Нарушение правил транспортировки материала
1.6. Ввделение фракции мононуклеаров
Принцип метода
Периферическая кровь является основным источником лимфоидных клегок, используемых для изучения иммунной системы человека. Метод основан па различии флотирующих свойств форменных элементов крови. Применение градиента определенной плотности позволяет быстро и просто отделить мопопуклеары (лимфоциты, моноциты, властные клетки) от эритроцитов и гранулоцитов. Более легкие мопопуклеары располагаются над градиентом плотности в виде беловатого полупрозрачного кольца интерференции, а более тяжелые эритроциты и гранулоциты оседают па дно пробирки (рис.1).
Тромбоциты могут быть удалены последовательными отмывками.
1.6.1. Список реагентов в расчете на одного больного.
Реагент Расход на 1 больного Примечание
Грэдиекг плотности 1,5 мл Плотность 1,077г/л
Раствор Хэнкса 50 мл Бесцветный
Уксусная кислота 3% 400 мкл Подкрашена метиленовым синим
Фосфапю-солевой буфер 5мл 50 мМ, pH 7,2-7,4
Трипановый Раствор А 10мкл Растворы соеданитъ
синий РастворБ40ш1 перед использованием
В тех случаях, когда кровь поступает в лабораторию в нестандартной емкости, необходимо перенести ее в центрифужную пробирку. Необходимый объем крови 5 мл, костного мозга - 3 мл.
1.6.2. Протокол метода
1. В настоящее время можно рекомендовать два варианта подготовки крови перед наслаиванием ее на градиент плотности:
А) работа с цельной кровыо:
Собранную в пробирки кровь развести равным об'1>е-мом ФСБ (pH 7,2).
Б) работа с лейковзвссыо включает в себя последовательное выполнение следующих действий:
• Поместить пробирку с кровыо па 30 мин в термостат 37°С для предварительного оседания эритроцитов.
• Собрать лейковзвесь, пе затрагивая осевшие эритроциты. Перенести полученную лейковзвееь о чистую пробирку.
• Удаление тромбоцитов осуществляется центрифугированием полученной лейковзвеси в течение 10 мин при ЗООй (1000 об/мин). Над осадочная жидкость, содержащая тромбоциты, аккуратно удаляется.
• Оставшиеся па дне пробирки в виде осадка лейкоциты развести раствором Хепкса до объема 2 мл и тщательно ресуснепдировать.
Затем выделение клеток проводится но единому протоколу:
1. Осторожно наслоить полученную взвесь клегок па 1,5-2,0 мл рабочего раствора градиента шюпюсти(1,077г/ л) и центрифугировать 30 мин при 400§ (1500 об/мин) при температуре 18-22 °С. Использовать центрифугу с плавной остановкой ротора для избежания потери клеток. Не следует пользоваться тормозом (рис.1).
Ругс.1 . Разделение компонентов крови на градиенте плотности 1,077 г/л (распределение клеток после центрифугирования)
2. Удалить прозрачный слой среды, расположенный непосредственно над опалесцирующим слоем мононук-леаров. Затем но плонвди сечения пробирки па границе раздела фаз собрата слой мопопуклеаров, перенести в другую центрифужную пробирку и развести в 3-5 раз раствором Хэнкса. Тщательно ресус-пепдировать.
3. Центрифугировать 10 мин при ЗООй (1000об/мин).
4. Аккуратно, не перемешивая, удалить над осадочную жидкость, оставляя не больше 1 мл жидкости над осадком.
5. Развести клеточную взвесь в 3-5 раз раствором Хэнкса и центрифугировать 10 мин при 300g (ЮООоб/ мин) (повторить этап 4).
6. Аккуратно удалить максимально возможное количество падосадочной жидкости. Тщательно ресусиеп-дировать полученные клетки в оставшемся объеме жидкости и произвести определение концентрации клеток в световом микроскопе в камере Горяева Для этого внести в микропробирку 400мкл 3% водного раствора уксусной кислоты и 20мкл суспензии мо-нопуклеаров (т.е. в соотношении 20:1). Тщательно ресуспепдировать полученную взвесь. Считать количество мопопуклеаров в 25 больших квадратах. Умножить полученное число па 50. В результате будет получено количество клеток в 1x10 °/ мл. Например, в 25 квадратах подсчитано 20 клеток. 20x50=1000, что соответствует 1х109/л.
7. Провести определение жизнеспособности клеток методом отторжения красителя, при котором краситель (например, трипановый синий, эозин У) не проникает сквозь мембраны живых клеток (Приложе-
ние 3). Для выполнения последующих этапов имму-нофенотинирования необходимо, чтобы в суспензии было не менее 95% живых клеток.
8. Оптимальным является содержание клеток в суспензии в пределах 0,8-1,5х106/мл. При недостаточной концентрации клеток необходимо провести дополнительное центрифугирование , убрать надоса-док и снова провести подсчет клеток При содержании клеток больше 1,5х10б/мл необходимо развести суспензию раствором Хэнкса до рабочей концентрации.
1.6.3. Карш самоконтроля проведения этапа выделения мононуклеаров
N п/п Последовательность выполнения Длительность (мин) Время выполнения
начало окончание
1. Маркировка пробирок
2. Инкубация при 37*С 30
3. Центрифугирование 1000об/мин 10
4. Ресуспензироеание осадка 2
5. Центрифугирование 1500об/мин 30
6. Ресуспендирование осадка 1
7. Центрифугирование 1000об/мин 10
8. Ресуспенцирование осадка 1
9. Центрифугирование 1000об/мин 10
10. Ресуспендирование осадка 1
11. Подчет концентрации клеток в полученной суспензии (камера Горяева 10
12. Определение содержания жизнеспособных клеток 5
2. МЕТОД НЕПРЯМОЙ ИММУН0ФЛЮ0РВДН141И
2.1. Принцип метода
Непрямая иммупофлюоресценция - метод, основанный на использовании специфичности иммунологической реакции антиген-антитело и чувствительности флго-
оресцентной микроскопии. При применении этого мето- б) да суспензию живых клеток вначале обрабатывают антителами, специфическими к выявляемому антигену, а затем - шггителами, соединенными с флюороохромом и и) направленными против специфических антител. Оценка результатов произвол!ггся по специфическому свечению клеток в люминесцентном микроскопе.
приготовить раствор № 2: КИ РО • 2Н О - 13,6 г на 1 л бидистил.воды
приготопиті. концентрированный (}юсфатно-солегюи бу<1>ер, pH 7,2-7,4:
02 л раствора №2 постепенно прилить в 0,4 л раствора №1, измерить pH и с помощью раствора №1 довести pH
2.2. Оборудование, лабораторные принадлежности и реагенты
Лабораторные принадлежности и оборудование Реагенты
• центрифуга типа “ЕррепсіогГ • моноклональные антитела необходимой специфичности
• термостат ТС-80М-2 (+37°С) • вторичные антитела, конъюгированные с флюорохромом
• термостат ТС-80М-2 (+56°С) • нормальная кроличья сыворотка
• холодильник бытовой (+4°С) • калий фосфорнокислый однозамещенный сухой
• морозильная камера (-20°С) • натрий фосфорнокислый двузамещенный сухой
• люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ Р-8 или ЛЮМАМ • раствор натрия хлорида 0,9% для инъекций
то-11 • азид натрия
• счетчик форменных элементов крови • глицерин
• автоматическая пипетка с переменным объемом от 0,5-10 - смесь Никифорова (1 часть 96°С и 1 часть эфира для
мкл, 10-1000 мкл наркоза)
• наконечники 0,5-10 мкл, 5-300 мкл, 100-1000 мкл
• микропробирки конические 1,5 мл из полипропилена
• микропробирки 1,5 мл термостойкие для хранения
фасованных реагентов при -20°С
• контейнер ы для хранения фасованных реагентов
• штативы для микропробирок
• чашки Петри Ж 100мм
• мерный цилиндр
• стеклянный стакан на 50 мл
• стекло предметное (76x26x1,5-2,0 мм)
• парафилм“М”
• спиртовка
• ножницы канцелярские
• дырокол канцелярский
• лабораторные маркеры (набор из 5 цветов)
2.2.1. Подготовка кроличьей сыворотки
Нормальную кроличью сыворотку (пул сывороток от 20 здоровых кроликов) инактивировать в течение 30 мин при 56°С, развести бидистиллированной или деионизированной водой в соотношении 1:10 (1 часть сыворотки и 9 частей воды), расфасовать по 0,5-1 мл в микропробирки, хранить замороженной (-20иС) до использования.
2.2.2. Подготовка ЗФФР
1.Фосфатно-забуферениый физиологический раствор (ЗФФР) ОД М pH 7,2-7,4 а) приготовить раствор № 1:
№ НРО • 12Н О - 35,8 г на 1 л бидистиллированной
2 4 2
вода
Соль перед употреблением должна быть высушена в течение не менее 24 часов при 37°С.
до 7,2-7,4 и добавить азид натрия (конечная концентрация 0,01%), хранить при +4°С до использования; г) приготовить ЗФФР: взять 100 мл концентрированного фосфатно-солевого буфера и добавить 900 мл раствора натрия хлорида 0,9% для инъекций (использовать в течение 1-2 дней).
2.2.3. Подготовка антител
Моноклональные антитела определенной специфичности и связывающие антитела, конъюгированные с флюорохромом, перед использованием титровать, хранить при +4°С и каждый официналыгый раствор антител использовать в оптимальной рабочей концентрации. Процедура титрования: Для каждой новой серии специфических и флюороохромированных антител необходимо подбирать оптимальную рабочую концентра-
цшо. Для этого клетки, заведомо способные окраши-наться дгишыми антителами, обработать расгворами антител разной концентрации (ступенчатое разведе-ние раствора антител в диапазоне, указанном фир-мой-изготовителем). Оптимальная концентрация антител - это наименьшая концентрация, при которой позитивные клетки имеют интенсивное специфическое окрашивание. Эту концентрацию принимают за рабочий титр антител. При несоблюдении этих условий часто можно наблюдать неспецифическое окрашивание клеток.
2.2.4. Перловка поли-Ьлизина
Г1оли-Ь-лнзнп перед использованием титровать (в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя). Рабочий раствор расфасовать в микропробирки и хранить при -20"Сдо использования. Повторное замораживание не допускается.
2.2.5. Подготовка глииррина
30% глицерин готовить из официпалыюго раствора глицерина и ЗФФР: 30 мл глицерина и 70 мл ЗФФР. Хранить при +4'’С до использования.
2.2.6. Подготовка предметных стекол
Предметные стекла поместить в смесь Никифорова па 2 часа Парафильм с бумажной основой нарезать прямоугольниками 74x24 мм, сложить их вместе по 4 и дыроколом пробить 8 отверстий таким образом, чтобы между отверстиями было не менее 3 мм. Каждый такой прямоугольник освободить от бумажной основы и, слепа натягивая, наложить па чистое предметное стекло. Парафильм на предметом стекле нагреть на/1 пламенем спиртовки так, чтобы при его расплавлении не образовывались пузыри.
Стекла с парафильмом (каждое отдельно) хранить в алюминиевой фольге при комнатной температуре до использования.
2.2.7. Приготовление влажной камеры
Влажная камера состоит из чашки Петри, в которую помещают фильтровальную бумшу, смоченную бидис-тиллированной водой, и “рельсы” для предметного стекла
2.3. Протокол метода
1. Зарегистри1Х)вать перечень выявляемых маркеров для каждого пациента реакций в рабочий журнал, включая положительный и отрицательный контроль. Промаркировать микропробирки.
2, Внести 25 мкл суспензии моноиуклеаров (Зх10с/мл) в конические микропробирки.
3. Добавить 10 мкл раствора инактивированной кроличьей сыворотки, ресуспепдировать клеточную взвесь.
4. Инкубировать при 18 - 20"С в течение 20 мин.
5. Внести специфические антитела в рабочей концентрации в соответствии с маркировкой, ресуспепдировать клеточную взвесь.
6. Инкубировать при 4“С в течение 30 мин.
7. Отмыть в ЗФФР (центрифугировать при 400 g в течение 5 мин).
8. Повторить этан 3.
9. Инкубировать при 4"С в течение 5 мин.
10. Подготовить предметное стекло с парафильмом ех tempore:
• внести 20 мкл ноли-Ь-лиэип в лупки из парафильма;
• инкубировать стекло при 37ПС в течение 30 мин;
• удалить остатки поли-Ь-лизипа и поместить стекло в стаканчик с ЗФФР до использования (не допускать высыхания).
11. Внести 20 мкл связывающих антител, соединенных с флюорохромом, рес.уснепдировать клеточную гавесь.
12. Инкубировать при 4°С в течение 30 мин.
13. Отмыть в ЗФФР 2 раза (центрифугировать при 400 g по 5 мин).
14. Внести 20 мкл 30% глицерина, тщательно перемешать взвесь клеток с глицерином.
15. Перенести взвесь клеток во влажные лунки предметного стекла.
16. Инкубировать клепки на стекле во влажной камере при 4"С 30 мин.
17. Хранить препараты во влажной камере при 4"С. Допускается хранение препаратов до 6 дней.
2.4. Оценка результатов
1. Считать не менее 200 клеток, сопоставляя фазово-контрастную (световую) и флюоресцентную картину каждого поля зрения, определяя количество клеток, содержащих специфическую с]инооресце1ггиую мелку:
Следует соблюдать следующий порядок в оценке результатов:
• Просмотреть и подсчитать клетки в отрицательном и положительном контроле. В положительном контроле все клетки должны экспрессировать общелейко-цитарпый маркер CD45. В отрицательном контроле (IgG[ мыши) положительных клеток не должно быть. В случае обнаружения положительных клеток в отрицательном контроле необходимо устранить неспецифическое связывание (в соответствии с п.3.5).
• При световой микроскопии подсчитать 200 лимфоцитов и среди них, при флюоресцентной микроскопии,* определить количество клеток, экспрессирующих соответствующие ш ттигепы (см. табл. 1 и 2). Производить подсчет только лимфоцитов, моноциты не учитывать.
2. Записать результаты в рабочий журнал.
2.5. Типичные ошибки и споообы их устранения
Проблема Способ устранения
Сильная 1. Использовать более высокие
фоновая разведения специфических
флюоресценция или связанных с флюорохромом
антител.
2. Осадить свободный
флюоресцеинизоцианат при
центрифугировании 400 д.
3. МЕТОД ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ
3.1. Принцип метода
Метод основан на использовании моноклональных антител, конъюгированных (прямой метод) или не конъюгированных с флюоресцентной меткой (непрямой метод). При использовании некоп'ыогированпых антител применяются связывающие антимышиные поликлональные антитела, меченные флюоресцентной меткой. В качестве флюоресцеипоиых красителей используются флюоресципизотиоциапат (ФИТЦ), который дает зеленое окрашивание или R-фикоарнтрнн (ФЭ), который дает краспо-орапжевое окрашивание. Учет результатов проводится с помощью проточного цитофлюориметра. Принцип его работы заключается в следующем: суспензия предварительно окрашенных клеток под давлением впрыскивается в центр быстро движущегося в том же направлении потока жидкости, в результате чего скорость движения клеток резко возрастает и они выстраиваются, образуя столбик, окруженный оболочечпой жидкостью. Благодаря приему гидродинамической фокусировки создаю тся условия ламинарного потока без перемешивания суспензии клеток с обтекающей жидкостью. Попадая в измерительную камеру прибора, клетки возбуждаются светом определенной длины волны, идущим от аргонового лазера или ртутпо-квар-цевой лампы, и посылают световые сигналы другой длины волны, которые проходя через систему оптических линз, фильтров, двухцнетовых зеркал, регистрируются фотоэлектронным умножителем, преобразующим эти световые сигналы в электрические, которые обрабатываются компьютером и выдаются как характеристики клеток в виде гистограмм. При этом в случае одномерной гистограммы па оси абсцисс откладывается интенсивность флюоресценции клеток, а по оси ординат - число клеток с определенной интенсивностью флюоресценции.
Ниже в качестве примера приведен порядок работы на проточном цитофлюориметре EPICS XL (Coulter Corp., USA) методом непрямой иммупофлюоресценции.
3.2. Оборудование, лабораторные принадлежности и реагенты
Лабораторные принадлежности Реагенты
и оборудование
• дозаторы пипеточные • моноклональные
одноканальные для антитела необходимой
объемов 20 мкл и 1000 мкл; специфичности
• центрифуга лабораторная • связывающие антитела,
рефрижераторная конъюгированные с
• камера Горяева флюорохромом
• проточный цитометр • фосфатно-солевой
EPICS XL (Coulter Corp., USA) буфер(ФСБ)
• пробирки “Coulter” • параформальдегида 2%
• наконечники для раствор
дозаторов для объема 0,5-
200 и 200-1 ОООмкл
3.3. Протокол анализа
1. Внести 100 мкл суспензии лим()юцитов в предварительно маркированные пробирки (согласно исследуемому спектру поверхностных маркеров и контрольную).
2. Добавить во все пробирки, за исключением контрольной, 20 мкл антител.
3. Инкубировать все пробы 30 мин при t=+20°C
4. Добавить 2 мл раствора ФСБ и центрііфушровагь 10 минут при 400g.
5. Ресуспеидпровать осадок и добавить в каждую пробирку 20 мкл связывающих антител, конъюгированных с флюорохромом (IgGl мыши).
6. Инкубировать в темноте при температуре +4°С 30 мни.
7. Добавить 2 мл раствора ФСБ и центрифугировать 10 минут при 400&Повторить этот этап для тога, чтобы удалить все несвязанные меченные антитела.
8. Ресуспепдировать осадок в 300 мкл раствора ФСБ.
Если анализ не проводится непосредственно после приготовления проб, использовать для ресуснеп-дировапия 2% раствор иараформальдегида (Sigma, кат.№ Р6148), при этом пробы можно хранить при температуре +4°С не более 7 дней.
9. Провести учет результатов па проточном цитометре EPICS XL (Coulter Corp., USA).
10. При анализе контрольной пробы интенсивность напряжения установить таким образом, чтобы процент песпе-цифичеосого связывания лимфоцитов с флюорохромом пе превышал 1,5%, 41X3 составляет погрешность метода
3.4. Учет результатов
Учет результатов осуществляется па основании анализа 10000 лимфоцитов. При этом результат выражается в процентах клеток, несущих данный антиген. Полученные д анные qxmmimiar с известными для каждого параметра пор-мііми. Одновременно с взятием крови из вены следует бршъ
кртвь для I юдсчета формулы и количества лейкоцитов, чтобы иметь возможность определить абсолютные зиачешш общею числа лпм^хмцгшь и их отдельных субпопуляцнй.
Ответ не может быть получен при отсутствии негативного контроля или певозможносш выставления но нему сигнала песпецифического связывания.
4. ИММУНОЦИГОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД ((ЖГТГАВЦДИН-БИОТИНОВЬ1Й)
4.1. Принцип метода
Метод основан на использовании высокой аффинности авидина но отношению к биотипу. Образцы последовательно инкубируют:
• с мопоююнальными антителами (мьшшпымишп! кроличьими) определен) юй специфичности к определенным клеточным антигенам;
• с биотшшлированпыми снязьшающими антителами к мышиным или кроличьим иммуноглобулинам;
• со стрентавидипом, конъюгированным с пероксидазой.
Основные требования к специфическим антителам:
• высокое сродство с антигенами.
• высокая аввдность.
• возможность использования высоких разведений.
Для больна и 1стш мси юкли илы «>1х я тлел досгапоч! ю 10 мипупюй инкубации. Рабочее разведение моноклональных антител 1кддб( п^легся каждой лабораторией в зависимости стг решаемых задач и качества реши пт Необходимо использовать максимально возможное разведение, -гак как зга аниосг шггепсииность песпецифического фонового окршшшания.
Для каждой повой серии специфических и связывающих и /или антител с меткой необходимо подбирать гагги-мальпую рабочую конца працию. Оптимальная копцешра-ция антител - это наименьшая кошдетрацня, при которой ИООИТИВИЫе клсггки еще имеют интенсивное специфическое окрашивание. сЬу гам щетрацию принимают за рабочий тшр антител. Несоблюдение этих условий может приводить к неспецифическому окрашиванию клеток.
Иммупоцитохимический мегад выявления маркеров дифферепцировки на поверхностной мембране мононукле-аров периферической крови требует обязательного применения положительного и трицателы юга когпролей. Спи 1-дартым положительным контролем яшшета С045, а отрицательным контролем - ^01 донора специфических антител (мыши) или, в крайнем случае, жидкость для ^ведения антител. Для контроля качества постановки реакции для некоторых видов специфических антнгел разработаны отрицательные контроля Ы-серии.
Мы рекомендуем использовать реагенты фирмы
О А КО в связи с тем, что их применение обеспечивает наиболее стабильные результаты в данном протоколе. Принципиально мо[уг быть использованы лицензированные реагенты других фирм-производителей.
4.2. Оборудование, расходные материалы и реагенты
Оборудование Расходный материал
• Автоматическая пипетка с • Предметные
переменным объемом от 0,5-10 стекла толщиной
мкл, 10-1000 мкл 1 мм
• наконечники 0,5-10 мкл, 5-300 • Покровные
мкл, 100-1000 мкл стекла 18x18 или
• Влажная камера 24x24 мм
• Термостат 37°С ■ Камеры
• Термостат 56"С Терасаки (или
• Планшеты для предметных алюминиевая
стекол фольга)
• Гистологические стаканчики или • Парафилм (или
другие емкости для отмывок алмазный, или
• Мерный цилиндр парафиновый
• Весы лабораторные карандаши)
• Микроскоп световой
• Счетчик гематологический
клавишный
• Дырокол канцелярский
• Ножницы канцелярские
• Вытяжной шкаф
• Морозильная камера (-20‘С)
• Бытовой холодильник (+4’С)
Список основных реагентов для проведения стрепта-впдпп-биотиповым методом иммунофепотипировапия по 7 различным антигенам в расчете на одного пациента
Реагент Расход на 1 пациента Примечание
Моноклональные антитела определенной специфичности 20мкл Рабочее разведение
Раствор для разведения МКАТ 25 мкл х количество определяемых маркеров Готов к использованию
Связывающие антитела 25 мкл х количество определяемых маркеров Готовы к использованию
Стрептавидин, соединенный с пероксидазой 25 мкл х количество определяемых маркеров Готов к использованию
Хромоген 30 мкл х количество определяемых маркеро! Готовить за 15 мин до использования
Ацетон 15 мл Холодный(+4°С)
Буфер 200 мл Готовить перед использованием
Бидистиллирован-ная вода 20 мл 18-20°С
Метиленовый 200мкл Заливать в
зеленый избытке
Глицергель 30 мкл Перед использованием нагреть до 56°С
Дополнительные реагенты: изопропиловый спирт (чда), смесь Никис]>орова, поли-Ь-лизип, бус|х'р
4.3. Подготшттвльный этап
4.3.1. Поли-Ьлизин
Поли-Ь-лизин (Poly-L-Iysin) (ПЛ) используется в виде раствора рабочей концентрации.
Приготовление koi mei при|юваппого раствора для д лительного хранения:
1 мг поли-Ь-лизина развести в 10 мл раствора Хэнкса. Хранить при -20°С.
Приготовление рабочего раствора для нанесения па предметные стекла:
концентрированный раствор развести бидисгиллиро-ваппой водой в соотношении 1:20. Хранить при +4°С.
4.3.2. Предиетные стекла
Чистые предметные стекла хранить в изопропиловом спирте. Перед работой стекла высушить и поместить в смесь Никифорова не менее, чем на два часа. Подготовить лупки на предметных стеклах (рис.2), что можно сделать несколькими способами.
Способ А. Нарезать парафильм прямоугольниками размером несколько меньше предметного стекла. Сложить вместе 4-8 таких прямоугольников и пробить по 4 отверстия (с помощью дырокола) таким образом, чтобы между отверстиями было ие менее 3 мм. Каждый такой прямоугольник освободить от бумажной основы и, слегка натягивая, наложить на чистое предметное стекло. Парафильм па предметном стекле нагреть над пламенем спиртовки так, чтобы при его расплавлении не образовалось пузырей. Способ Б. Нарисовать алмазным карандашом по 4 лунки на каждом предметном стекле.
Способ В. На каждом предметном стекле нарисовать 4 лупки парафиновым карандашом DAKO Pen for immunohistochemistry (карандаш для иммуноцитохимии Code No S2002).
В каждую лупку па предметных стеклах внести по 20 мкл рабочего раствора ПЛ и сушить до полного высыхания в термостате 37°С.
Рис.2. Предметное стекло с лунками для нанесения суспен зии клеток
4.3.3. Покровные стекла
Покровные стекла хранить в смеси Никш|х:)рова. Перед использованием тщательно протереть.
4.3.4. Буфер
Варианты приготовления буфера для нмупоцитохи-мического гигализа.
4.3.4.1. Трис-буфер,концентрированный раствор для хранения, подлежащий разведению непосредственно перед работой:
Состав Количество
NaO 5,8 г
IRIS 6.0 г
Aqua bictest 1000 мл
HCI25% раствор Для доведения pH до 7,4
Для работы приготовить рабочий раствор, соединив одну часть концентрированного раствора и четыре части физиологического раствора
4.3.4.2. TBST (Tris Buffered Saline Containing Tween 1 Ox concentrate) жидкий концентрированный. Разводить бидистиллировашюй или деионизированной водой в соотношении 1:10(одпа часть TBST па девять частей биднетиллировапной воды). Получаемый раствор является 50mM Tris-HCl, 300 тМ NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7,6 и не подлежит дальнейшему разведению. Хранить при 2-8°С.
4.3.4.3. PBS (phosphate buffered saline DAKO Code NoS3024 сухой в пакетах (6 пакетов в упаковке). Сухой порошок не требует особых условий хранения. Содержимое одного пакета развести в 1 л бидистиллировап-пой или деионизированной воды. Получаемый раствор является 50mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6 и не подлежит дальнейшему разведению. Приготовленный буфер хранить при 2-8°С.
4.3.5. Определение рабочего разведения антител
Титр антител - это наибольшее разведение сыворотки, содержащей антитела, при котором еще проявляется их действие.
Для получения оптимальных результате» при имму-ноцитохимическом выявлении поверхностных антигенов нужно исишккншъми^иммьпое^задепиешгппел. [Отведение любых аппггсл зависит от следующих фшсгоров:
• Высокая специфичность антител позволяет использовать их в высоких разведениях.
• Цель титрования: использование максимального разведения антител. В описанном нами методе стапдарт-иое в[)емя инкубации со специфическими антителами 30 мин. При увеличении времени инкубации до одного часа может быть использовало более высокое разведение специфических антител.
• В растворе специфических шгпггел всегда присутству-ет некоторое количество других веществ. Даже ПСВЫ-сокое содержи те загрязняющих (конгаминирующих, неспецифических) протеинов требует применения высоких разведений для избежания неспецифического (|ю нового окрашивания.
• На уровень разведения используемых антител оказывают влияние условия проведения каждого из этапов иммупоцитохимического выявления маркеров ДИ([х|х_*-ренцировки - фиксация образна, выбор буфера для разведения антител, использование влажной камеры, температура инкубации, протокол метода. 1Гоэтому 011-тимальпое разведение каждого специфического антитела должно быть определено каждой лабораторией в зависимости от качества используемых рештептов.
Для подбора оптимального разведения специфического антитела используют два критерия: специфичность выявления определенного антигена и иеспецнфическое фоновое окрашивание. Интенсивность каждой реакции оценивают по шкале в баллах от 0 до 4(от отрицательной до ярко выраженной). Для дальнейшего описания мы будем использовать следующие термины (табл. 3).
Таблица 3. БАЛЛЬНАЯ ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧЕСКОГО И ФОНОВОГО ОКРАШИВАНИЯ
Специфическое окрашивание Баллы Фон
Отень хорошее 4 Интенсивный
От хорошее, чуть бледноватое 3 Выраженный
Хорошее 2 Слабый
Бледное 1 Отень слабый
Отсутствует 0 Отсутствует
Порядок проведения титрования спец ифических антител:
1. Подготовить пять предметных стекол с нанесенной суспензией клеток, заведомо способных реагировать с данным специфическим антителом и пронумеровать их (№1-5).
2. Проинкубировать образцы №1, 2, 3 и 4 со шкалой антител соответственно в разведении 1:5, 1:10, 1:20,
1:40. Отрицательным контролем постановки с/тужит образец №5, который необходимо проинкубировать без специфических антител.
3. Завершить иммупоцитохимическое выявление маркеров ди<|х1)ерепцировки па поверхностной мембране согласно протоколу.
4. Провести учет специфического и (|хлювого окрашивания образцов согласно балльной оценке.
Типичный результат титрования антител (пример)
Таблица 4. ПОРЯДОК НУМЕРАЦИИ ОБРАЗЦОВ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ МРОВАНИЯ
Образец №
1 2 3 4 5
Разведение 1:5 1:10 1:20 1:40 Отрицательный контроль
Специфжеское окрашивание 4 4 3 1 0
Фон 2 2 0 0 0
Если в образце №5 (отрицательный контроль) выявляется положительное окрашивание, то эго [хэультат I ^“специфического связыват 1ия.
Интерпретация полученных результатов:
Разведение 1:10 дает очень хорошее специфическое окрашивание, по при этом выявляется определенное фоновое окрашивание образца. Разведение 1:20 не приводит к образованию ({хшового окрашивания, но при этом специфическое окрашивание не такое яркое как в предыдущем разведении. Целесообразно провести дополнительное титрование таких же образцов, используя титрование с более мелким шагом: 1:10, 1:12, 1:14, 1:16, 1:18, 1:20. Это позволит точно определить, какое разведение дает наиболее выраженное специфическое окрашивание в сочетании с минимальным фоном.
Работая с готовыми к использованию официпальпы-ми связывающими и/или антителами с меткой надо определить разделение только специфических антител.
В случае титрования специфических и связывающих и/или антител с меткой надо определить оптимальное разведение для каждого из них. Для безошибочного учета полученных результатов образцы должны быть пронумерованы.
Нумерация образцов для проведения титрования двух видов антител одновременно
Связывающие и/или Разведение
антитела с меткой специфических антител
1:50 1:100 1:150
1:20 1 2 3
1:40 4 5 6
1:60 7 8 9
Таким образом, необходимо провести выявление маркера па девяти положительных образцах.
План проведения тцювания двух видов антител одновременно:
1. Подготовить девять предметных стекол е нанесенной суспензией клеток, заведомо способных реагировать с данным специфическим антителом.
2. Проинкубировать подготовленные образцы №1, 4, 7 со специфическими антителами в разведении 1:50.
Проинкубировать подготовленные образцы №2, 5, 8 со специфическими антителами в разведении 1:100. Проинкубировать подготовленные образцы №3, 6, 9 со специфическими антителами в разведении 1:150.
3. Проинкубировать подготовленные образцы №1, 4, 7 со связывающими и/ил антителами с мегкой в разведении 1:20.
Проинкубировать подготовленные образцы №2, 5, 8 со связывающими и/ил антителами с мегкой в разведении 1:40.
Проинкубировать подготовленные образцы №3, 6, 9 со связывающими и/ил антителами с меткой в разведении 1:60.
Результаты проведения титрования двух видов антител одновременно представлены в таблице № 5.
Таблиид 5. СООТНОШЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОГО И ФОНОВОГО ОКРАШИВАНИЯ В БАЛЛАХ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РАЗЛИЧНЫХ ТИТРОВ СПЕЦИФИЧЕСКИХ И СВЯЗЫВАЮЩИХ АНТИТЕЛ
Связывающие иДши Разведение специфических
аншгела с меткой amvren
1:50 1:100 1:150
1:20 4/2 2$ 1/0
1:40 2/0 1/0 1/0
1:60 1/0 1/0 1/0
Очевидно, что оптимальные результаты окрашивания получены при соотношении разведения специфических антител 1:50 и связывающих и/или антител с меткой в разведении 1:20. Для уменьшения фонового окрашивания провести дополнительное титрование, используя специфические антитела в диапазоне от 1:50 до 1:100 (1:50,1:60,1:70,1:80,1:90,1:100), сохраняя разведение связывающих и/или антител с меткой в разведении 1:20.
Оптимальное сочетание разведений должно быть подтверждено повторным окрашиванием образца с такими разведениями специфических и связывающих и/или а1 пи-тел с мегкой, которые позволяют получить наиболее яркое специфическое окрашивание с минимальным фоном.
4.3.6. Хромогены
При использовании пероксидазпой метки для выявления продукта реакции в настоящее время используются диамииобензидин (ДАБ) и аминоэтилкарбозол (АЭК).
Оба хромогена очень чувствительны к загрязнению такими окислителями, как металлы, бактерии, пыль и лабораторная посуда общего пользования. Следует избегать попадания прямого солнечного света. Неиспользованный раствор должен быть ликвидирован согласно местным и федеральным нормам ликвидации такого рода веществ. Показана роль ДАБ и АЭК как потенциальных канцерогенов, поэтому нужно избегать контакта с кожей. Если такой контакт произошел, то надо смыть попавшую жидкость большим количеством воды.
4.3.6.1. ДАБ
ДАБ формирует коричневое окрашивание конечного продукта на месте целевого антигена. Способы приготовления рабочего раствора различны.
Способ А:
6 мг ДАВНЕЮ/A GmbH 3,3-Diamino-benzidine4HCl research grade, хранить при +4°С) внести в 10 мл 0,05 М трис-буфера, pH 7,6. Смесь тщательно размешать, профильтровать и затем добавить ЮОмкл свежеприготовленной 3% перекиси водорода(10 мкл 33% пергидроля па 90 мкл бидистиллнрованпой воды). Раствор нанести па лупки в избытке, инкубировать в течение 10 мин, контролируя интенсивность окрашивания под микроскопом. Раствор использовать в день приготовления.
Способ Б:
DAKO Liquid DAB Substrate-Chromogen System. В связи с высокой чувствительностью самого хромогена и разводящего его буфера к окислительным агентам нельзя использовать хромоген прямо из флакона Нужно взять необходимое количество в отдельный чистый контейнер и потом аккуратно брать необходимые количества для приготовления рабочего раствора. Нельзя возвращать излишки реагентов обратно во флаконы. Приготовление рабочего раствора:
Добавить 1 каплю (или 20 мкл) хромогена ДАБ к 1 мл субстратного буфера. Для определения необходимого количества субстратного буфера использовать градуированную пробирку. Хорошо размешать и нанести раствор специально предназначенной для этого пинеткой. После использования тщательно промыть использованные емкости дистиллированной водой. Неиспользованный рабочий раствор ДАБ может быть применен в течение двух недель при условии хранения его при +4°С. При образовании осадка тщательно ресуспепдировать перед использованием.
Нанести раствор ДАБ на препарат в избытке и инкубировать 5-30 мин. Аккуратно смыть дистиллированной водой.
4.3.6.2. АЭК
АЭК (аминоэтилкарбозол) формирует красно-коричневый конечный продукт реакции в месте целевого антигена НЫ-диметилформамид, используемый для раство-
рения АЭК является опасным при вдыхании и попадании внутрь.
АЭК рекомендован для использования в методах, основанных на работе с пероксидазой. Существует несколько способов приготовления АЭК для иммупоцитохими-ческих реакций.
Способ А; Система субстрата АЭК DAKO состоит из 3-амино-9-этилкарбозола и разводящего буфера. После окисления АЭК образуег красный преципитат в месте реакции. Для использования определить необходимый объем субстрата. 2 мл готового раствора достаточно для окрашивания 100 лунок.
Способ Б: DAKO АЕС substrate-chromogen содержит
0,75мг/мл 3-амшio-9-этилкарбгаола в 2,5% растворе НЫ-диметил^юрмамида и 50 мМ ацетатного бус|)ера, pH 5,0. Раствор гогов к использованию. Хранить при температуре не выше +8°С. Флакон с АЭК может быть извлечен из холодильника только для взятия необходимого рабочего объема. АЭК использовать только холодным. Сразу после использования АЭК должен быть возвращен в холодильник.
Никогда не наносить раствор АЭК прямо из флакона Перенести необходимое количество в чистый контейнер н брать раствор для нанесения на препарат уже из него. Нельзя возвращать излишки АЭК обратно во флакон.
Нанести АЭК па препараты с избытком и инкубировать 10 мин. При желании инкубация с АЭК при более высокой, чем 18-22°С температуре приводит как к сокращению времени инкубации, так и к увеличению песпецн-фического окрашивания. Аккуратно смыть дистиллированной водой. При необходимости возможно исишндова-ние контрастирующего окрашивания. В связи с тем, что АЭК образуег конечный продукт, растворимый в органических веществах, необходимо помнить, что докрашивать и заключать такие препараты надо веществами, не содержащими спирт, например, водной заключающей средой. Ограничения: эндогенная пероксидазпая или псевдопе-роксидазпая актвпость, связанная с наличием гемоглобина цитохрома или катал азы, может давать лож-нополож1-ггелы1ые результаты. Для предупреждения этого препараты крови и костного мозга можно предварительно обрабатывать специальным раствором, блокирующим эндогенную пероксидазпую активность (DAKO Peroxidase Blocking reagent).
4.3.7. Водорастворимая среда для заключения препаратов
1. Глицерин-желатин
Способ приготовления глицерин-желатина: 10%(луч-ше 20%) ампулированный желатин 50 мл, глицерин 50 мл смешать аккуратным наслаиванием одной жидкости на другую гак, чтобы не образовалось пузырьков воздуха, и поставить па водяную башо па 1 ч при 56°С. Затем разлита но 15 мл и хранить при +4°С.
2. Глицгргель
Более качественные препараты получаются при заключении их глицергелем производства ОАКО. Для использования надо разогреть иод проточной горячей водой (теплее, чем 50°С) в течение 3-5 мин или в термостате при 56°С.
4.4. Ход реакции
4.4.1. Этап нанесения клеток на предметные стекла
Данный этап полностью может выполняться лаборантом.
1. На подготовленные нредметпые стекла нанести по 20мкл суспензии клеток в каждую лунку. Стекла поместить в термостат(37“С) до высыхания (45-90 мни).
2. Фиксировать клетки в холодном ацетоне в течение 10 мин.
3. При необходимости храпения поместить но два стекла либо в микрокамеру для иммунологических исследований (типа камеры Терасаки) и заклеить края камеры парафильмом (пластырем, скотчем), либо завернуть стекла в алюминиевую фольгу или пищевую пленку. Хранить при -20°С в течение 3 месяцев.
4.4.2. Этап выявления специфических антигенов на поверхностной мембране клеток
Данный этап выполняется врачом-лабораптом.
1. Размо[шкивапие стекол 20 мин нри18-22°С.
Для избежания конденсации влаги на препаратах размораживание проводить без доступа открытого воздуха (не вынимая их из камер Терасаки или алюминиевой с|юльги).
2. Фиксировать холодным ацетоном 2 мин.
Работу с ацетоном проводить по правилам работы с едкими веществами только в вытяжном шкафу. Ацетон хранить при +4°С, использовать однократно. Отработанный ацетон должен быть слит в отдельную специально маркированную емкость.
ВСЯ ПОСЛЕДУЮЩАЯ РАБОТА ДОЛЖНА ПРОВОДИТЬСЯ ВО ВЛАЖНОЙ КАМЕРЕ ПРИ ТЕМПЕРАТУРЕ 18-20°С. ПРИ КАЖДОЙ СМЕНЕ РЕАГЕНТОВ НЕОБХОДИМО УБРАТЬ ИЗЛИШКИ ВЛАГИ С ОБЕИХ СТОРОН СТЕКЛА, НЕ ЗАТРАГИВАЯ ЛУНКИ
3. Нанести специфические антитела в рабочем разведении по 20 мкл в каждую лупку. Инкубировать ЗОмип.
4. Поместить стекла в емкость с буфером, например в гистологические стаканчики. Трижды отмыть буфером. Для этого оставлять стекла в каждой смене раствора на 3 мин.
5. Нанести связывающие антитела (кроличий иммуноглобулин против мыши, связанный с биотином) по
20 мкл в каждую луіп<у. Инкубировать 10 шш.
6. Повторить п.4.
7. Нанести стрсгштидин, коныогнрованиый с пероксн-дачой по 20 мкл и каждую лунку. Инкубировать 10 мин.
8. Повторить п.4 К моменту окончания отмывки достать хромоген из холодильника
9. Нанести холодный хромоген и избыгке (30 мкл па каждую лунку). Инкубировать 10 мин.
10. Смыть х[хімогсн дисгиллироватюй водой и нацисти в каждую лунку но 20 мкл метиленового зеленот. Инкубировать 20 мин.
11. Стряхнугь краску на фильтровальную бумагу, снять гіарафилм и сполоснугь стекла шхуіедовлтельно в двух емкостях с проточной ВОДОЙ.
12. Заключить щкпарат в глицерпель:
• Аккуратно с помощью пинцета удалить парафилм.
• Нанести на центр или па край покровного стекла небольшую каплю глицергеля.
• Закрыть две луї па ї одним покровным стеклом таге, что-бы под покровное стекло не попали пузырьки воздуха.
• Таким же образом закрьггь еще две лунки па предметном стекле.
Заключение препарата проводить достаточно быстро, чтобы не произошло высыхания лунок.
4.4.3. Карта самоконтроля выполнения протокола
N Последовательность выполнения Длительность (мин) Время выполнения
начало окончание
1. Размораживание предметных стекол 20
2. Внесение в регистрационный журнал панели специфических антител 5
3. Маркировка микропробирок для разведения специфических антител 3
4. Подготовка буфера 5
5. Фиксация препаратов 2
6. Инкубация со специфическими антителами 30
7. Отмывка в буфере 10
8. Инкубация со связывающими антителами 10
9. Отмывка в буфере 10
10 Инкубация со стрептавидином, соединенным с пероксидазой 10
11. Отмывка в буфере 10
12. Инкубация с АЭК 10
13. Инкубация с метиленовым зеленым 20
14. Заключение препарата 2
4.5. Учет результатов
При мик]хк:копии идентифицируется ОК]Ш11еН11ЫЙ продукт пммунсх()ермс1гпгой [)еакции (черно-коричневый при использовании ДЛБ, красно-коричневый при использовании ЛЭК), образовавшийся в местах связывания выявляемых ан тигенов.
Учет результатов П|Х)шд1пъ а световом .\шк]хх'к0пе при суммарном увеличении х900 (окуляры 15, обт>ектив 60) или с псполкюванием масляной иммерсии (окуляры
15, объектив 90).
Положительно окрашенной считается клепегц по ок-рудакхгш которой окрашенный продукт реакции занимает не менее трети. Подсчет проводить на 200 клеток, определи ть процент положительно окрашенных клеток.
4.6. Типичные ошибки и способы их устранения
(см. таблицу на сгр 36-37)
5. МИКРОЛИМФОЦИТОТОКСИЧЕСКИЙ ТЕСТ
5.1. Принцип метода
Лимфоцитотоксический тест основан на способности мышиных моноклональных антител (МКАТ) класса и 1йС взаимодействовать с антигенами мембраны лимфоцитов, образуя комплекс антиген-антитело, активирующий комплемент. П результате происходит повреждение клеточной мембраны и лимфоцитолиз, выявляемый внесением суправигальных красителей.
5.2. Оборудование, расходные материалы и реагенты
Лабораторные принадлеж- Реагенты
ности и оборудование
• Микрошприц типа • Моноклональные
“Гамильтон" антитела серии ИК0
Камера Горяева • Комплемент кроличий
• Микропланшеты типа сухой
Терасаки • ^Бйрарие 1077
• Пробирки центрифужные • фосфатно-солевой
градуированные (10 мл) буфер
• Микроскоп “ВИОЛАМ" • Эозин-К сухой
Р-114 (Л0М0) • Формальдегид по ГФХ
• Термостат (+20 С) • Минеральное масло
• Микродозаторы • Эмбриональная телячья
механические (40-200 мкл) сыворотка
и расходные материалы к ним • Антилимфоцитарный
• Холодильник бытовой (+4° С) глобулин
• Морозильная камера (-20° С)
• Счетчик для подсчета
форменных элементов
ТИПИЧНЫЕ ОШИБКИ И СПОСОБЫ ИХ УСТРАНЕНИЯ (к пункту 4.6)
Проблема Возможные причины Способ устранения
Нет окрашивания в образце или отрицательном контроле. Фона нет. Только контрастирующее окрашивание. Отсутствие специфических антител или реагента с меткой (меченые связывающие антитела, ПАП, соединенный с ферментом авидин) Повторить процедуру окрашивания, используя лист самоконтроля проведения методики
Использование контрастирующей краски, содержащей спирт, и/или спирт-содер-жащей среды для заключения препаратов, если использованные хромогены (АЭК, Fast Red, соли тетразолия) образуют спирт-растворимый конечный продукт Повторить окрашивание, используя несодержащие спирт контрастирующую краску и заключающую среду,
Неправильное приготовление хромогена Повторить выявление метки правильно приготовленным хромогеном
Реагенты использованы в неправильном порядке Повторить процедуру окрашивания, используя лист самоконтроля проведения методики
Присутствие азида натрия в разводящей жидкости или отмывающем буфере в методах, использующих пероксидазу в качестве метки Исключить азид натрия из разводящей жидкости и буфера в методах, использующих пероксидазу в качестве метки
Использован буфер, неподходящий для приготовления хромогена Повторить окрашивание с использованием требуемого методикой буфера для приготовления хромогена
В образце и положительном контроле специфическое окрашивание отсутствует или очень слабое, но есть неярко выраженное фоновое окрашивание Отсутствие специфических антител Повторить процедуру окрашивания, используя лист самоконтроля проведения методики
Специфические антитела плохого качества неправильно разведены (недостаточно или слишком концентрированы) Заменить антитела низкого качества. Определить рабочую концентрацию и/или время инкубации для специфических антител. В зависимости от степени полученного окрашивания (если оно есть) изменить концентрацию в 2-5 раз. В общем, время инкубации может быть незначительно увеличено, если фоновое окрашивание отсутствует или не очень выражено.
Один или несколько реагентов низкого качества Повторить окрашивание, сменив один или несколько реагентов на новые или на реагенты, которые ранее позволяли получить необходимое окрашивание.
Излишки буфера или блокирующей сыворотки оставлены на образце в избытке до внесения специфических антител. Это приводит к чрезмерному разведению специфических антител. Повторить окрашивание, аккуратно удаляя любые излишки буфера и блокирующей сыворотки
Недостаточное время инкубации Определить оптимальное время инкубации после того, как все вопросы с реагектшой будут решены.
Диссоциация специфических антител при чрезмерной отмывке или при инкубации со связывающими антителами Эта ситуация возможна при использовании низкоафинных антител. Использовать специфические моноклональные анштела более высокой афинности или изменить время инкубации в буфере или со связывающими антителами.
Инкубация проведена при слишком низкой температуре Время инкубации и температура инкубации находятся в обратной зависимости. Необходимо определить оптимальное соотношение времяДемпература.
Нет специфического окрашивания только в опытном образце. В положительном контроле выявляется адекватное специфическое окрашивание разной степени выраженности, фоновое окрашивание может быть такой интенсивности, что перекрывает специфическое окрашивание. Слишком длительная фиксация образца, что приводит к маскировке антигенных детерминант Определить оптимальное время фиксации.
Образец содержит большое количество разрушенных форменных элементов, что приводит к ложноположительному и интенсивному фоновому окрашиванию. При учете результатов не учитывать разрушенные клетки.
Уровень специфического антигена слишком низок для выявления его выбранным методом. Увеличить время инкубации со специфическими антителами. Повторить инкубацию со связывающими и /или несущими метку антителами.
Бактериальная загрязненность использованных растворов Приготовить свежие растворы
Выраженное фоновое окрашивание в образце и положительном и отрицательном контролях одновременно Слишком долгая инкубация с субстратом хромогена Сократить время инкубации с субстратом хромогена
Субстрат хромогена приготовлен некорректно Повторить инкубацию с корректно приготовленным субстратом хромогена
Связывающие антитела перекрестно реагируют с антигенами ткани донора Повторно определить оптимальные разведения, используя таблицу титрования связывающих и/или несущих метку антител. Повторить окрашивание.
Связывающие и/или несущие метку (третьи) антитела слишком концентрированы Повторно определить оптимальные разведения, используя таблицу титрования связывающих и/или несущих метку антител. Повторить окрашивание.
Препараты плохо отмыты буфером Тщательно и аккуратно промыть препараты буфером и поместить на 5 минут в буфер.
Использована неподходящая блокирующая сыворотка Источником блокирующей сыворотки и связывающих антител должен быть один вид животных
Выраженный фон диффузного характера только в “опытном" образце. Слишком длительная фиксация образцов приводит к маскированию антигенов Уточнить время фиксации образцов
Нефиксированные образцы могут неспецифически связывать все реагенты Проверить фиксирующие жидкости
5.3. Подпотовительный этап
Подготовка планшетов Терасаки.
Во все лунки планшета Терасаки нпести по 5 мкл минерального масла.
Развести моноклональные антитела требуемых специфичностей и антилимфоцитарный глобулин согласно 1 [рилагаемым ш кпрукциям.
Под минеральное масло внести моноклональные антитела каждой специфичности, положительный (шпи-лим(|юцптарный глобулин) и отрицательный (эмбриональная телячм сыворотка) контрол и.
Все указанные реагенты вносятся по 1 мкл в трех нархтлелях.
Подготовленные планшеты могут храниться при -2ОС в течение двух недель, упакованные в полиэтиленовые мешки для предотвращения высыхания. Перед ипюль-зовш 1нем I L/iai ппегы с монокло! 1альными ai тпеламн разморозить при комнатной температуре.
Приготовление раствора эозина.
Приготовить 5% водный раствор эозина-К. Учитывая плохую растворимость красителя, раст вор приготовить не менее, чем за 24 часа до постановки теста. После растворения эозина раствор профильтровать через фильтровальную бумагу или центрифугировать в течение 10 мин при 1500 об/мин и хранить при +4°С в течение месяца
5.4. Протокол анализа
До постановки лимфоцитотоксического теста произвести подсчет жизнеспособных клеток (их число должно быть не менее 95%).
Все этапы лимфоцитотоксического теста следует проводить ири температуре 18-22 °С. В каждую лупку планшета внести по 1 мкл исследуемых лимфоцитов (концентрация 1х10с/мл) и инкубировать в течение 0,5 часа. После этого добавить по 4 мкл кроличьего комплемента и инкубировать 1 час. Лиофилизироваиный кроличий комплемент разводить ex tempore дистиллированной водой (pH 7,4) согласно прилагаемой инструкции. После окончания инкубации внести но 2 мкл 5% водного р-ра эозина и через 5 мин фиксировать добавлением 4 мкл 17% водного раствора формалина. Камеры с внесенным формалином ммуг сохраняться при 4 °С в течение трех суток. Перечисленные выше этапы выполняет лаборант.
Учет реакции проводит врач с помощью светового микроскопа, подсчитывая количество прореагировавших (иотбших) и живых клеток в каждой лупке па 100 клеток. Погибшие клетки приобретают розовое окрашивание, их контуры становятся менее четкими, живые лимфоциты не окрашиваются. Результаты выражают в процентах согласно формуле:
%CD’ = А~В х100%
‘ 100-В
где А - % погибших клеток в опыте (среднее арифме-
тическое из трех повторов), В - % погабших клеток в контроле (среднее арифметическое из трех повторов).
5.5. Ограничения метода
Мик|Х)лим<1ющпстгоксический тест пригоден для определения относительного содержания антигеп-положигель-пых клеток ири изучении иммунного статуса, но не принь ден для установления иммунологического фенотипа бласт-ных клеток ири остром лейкозе. В этом случае следует использовать реакцию непрямой иммупофлюоресцснщш.
При уменьшении числа жизнеспособных клеток в отрицательном контроле в ходе теста до 80-85 %(100 - В, см. формулу подсчета) тест следует повторить.
В микролимфоцитатоксическом тесте нельзя применять моноклональные антитела, в инструкциях, к которым есть отметка о невозможности их использования в данном тесте.
5.6. Типичные ошибки и способы их устранения
Методическая Возможная Путь
трудность причина преодоления
Низкое содержание Несоблюдение Контроль за
жизнеспособных температурного температурным
клеток в отрица- режима и режимом и
тельном контроле pH реагентов pH реагентов
(< 80 %)
Низкое содержание Несоблюдение Приготовление
нежизнеспособных регламента работы раствора компле-
клеток в положи- с комплементом мента только
тельном контроле ex tempore, готовый
(< 90 %) раствор хранению не подлежит
6. ЗНАЧЕНИЯ НОРМЫ
Границы нормальных значений относительного и абсолютного количества лимсіюцитов, несущих соответствующие поверхностные антигены, являются необходимым звеном интерпретации результатов анализа. Обязательным является указание этих значений в соответствующем бланке. Данные литературы но значениям нормы колеблются в широких пределах. Эти различия зависят от множества причті: контингента обследованных, тщательности отбора здоровых лиц, региона, используемого метода и тд. Границы нормы, приведенные ниже, являются результатом анализа и обобщения данных литературы, опыта ведущих иммунологических лабораторий Санкт-Петербурга, а также учитьшают особенности методов, описанных выше.
6.1. Периферическая кровь (взрослые)
СО маркеры лимфоцитов значения (%) Границы нормы (минимум - максимум)
Относительные значения (х1 СР/л) Абсолютные
СОЗ 60-80 1,0-2,4
С04 33-50 0,6-1,7
С08 16-39 0,3-1,0
С04/С08 1.5- •2,0
С019 5-22 0,04-0,4
сгао 6-23 0,05-0,6
С016 3-20 0,03-0,5
С056 5-25 0,045 - 0,7
С025 7-18 0,06-0,4
Н1А-ДО 9-28 0,1-0,75
6.2. Периферическая кровь (дет)
СО маркеры Возраст
лимфоцитов 1 год-6 лет 7- 17 лет
% х 10Р/л % х10Р/л
СЮ 62-69 1,82-3,01 63-69 1,75-3,09
СМ 30-40 1,02-1,84 39-47 0,83-2,11
сто 25-32 0,81-1,52 23-29 0,49-1,3
С04/С08 1,0 -1,6 1,4-2,0
С020 21-28 0,74-1,33 10-14 0,21-0,62
С056 8-15 0,21-0,64 6-17 0,12-0,76
Н1АйВ 8-12 0,34-0,56 10-16 0,21-0,71
6.3. Периферическая кровь (дет раннего возраста - до 1,5 лег)
Возраст Диапазон (минимум - максимум
(месяцы) С02% С03% С04% С08% С019%
0-6 55-88 55-82 50-57 8-31 1145
6-12 55-88 55-82 49-55 8-31 11-45
12-18 55-88 55-82 46-51 8-31 11-45
18-24 55-88 55-82 42-48 8-31 11-45
24-30 55-88 55-82 38-46 8-31 1145
30-36 55-88 55-82 33-44 8-31 1145
6.4. Костный мозг (взрослые)
СО маркер СОЗ С04 С08 С022 Н1МЖ С034 С020
Диапазон (минимум-максимум) 21-51 14-30 11-28 17-29 10-28 0-5 3-10
Продолжение 6.4
СОмаркф С016 СЕ325 С07 С019 СОЮ С013 0014 СОЗЗ
Диапазон (минимум -максимум) 6-34 5-28 17-31 7-20 0,5-15 3-6 2-8 3-11
6.5. Костный мозг (дети)
СО маркер, Возраст (годы)
мин-макс, % 1-5 6-10 11-15
С02 16-51 37-72 43-76
С04 6-33 15-39 2548
038 4-22 14-33 11-30
СОЮ 1341 7-28 7-23
С019 20-68 22-44 13-32
С020 1940 11-31 4-17
С021 0-14 1-14 2-14
ВНЕШНИЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Внешний контроль качества является обязательным условием стандартизации метода, а также аккредитации лаборатории с выдачей лицензии па проведение соответствующих видов анализов. Реализация программ внешнего контроля качества по иммупофенотииировапию сталкиваегся с серьезными трудностями методического и организационного характера. Во многих странах эта проблема до сих пор пе решена В Российской Федерации в настоящее время отсутствуют программы внешнего копгроля качества по иммуиофенотииироваиию. Одной из первых таких программ, успешно реализованной во многих странах мира, является программа Системы Внешнего Контроля Качества Великобритании. В настоящее время существуют
• Программа для проточной цитометрии
• Программа для иммуиофлюоресцепции
• Программа для иммуноцитохимии
Каждая Программа предполагает 6-кратное (1 раз в 2 мес.) в течение года участие лаборатории во внешнем контроле качества и получение соответствующего контрольного материала.
ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение 1: подготовка пробирок Подготовка пробирок для работы с клетками
Силикон снижает потери прилипающих клеток (ней-трофилов, моноцитов, макрофагов й т.д.)
Силиконировшше пробирок необходимо при взятии крови в пробирки, приготовленные в лаборатории (вариант А), и на этапе вьщеления моно1гуклеаров из периферической крови.
Силиконировагае проводится с помощью водорастворимого силикона, готового к использованию:
• в чистые центрифужные пробирки палить 10-12 мл силикона.
• Инкубировать 60 мин при комнатной температуре.
• Силикон удалить, пробирки сушить на воздухе. Вариант Б не требует предварительной подготовки пробирок.
Подготовка пробирок для взятия крови:
1 .Подготовка гепаринизироеанных пробирок
Расчет количества гепарина, вносимого в одну пробирку:
• на 1 мл крови или костного мозга необходимо 20 ЕД гепарина;
на 5 мл крови или костного мозга - 100 ЕД гепарина.
• Разведение гепарина
Флакон 5 мл содержит 25000 ЕД гепарина натрия и 4 мг хлоркрезола в водном растворе.
1 мл содержит 5 000 ЕД гепарина.
Для приготовления рабочего раствора необходимо развести гепарин физиологическим раствором 1:10 (к 1 мл гепарина добавить 9 мл физиологического раствора).
Расчет:
1 мл перазведеппого гепарина содержит 5 000 ЕД гепарина.
1 мл рабочего раствора содержит 500 ЕД гепарина. Значит, 100 ЕД содержится в 0,2 мл рабочего раствора гепарина.
• Разнести в пробирки по 200 мкл рабочего раствора гепарина.
2.Подготовка пробирок с ЭДТА (трилон Б)
Приготовить 3% раствор трилоиа Б.
В каждую пробирку внести 200 мкл 3% раствора трилопа Б из расчета па 10 мл периферической крови или на 3 мл костного мозга.
Приготовление верографин-фиколла
Необходимые реагенты и оборудование:
Оборудование Реагенты
Флаконы для хранения фиколла Фиколл сухой
стерильные Верографина раствор
Фильтры для стерилизации Бидистиллированная
раствора вода
Маркер для маркировки флаконов
Мерный цилиндр
Денситометр 1,060-1,220г/л
1. 24,6 г фиколла развести в 273 мл дистиллированной воды. Для более быстрого и качественного растворения фиколла поместить смесь на водяную баню или в термостат (1=56°С) до полного растворения. Плотность полученного раствора должна соответствовать 1, 025 г/л. Если раствор более плотный, необходимо доразвести его до указанной плотности дистиллированной водой.
2. Верофафин 76% 4 ампулы по 20 мл = 80 мл + 40 мл дистиллированной воды. Плотность 1,200. Если плотность меньше, то надо добавить верофафин. Если плотность больше, то надо добавить дистиллированную воду до необходимой плотности.
3. Смешать оба приготовленных раствора и проверить плотность. Если плотность полученного раствора меньше 1,077 г/л, то необходимо добавить разведенный верофафин.
Расчет приготовления нерофафип-фиколла при использовании верофафииа более низкой концентрации:
60% верографип: 7,64 г фиколла + 92,56 мл дистиллированной воды + 20 мл 60% верофафииа.
50% верографип: 6,36 г фиколла + 73,75 мл дистиллированной воды + 20 мл 50% верофафииа.
4. После получения готового раствора необходимо проверить плотность приготовленного раствора. Для этого используется денситометр 1,060-1,220г/л, который необходимо полностью ПОфуЗИТЬ в раствор и спять показания.
5. Раствор фиколла плотностью 1,077 г/л для дальнейшего храпения необходимо простерилизовать методом автоклавирования или фильтрации. Диаметр пор используемых фильтров 0,22 мкм.
Приложение 2: градиент плотности для выделения мононуклеаров
Градиент плотности 1,077 используется:
• Фабричного приготовления
• Приготовленный на основе сухого фиколла и ве-рофафица
Приложение 3: подготовка растворов для определения жизнеспособности клеток с помощью суправитальных красителей
При этом методе происходит отторжения клеткой красителя, который (например, трипаиовый синий, эозин У) не проникает сквозь мембраны живых клеток.
Растворы для метода с применением трипанового синего:
Вариант одного раствора: 0,1% раствор в PBS, содержащий 3 мМ азида натрия.
Вариант двух растворов:
Раствор Л - 4,25% водный раствор NaCI.
Раствор Б - 0,2% водный раствор трипанового синего.
Растворы для метода с применением водорастворимого эозина:
2 варианта приготовления эозина:
1. Основной раствор красителя, содержащий 0,2 г дп-иатриевой соли эозина и 100 мл PBS с добавлением 0,1 мг азида натрия.
Смешать равные объемы суспензии клеток и раствора эозина натрия.
2. Раствор А - 5% раствора водорастворимого эозина.
Раствор Б - 1,8% NaCl.
На проникновение эозин-натрия в клетки влияет присутствие сыворотки, поэ тому для подсчета клеток в данном методе их необходимо ресуспепди-ровать в среде, не содержащей белка.
Метод окрашивания трипановым синим
• Соединить растворы А и Б в соотношении 1:4.
• Затем к 1 объему суспензии клеток добавить 4 объема приготовленного раствора краски.
• Внести кайлю клеточной взвеси в камеру Горяева и оставить на 1 мин, чтобы клетки осели.
• Считать неокрашенные живые и голубые мертвые клетки сразу после этого, так как уже через 5 мин большинство лимфоцитов начинает активно пи-I юцитировать красител ь.
Метод окрашивания динатриевой солыо эозина.
На проникновение эозин-натрия в клетки влияет присутствие сыворотки, поэтому для подсчета клеток в данном методе их необходимо pecyci лидировать в среде, не содержащей белка.
Вариант одного раствора:
Смешать равные объемы суспензии клеток и раствора эозина натрия.
Вариант двух растворов
3 объема 5% раствора водорастворимого эозина соединить с
1 объемом 1,8% NaCl непосредственно перед использованием.
Полученную готовую краску соединить с суспензией клеток в соотношении 1:1.
Затем подсчитать количество живых (неокрашенных) и погибших (красных) клеток. Подсчет необходимо проводить в течение 5-10 минут после добавления красителя.
Приложение 4: перечень оборудования
Перечень лабораторного оборудования, необходимого для описанных методов и зарегисірироікишош в "Пх-удар-ственпом реестре медицинских изделий”, Москва, 1996 г.
№гУп Название
3. Весы лабораторные
4. Вытяжной шкаф
5. Дозаторы одноканальные пипеточные автоматические с варьируемым объемом для объемов 0,5-10 мкл, 10-200 мкл, 200-1000 мкл, 5000 мкл
6. Дозаторы пипетенные многоканальные с варьируемым объемом
7. Клавишный счетчик для подсчета форменных элементов крови типа Темотест-2”
8. Люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ Р-8 или РПО-11
9. Микроскоп “БИОЛАМ" Р-114(ЛОМО)
10. Микроскоп световой типа Биолам
11. Микрошприц типа “Гамильтон” МШ-50 и МШ-200
12. Морозильная камера (-2СРС}
13. Проточный цигаметр EPICS XL
14. Термостат (+20 С)
15. Термостат ТС-80М-2 (+37°С)
16. Термостат Т080М-2 (+56°С)
17. Холодильник бытовой (+4°С)
18. Центрифуга рефрижераторная с ротором-крестовиной
19. Центрифуга типа “EppendorT
Приложение 5: перечень лабораторных принадлежностей
№ п/п Название
1. Гистологические стаканчики или другие емкости для отмывок
2. Денситометр 1,060-1,220г/л
3. Дырокол канцелярский
4. Камера Горяева
5. Контейнер для транспортировки пробирок с биоматериалом
6. Контейнеры для хранения фасованных реагентов
7. Лабораторные маркеры (набор из 5 цветов)
8. Микропланшеты типаТерасаки
9. Микропробирки полипропиленовые термостабильные 1,5 мл для хранения фасованных реагентов при -20°С
10. Микропробирки полипропиленовые конические 1,5 мл
11. Наконечники для дозаторов 0,5-10 мкл, 5-300 мкл, 100-1000 мкл
12. Ножницы канцелярские
13. Парафилм “М"
14. Планшеты для предметных стекол
15. Пробирки “Coulter"
16. Пробирки центрифужные градуированные (10 мл)
17. Пробки резиновые № 14,5 для герметизации стеклянных пробирок
18. Системы для забора крови типа “Вакутайнер”
19. Спиртовка
20. Стекло предметное (76x26x1,5-2,0 мм)
21. Стекло предметное (76x26x1 мм)
22. Стеклянный стакан на 50 мл
23. Фильтры для стерилизации раствора
24. флаконы для хранения фиколла стерильные объемом 50 мл
25. Цилиндр мерный
26. Чашки Петри Ж 100мм
27. Штатив для микропробирок
28. Штатив для центрифужных пробирок
Приложение 6: перечень реагентов
Препараты и реагенты, необходимые для описанных методов и зарегистрированные в “Регистре лекарственных средств России”, Москва, 1997/98 г.
№п/п Название
1. Ампулированный желатин 10%
2. Соляная кислота НСІ25% раствор
3. Градиент плотности на основе фиколла (1.077)
4. МаСІ
5. те
6. Азид натрия
7. Антилимфоцигарный глобулин
8. Ацетон чда
9. Бидистиллированная вода
10. Буфер
11. Верографи на раствор
12. Вторичные антитела, конъюгированные с флюорохромом
13. Гепарин или ЭДТА
14. Глицергель
15. Глицерин чда
16. Градиент плотности (плотность 1,077 г/л), готовый к использованию или реагенты для его приготовления
17. Динатриевая соль эозина
18. Калий фосфорнокислый однозамещенный
19. Комплемент кроличий сухой
20. Конъюгированные антитела
21. Метиленовый зеленый
22. Минеральное масло (вазелиновое)
23. Моноклональные антитела к CD маркерам
24. Моноклональные антитела серии ИКО
25. Натрий фосфорнокислый двузамещенный
26. Натрия хлорида 0,9% раствор для инъекций
27. Нормальная кроличья сыворотка
28. Параформальдегад
29. Поликлональные антитела с флюоресцентной меткой типа “Rabbit-anti-Mouse Immunoglobulins/FITC, Rabbit F(ab');
30. Разводящая жидкость для МКАТ
31. Раствор натрия хлорида 0,9% для инъекций
32. Раствор Хенкса
33. Связывающие антитела
34. Силикон водорастворимый
35. Спирт 70"
36. Сыворотка плодов коровы
37. Трилон Б
38. Трипановый синий
39. Фиколл сухой
40. Формальдегид по ГФХ
41. Фосфатно-солевой буфер
42. Хромоген
43. Эозин-К сухой
Основные производители моноклональных антител и вспомогательных реагентов
1. НПК “Препарат”, Нижний Новгород.
2. НПО “Медбиоспектр”, Москва
3. НИИ иммунологии, Москва
4. Фирма DAKO (Дания).
5. Фирма Becman-Coulter (США).
6. Фирма Becton Dickinson (США).
Список литературы
1. Bender J.G., Unverzagt K.L., Walker D.E., Lee W. van Epps D.E., Smith D.H., Stewart C.C., To LB. 1991 Identification and comparison of CD34-positive cells and their subpopulations from normal peripheral
blood and bone marrow using multicolor flow cytometry // Blood - 1991. - Vol. 77(12). - P. 2591-6.
2. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow//Scand.J.Clin.Lab.Investig. -1968. -Vol.
21. Suppl.97. - P.l-9.
3. Candwcll C.W., Poje E., Helikson M.A. B-cell precursors in normal pediatric bone marrow// Ain.J.Clin.Pathol. - 1991. - Vol.95. - P.816-823.
•1 Clark P., Normansell D.E., Innes D.J., Hess C.E. Lymphocyte subsets in normal marrow// Blood. -1986.
- Vol.67(6).-P.1600-1606.
5. Clark P., Normansell D.E. Phenotype analysis of lymphocyte subsets in normal human bone marrow// Am. J. Clin Pathol. - 1990. - Vol. 94(5).- P. 632-6.
6. Denny T„ Yogev R„ Gelman R., Skuza C, Oleske J„ Chadwick E. Cheng S.C., Connor E. Lymphocytes subsets in healthy children during the first 5 years of life//JAMA. - 1992. - Vol. 267(11). - P. 1484-1488.
7. Hannet I„ Erkeller-Yuksel F., Lydyard P., Deneys V., DeBruyere M. Developmental and maturational changes in humann blood lymphocyte subpopulations // Immunol Today. - 1992.- Vol.l3(6). - P. 215, 218.
8. Hulstaert F., Hannet I., Deneys V., Munhyeshuli V., Reichert 'Г., De Bruyere M., Strauss K. Age-related changes in human blood lymphocyte subpopulations.
II. Varying kinetics of percentage and absolute count measurements// Clin. Immunol. Immunopathol. -1994. -Feb.-Vol. 70(2). P.152-8.
9. Immunobiology. The immune system in health and disease. - 3-d ed.- London. - 1997.
10. Kotylo P.K., Fineberg N.S., Freeman K.S., Redmond N.L., Charland C. Reference ranges for lymphocyte subsets in pediatric patients//Am.J.Clin.Pathol. - 1993. -Vol. 100.-P. 111-115.
11. McCoy J.P., Overton W.R. Quality control in flow cytometry for diagnostic pathology: II. A conspectus of reference ranges for lymphocyte phenotyping// Cytometry. - 1994. - Vol.18. - P.129-139.
12. Patel R., Williams C. T-cell and В-cell subset determination in normal peripheral blood: comparison of the indirect immnofluorescence and lymphotoxicity
techniques.// Experentia. - 1984,- Vol.40.- P.1412-1413.
13. Stewart C.C., Stewart S.J. Immunological monitoring utilizing novel probes // NY Acad Sci. -1993. - Vol.677.
- P. 94-112.
14. Strauss K., I lannet I., Engels S., Shiba A., Ward D.M., Ullery S., Jinguji M.G., ValinskyJ., Barnett D., Orfao A., Kestens L. Performance evaluation of the FACSCount System: a dedicated system for clinical ccllular analysis. // Cytometry. - 1996. - Vol.Mar 15;26(1).-P. 52-9
15. Sternberger L.A. Immunocytochcmistry, 2'"' cd., John Wiley and Sons.- New York. -1979.
16. Sutherland D.R., Keating A., Nayar R„ Anania S., Stewart A.K. Sensitive detection and enumeration of CD34+ cells in peripheral and cord blood by flow cytometry // Exp.Hematol. - 1994. -Vol. 22(10). P. 1003-10.
17. Vesely R., Barths J., Vanlangendonck F„ Hannet I., Strauss K. Initial results of Central Immunophenotyping Quality Control Program(CEQUAL)//Cytometry. -1996,- Vol. 26(2).
- P. 108-12.
18. Исхаков A„ Алексеев Л., Бачурин П., Яздоиский В. Комплементзависимый микролимфоцит для количественного анализа субпопуляций лимфоцитов // Иммунология. - 1988 - №6 - С.75-76.
19. Клиническая нммунология/Под ред. акад.Е.И.Со-колова. - 1998. - 270 с.
20. Ланг Н.Р. Стимуляция лимфоцитов. -М. Медицина. - 1976.- 288 с.
21. Лимфоциты. Методы/ Под ред. Дж. Клауса. -М.:Мир. - 1990. - 392 с.
22. Полак Дж., С.Ван Норден. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. - М.: Мир,- 1987. -70 с.
23. Хаитов Р., Пинегин Б., Истамов X. Экологически иммунология. - М. -1995. - 219 с.
24. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Вторичные иммунодефициты: клиника, диагностика, лечение// Иммунология. - 1999, № 1. - 14-17 с.
поступила в редакцию 03.09.99
принята к печати 17.09.99
