CC BY
77
Александр Валентинович Шишкин1, Наталья Геннадьевна Овчинина2, Станислав Семенович Бессмельцев3
КОМБИНИРОВАННОЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ И ЦИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОК ОСТРЫХ МИЕЛОИДНЫХ ЛЕЙКОЗОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ БИОЧИПОВ
1 К. м. н., заведующий учебно-экспериментальной лабораторией, ГОУ ВПО Ижевская государственная медицинская академия (426034, РФ, г. Ижевск, ул. Коммунаров, д. 281)
2 К. м. н., врач, клинической лабораторной диагностики, ГУ Удмуртский Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями (426067, РФ, г. Ижевск, ул. Труда, д. 17а)
3 Д. м. н., заместитель директора по научным, вопросам, ФГУ Российский НИИ гематологии и трансфузиологии (191024, РФ, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д. 16)
Адрес для переписки: 426034, РФ, г. Ижевск, ул. Коммунаров, д. 281, ГОУ ВПО Ижевская государственная медицинская академия, Шишкин Александр Валентинович, e-mail: Shishkin_lab@mail.ru
В последние годы созданы иммунологические биочипы, позволяющие одновременно определять множество поверхностных антигенов на разных клетках. Анализ с помощью биочипов может быть дополнен другими исследованиями тех же самых клеток. При использовании биочипов, изготовленных на прозрачных и химически стойких подложках, связавшиеся клетки могут быть подвергнуты окрашиванию и микроскопическому исследованию в проходящем свете. Показана возможность проведения различных цитохимических исследований клеток, связавшихся с биочипами. Такой подход значительно повышает информативность анализа. Его использование должно быть особенно перспективным при исследовании клеток миелоидных опухолей.
Ключевые слова: иммунологический биочип, определение поверхностных антигенов клеток, цитохимическое исследование клеток.
Перспективным направлением иммунодиагностики является исследование клеток с использованием иммунологических биочипов (микроматриц) [1—7]. Подобный анализ не требует применения дорогостоящего оборудования, позволяя при этом определять множество различных поверхностных антигенов на разных клетках при очень низком расходе антител. Иммунологический биочип данного класса представляет собой твердую подложку, на которой в строго определенных участках («пятнах») иммобилизованы молекулы антител, специфичных к определяемым поверхностным антигенам клеток. Принцип анализа основан на связывании клеток, имеющих данные антигены, в области пятен биочипа.
Ранее было показано [6; 7], что при использовании биочипов, изготовленных на прозрачных химически стойких подложках, возможно выполнение окрашивания связанных клеток по Романовскому—Гимзе и проведения их морфологического исследования. Это зна-
© Шишкин А. В., Овчинина Н. Г., Бессмельцев С. С., 2011 УДК 616-006.446.8-036.11-097.1:57.083.3
чительно повышает информативность анализа. Однако такой подход не всегда позволяет достаточно точно идентифицировать разные субпопуляции клеток, имеющих те или иные одинаковые антигены и близкие морфологические характеристики. Представляется возможным более детальное исследование субпопуляций клеток при их цитохимическом окрашивании. Это должно оказаться востребованным, в первую очередь, при исследовании клеток миелоидных опухолей. Целью данной работы является демонстрация такой возможности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Изготовление биочипов
Для изготовления биочипов были использованы подложки из прозрачного пластика, на которых в строго определенных участках были адсорбированы мышиные моноклональные антитела (IgG), специфичные к следующим поверхностным антигенам лейкоцитов человека: CD11b, CD13, CD14, CD15, CD33, CD34, CD38, CD41, CD42b, CD65, CD44, CD45, НЬА^. Капли растворов антител объемом 0,25 мкл наносили на подложки в строго определенные участки. Затем подложки помещали в
камеру со 100% влажностью и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего высушивали на воздухе и замораживали при температуре —26 °С в герметичных контейнерах с осушителем. При таком хранении биочипы не теряли своих свойств по меньшей мере в течение 12 мес.
сущность исследования
Были исследованы 2 образца суспензии клеток, выделенных из периферической крови больных с предварительным диагнозом «острый миелоидный лейкоз» (ОМЛ). При исследовании каждого образца использовали набор из 6 одинаковых биочипов. Клетки, связавшиеся с каждым из биочипов № 1—5, после фиксации обрабатывали реагентами для осуществления нужной цитохимической реакции: биочип № 1 — реакция для обнаружения миело-пероксидазы; биочип № 2 — реакция с суданом черным-Б для обнаружения липидов; биочип № 3 — реакция для обнаружения а-нафтилацетатэстеразы и нафтол-AS-D-хлорацетатэстеразы; биочип № 4 — ШИК-реакция; биочип № 5 — реакция для обнаружения кислой фосфатазы. На биочипе № 6 цитохимические реакции не осуществляли. Вместо этого связавшиеся клетки после фиксации окрашивали по Романовскому—Гимзе.
Приготовление клеточной суспензии
Лейкоциты были выделены из периферической крови путем центрифугирования в градиенте плотности. Затем клетки трижды отмывали 0,9% раствором NaCl и ресуспензировали в растворе, содержащем 0,1% сухого молока, 20% (по объему) инактивированной нагреванием человеческой сыворотки и 1,5 мМ ЭДТА в PBS.
Подготовка биочипа к проведению анализа
После разморозки каждый биочип закрепляли в специально изготовленной кювете объемом 1 мл, ополаскивали 1% раствором BSA в буфере PBS, затем проводили трехкратную отмывку 0,05% раствором детергента Tween-20 на шейкере. После этого биочипы обрабатывали 1% раствором BSA в PBS при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем вновь отмывали раствором детергента и ополаскивали буфером.
Инкубация биочипа с клеточной суспензией и его отмывка
В кювету с каждым биочипом вносили суспензию клеток и инкубировали в течение 60 мин без перемешивания. Концентрация клеток и объем суспензии подбирали таким образом, чтобы при оседании клеток происходило полное заполнение ими поверхности биочипа. После завершения инкубации для устранения клеток, не связавшихся в участках с иммобилизованными антителами, биочипы несколько раз ополаскивали PBS. Качество отмывки оценивали при помощи стереомикроскопа МБС-1. Отмывку считали выполненной качественно, если клетки отсутствовали в участках подложки, не содержащих иммобилизованных антител, но оставались в области участков с иммобилизованными антителами. После завершения отмывки из кюветы осторожно удаляли избыток жидкости и осуществляли фиксацию связанных с биочипом клеток.
Фиксация и окрашивание связанных с биочипом клеток
Для исследования одного и того же образца клинического материала в данной работе использовали несколько одинаковых биочипов. Фиксацию и окрашивание связанных с ними клеток выполняли разными способами.
При проведении исследования с применением биочипов за основу были взяты общепринятые методики цитохимического окрашивания клеток [8; 9] в цитологических препаратах.
1. Окрашивание связанных с биочипом клеток для определения миелопероксидазы
Приготовление рабочего раствора. Смешивали 80 мг бензидина, 100 мл 70% этанола и 0,5 мл 5% раствора Н2О2.
Фиксация и окрашивание. Биочип со связанными клетками в течение 10—15 с фиксировали смесью (9:1) 95% этанола и 40% формалина, затем ополаскивали водой и высушивали на воздухе. После этого в течение 15—20 мин биочип обрабатывали свежеприготовленным рабочим раствором и промывали водой. Затем биочип обрабатывали красителем Романовского в течение 10— 20 мин, ополаскивали дистиллированной водой и высушивали.
2. Окрашивание связанных с биочипом клеток для определения липидов
Приготовление рабочего раствора. 1,5 мл раствора (3 мг/мл) красителя судан черный-Б в этаноле смешивали с 1 мл фенольного буфера, который готовился из расчета (1,6 г кристаллического фенола, растворенного в 3 мл этанола, + 0,03 г №2НР04-12Н20 в 10 мл дистиллированной воды).
Фиксация и окрашивание. Биочип фиксировали в парах формалина в течение 10 мин, а затем выдерживали на воздухе в течение 15 мин. После этого биочип обрабатывали рабочим раствором в течение 1 ч, после чего в течение 30 с выдерживали в 70% этаноле. Такую промывку выполняли трижды с заменой этанола. Затем биочип промывали водой и высушивали. Затем дополнительно окрашивали по Маю—Грюнвальду—Гимзе. Вновь промывали биочип водой и высушивали его на воздухе.
3. Окрашивание связанных с биочипом клеток для последовательного определения а-нафтилацетатэстеразы и нафтол-AS-D-хлорацетатэстеразы
Фиксирующий раствор. 2 мг №2НР04 и 10 мг КН2РО4 в 3 мл дистиллированной воды + 4,5 мл ацетона + 2,5 мл 40% формалина.
Приготовление рабочего раствора-1. 0,1 мл раствора (20 мг/мл) а-нафтилацетата в этиленмонометиловом эфире добавляли к 1,9 мл 66 ммоль/л фосфатного буфера рН 6,3. Затем при тщательном перемешивании добавляли 0,4 мл свежеприготовленного раствора гексанитрита парарозанилина.
Приготовление рабочего раствора-11. 0,1 мл раствора (2,5 мг/мл) нафтол-AS-D-хлорацетата в NN диметилформамиде добавляли к 1,9 мл 66 ммоль/л фосфатного буфера рН 7,4. При тщательном перемешивании добавляли 0,5 мг прочного синего-ВВ.
Фиксация и окрашивание. Биочип со связавшимися клетками в течение 30 с фиксировали холодным буферным формалиноацетоновым раствором, промывали водой и высушивали на воздухе. Биочип 40 мин обрабаты-
вали рабочим раствором-I, осторожно промывали водой и высушивали на воздухе. После этого биочип в течение 10 мин обрабатывали рабочим раствором-II и промывали водой. Затем дополнительно докрашивали биочип водным раствором гематоксилина в течение 1—3 мин, еще раз промывали водой и высушивали на воздухе.
4. Окрашивание связанных с биочипом клеток для определения гликогена (ШИК-реакция)
Биочип в течение 10 мин фиксировали смесью (9:1) 95% этанола и 40% формалина, промывали дистиллированной водой и высушивали. Затем в течение 10 мин биочип обрабатывали 1% раствором йодной кислоты, вновь промывали дистиллированной водой и высушивали. Далее обрабатывали биочип реактивом Шиффа в течение 30 мин и промывали водой. После этого проводили дополнительне окрашивание гематоксилином в течение 15 мин. Еще раз промывали биочип проточной водой и высушивали на воздухе.
5. Окрашивание связанных с биочипом клеток для выявления кислой фосфатазы
Приготовление рабочего раствора. Смешивали 20 мг нафтол-Ав-фосфата, 0,5 мл диметилформамида, 40 мл 0,1Н раствора ацетата натрия, 8 капель 4% раствора парарозанилина в 2Н НС1, 8 капель 4% водного раствора нитрита натрия. Доводили рН до 5,2—5,4, добавляя 0,1Н НС1.
Фиксация и окрашивание. Биочип фиксировали смесью (9:1) 95% этилового спирта и 40% формалина в течение 30 с, а затем высушивали на воздухе. Затем биочип обрабатывали свежеприготовленным рабочим раствором в течение 2 ч в темноте при температуре + 37 °С и промывали проточной водой. Выполняли дополнительное окрашивание гематоксилином Майера в течение 15 мин. После этого промывали биочип проточной водой и высушивали.
6. Окрашивание связанных с биочипом клеток по Романовскому—Гимзе
Биочип фиксировали метанолом в течение 12 мин и высушивали на воздухе. Затем биочип обрабатывали раствором азура и эозина, промывали водой и высушивали.
Приготовление из биочипов долговременных препаратов для микроскопического исследования
Каждый биочип заключали между тщательно обезжиренными предметным и покровным стеклами в композицию для приготовления гистологических препаратов «Shandon-Mount» («Thermo-electron corporation», США). Препарат помещали под пресс до затвердевания.
Считывание и обработка результата
С помощью установленного на микроскопе цифрового фотоаппарата каждое пятно биочипа фотографировали при малом (х80) и большом (х1000) увеличении. В каждом пятне биочипа определяли плотность связывания клеток — отношение количества клеток к площади исследуемого участка поверхности пятна. При этом изучали не менее 3 участков размерами 100 х 100 мкм. Полученные значения усредняли и выражали в процентах. За 100% принимали среднюю плотность связывания клеток в области пятна с антителами, специфичными к антигену CD45, в которых связываются практически все типы лейкоцитов. Ранее было показано [6; 7], что выраженные в процентах значения плотности связывания
клеток численно совпадают с фактическим процентным содержанием клеток, имеющих данные антигены. Это условие выполняется, если инкубация биочипа с клеточной суспензией осуществлялась без перемешивания. Оценку результата цитохимического исследования осуществляли, просматривая микрофотографии участков каждого пятна биочипа, полученные на большом увеличении.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Морфологическое исследование первого образца суспензии клеток (на биочипе № 6, окрашенном по Романовскому—Гимзе) показало, что в области пятен с антителами, специфичными к антигенам CD11b, CD13, CD14, CD15, CD33, CD34, CD38, CD44, CD45, CD65, HLA-DR, преобладают клетки, которые могут быть охарактеризованы как бласты. Связывание этих клеток в области пятен с антителами, специфичными к антигенам CD13, CD14, CD15, CD33, CD65, свидетельствует об их принадлежности к миелоидному ростку кроветворения. На данном биочипе была проведена оценка процентного содержания клеток, имеющих каждый из определяемых поверхностных антигенов (рис. 1).
При микроскопическом исследовании клеток, связанных на тех биочипах, где выполнялись цитохимические реакции, было установлено, что результаты реакций на миелопероксидазу (биочип № 1), кислую фосфатазу (биочип № 5), на липиды (биочип № 2) (рис. 2, А), а также результат ШИК-реакции (биочип № 4) (рис. 2, Б) были положительными. Продуктами ШИК-реакции (биочип № 4) и реакции на кислую фосфатазу (биочип № 5) клетки окрашивались диффузно. Комбинированная обработка реагентами для выявления а-нафтилэстеразы и хлораце-татэстеразы (биочип № 3) позволила выявить 2 типа клеток — монобласты и миелобласты.
На основании полученных данных можно сделать заключение, что больная страдает острым миеломоно-бластный лейкозом (ОМЛ, М4 по классификации FAB).
Второй образец суспензии клеток был исследован с помощью точно такого же набора биочипов. Проведение морфологического исследования клеток на биочипе № 6, окрашенном по Романовскому—Гимзе, показало, что в области пятен с антителами, специфичными к антигенам CD11b, CD13, CD33, CD38, CD44, CD45, преобладают клетки с азурофильными гранулами, одним или двумя ядрышками, напоминающие промиелоциты. Связывание этих клеток в области пятен с антителами, специфичными к антигенам CD13, CD33, также свидетельствовало об их отношении к миелоидному ростку кроветворения. При оценке содержания клеток, имеющих определяемые поверхностные антигены (см. рис. 1), было отмечено высокое содержание CD11b-, CD13-, CD33-положительных клеток и низкое содержание клеток, имеющих антигены CD14, CD15, CD34, CD42b, CDw65, HLA-DR.
При микроскопическом исследовании клеток, связанных на тех биочипах № 1—5, где выполнялись цитохимические реакции, было установлено следующее. Результат реакций на миелопероксидазу (биочип № 1) и на липиды (биочип № 2) был резко положительным у большей части клеток, связавшихся в области пятен с антителами, специфичными к антигенам CD11b, CD13, CD33, CD38, CD44, CD45. При проведении ШИК-реакции (биочип № 4)
100 90 80 ^ 70
*
g 60
I 50 s
1 40 а g 30 О
20
10
гЙ
к л
II
&_
А
r^-г^п
I II
111 x I
i i
II
_±_
CD11b CD13 CD14 CD15 CD33 CD34 CD38 CD41 CD42b CD44 CD45 CD65 HLA-DR
Антиген
Рисунок 1. Результаты определения содержания клеток, экспрессирующих различные поверхностные антигены. I — образец № 1; II — образец № 2.
II
I
II
II
II
II
II
I
II
0
окрашивание большинства клеток, связанных в аналогичных пятнах, было умеренно выраженным. Продуктом реакции диффузно окрашивалась цитоплазма клеток.
При проведении реакции на кислую фосфатазу (биочип № 5) большинство клеток, связанных в соответствующих пятнах, окрашивалось слабо или не окрашивалось совсем. Тем не менее продуктом реакции окрашивалось небольшое (1—4%) количество клеток в различных пятнах биочипа. По-видимому, это были нормальные клетки, которые также содержатся в исследуемом образце.
При комбинированном цитохимическом окрашивании на хлорацетатэстеразу и а-нафтилацетатэстеразу (на биочипе № 3) отмечалось выраженное окрашивание клеток продуктом, характерным для реакции на хлораце-татэстеразу. Окрашивание на а-нафтилацетатэстеразу у большинства клеток, связанных в данных тестовых участках, было выражено очень слабо или отсутствовало.
На основании перечисленного можно сделать заключение, что больной страдает острым промиелоцитарным лейкозом (ОМЛ, М-3 по классификации FAB).
'W §
»
#
V?
• •
* • щ m *• * *
А
Рисунок 2. Микрофотографии выделенных из крови больной острым миеломонобластным лейкозом (ОМЛ, М-4) клеток, связавшихся на двух разных биочипах в области пятен с антителами анти-CD13.
А. Выявление липидов путем окрашивания клеток Суданом черным-Б (х600). Б. Выявление гликогена (ШИК-реакция) (х600).
обсуждение
Результаты иммунологического исследования, выполненного на биочипе, отражают высокое содержание клеток, экспрессирующих характерные для данных форм ОМЛ антигены [10; 11]. Вместе с тем дополнительные морфологическое и цитохимические исследования связанных с биочипами клеток позволили достаточно полно охарактеризовать их. Приведенные примеры свидетельствуют, что такой подход позволяет более четко различать разные типы клеток, экспрессирующие одни и те же поверхностные антигены. Проведение нескольких различных дополнительных цитохимических исследований связанных с биочипом клеток позволяет более надежно идентифицировать клетки различных вариантов ОМЛ по сравнению с окрашиванием только по Романовскому— Гимзе. Тем не менее окрашивание по Романовскому— Гимзе связанных клеток на дополнительном биочипе является целесообразным. Это обусловлено универсальностью данного способа окрашивания и возможностью лучшего изучения разных типов клеток при проведении морфологического исследования.
Описанный в данной статье подход позволяет избежать возможных противоречий между результатами цитохимического и иммунологического исследований, поскольку проводятся они на одних и тех же клетках.
При внедрении данного метода в практику использование нескольких одинаковых биочипов со связанными клетками для выполнения разных видов цитохимических исследований не должно приводить к существенному повышению стоимости анализа. Это обусловлено тем, что стоимость биочипов при налаживании их серийного производства должна быть весьма низкой.
ЛИТЕРАТУРА
1. Chang T. W. Binding of cells of distinct antibodies coated on solid surface // J. Immunol. Methods. — 1983. — Vol. 65. — P. 217—223.
2. Immunophenotyping of leukemias using a cluster of differentiation antibody microarray / Belov L., de la Vega O., dos Remedios C. G., Mulligan S. P., Christopherson R. I. // Cancer Res. — 2001. — Vol. 61. — P. 4483—4489.
3. Screening microarrays of novel monoclonal antibodies for binding to T-, B- and myeloid leukaemia cells B / Belov L., Huang P., Chrisp J. S., Mulligan S. P., Christopherson R. I. // J. Immunol. Methods. — 2005. — Vol. 305. — P. 10—19.
4. Ko I. K., Kato K., Iwata H. Antibody microarray for correlating cell phenotype with surface marker // Biomaterials. — 2005. — Vol. 26. — P. 687—696.
5. Liu A. Y. Differential Expression of Cell Surface Molecules in Prostate Cancer Cells // Cancer Res. — 2000. — Vol. 60. — P. 3429— 3434.
6. Иммунологические биочипы для параллельного определения поверхностных антигенов и морфологического исследования клеток / Шишкин А. В., Шмырев И. И., Кузнецова С. А., Овчинина Н. Г., Бутылин А. А., Атауллаханов Ф. И., Воробьев А. И. // Биол. мембраны. — 2008. — № 4. — С. 277—284.
7. Шишкин А. В. Иммунологические биочипы для исследования клеток. Собственный опыт разработки. Некоторые новые подходы к проведению анализа. — Saarbrucken: Lambert Academic Publishing, 2010. — 158 с.
8. Льюис С. М., Бэйн Б., Бэйтс И. Практическая и лабораторная гематология: Пер. с англ. / Под ред. А. Г. Румянцева. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. — 672 с.
9. Атлас клеток крови и костного мозга / Под ред. Г. И. Козин-ца. — М.: Триада-Х, 1998. — 160 с.
10. Руководство по гематологии: в 3 т. Т. 1 / Под ред. А. И. Воробьева. — М.: Ньюдиамед, 2002. — 280 с.
11. Луговская С. А., Почтарь М. Е., Тупицын Н. Н. Иммунофено-типирование в диагностике гемобластозов. — М. — Тверь: Триада, 2005. — 168 с.
Поступила 01.06.2011
Alexander Valentinovich Shishkin1, Natalia Gennadievna Ovchinina2, Stanislav Semenovich Bessmeltsev3
COMBINED IMMUNOLOGICAL AND CYTOCHEMICAL STUDY OF ACUTE MYELOID LEUKAMIA CELLS USING IMMUNOLOGICALO BIOCHIPS
1 MD, PhD, Head, Teaching and Experiment Laboratory, Izhevsk State Medical Academy (281, ul. Kommunarov, Izhevsk, 426034, RF)
2 MD, PhD, Physician, Clinical Laboratory Diagnosis Department, Udmurtia Republican. AIDS and Infectional
Diseases Center (17a, ul. Truda, Izhevsk, 426067, RF)
3 MD, PhD, DSc, Deputy Director for Science, Russian Hematology and Transfusiology Research. Institute (16, ul. 2 Sovetskaya, Sanct-Peterburg, 191024, RF)
Address for correspondence: Shishkin Alexander Valentinovich; Teaching and Experiment Laboratory, Izhevsk State Medical Academy (281, ul. Kommunarov, Izhevsk, 426034, RF; e-mail: Shishkin_lab@mail.ru
Immunological biochips have been recently developed to identify simultaneously multiple surface antigens on various cells. Biochip analysis may be supplemented with other tests of the same cells. Biochips on transparent and chemically stable substrates may be used for staining and microscopy of binding cells. Biochip-bound cells may be studied using various cytochemical tests. This approach increases considerably informative value of testing. It seems especially promising in study of myeloid tumor cells.
Key words: immunological biochip, cell surface antigen identification, cell cytochemical study.
