CC BY
15
Є
Продуценты гиполипидемических соединений с антиоксидантной активностью
Т. О. ПУЖЕВСКАЯ1, Н. Э. ГРАММАТИКОВА2, М. В. БИБИКОВА2, А. В. КАТЛИНСКИЙ3
' Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова, Москва
2 Государственный научный центр по антибиотикам, Москва
3 Московская медицинская академия им. М. И. Сеченова, Москва
Organisms Producing Hypolipidemic Compounds with Antioxidant Activity
T. O. PUZHEVSKAYA, N. E. GRAMMATIKOVA, M. V. BIBIKOVA, A. V. KATLINSKY
I. I. Mechnikov State Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow National Research Centre of Antibiotics, Moscow M. I. Sechenov Moscow Medical Academy, Moscow
Отобраны комплексные препараты , продуцируемые грибныши культурами родов Ьесапісіїіит и Веаигепа, проявляющие высокую гиполипидемическую и антиоксидантную активности одновременно. Выщелены две фракции гиполипидемических соединений, антиоксидантная активность который составляла 95 и 75% в дозе 25 мкг/мл.
Ключевые слова: гиполипипидемические соединения, антиоксидантная активность.
Complex compounds produced by fungal cultures of Lecanicilium and Beauveria with both high hypolipidemic and antioxydant activities were screened. Two fractions of the hypolipipidemic compounds with antioxidant activity of 95 and 75% in a dose of 25 mcg/ml were isolated.
Key words: hypolipidemic compounds, antioxidant activity.
Активация процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ) играет ведущую роль в патогенезе многих заболеваний: миокардиальной и церебральной ишемии, диабета, ревматоидного артрита, канцерогенеза, возрастных процессов, атеросклероза [1—3].
Известно, что основным условием развития атеросклероза является отложение холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в суб-интимальное пространство артериальной стенки [4]. При свободнорадикальном окислении происходит модификация структуры циркулирующих в плазме крови ЛПНП, вследствие чего они приобретают большую атерогенность и усиленно захватываются макрофагами стенки сосудов. Защита ЛПНП от окисления осуществляется в основном восстановленной формой убихинона О10 — уби-хиноном О10. Установлено, что статины блокируют синтез холестерина на уровне образования ме-валоновой кислоты, попутно подавляя синтез других биологически активных субстанций, в том числе и убихинона [5]. Применение статинов при терапии атеросклероза повышает атерогенность
© Коллектив авторов, 2009
Адрес для корреспонденции: 11У105 Москва, ул. Нагатинская, д. За. ГНЦА
ЛПНП. Кроме того, подавление биосинтеза убихинона Q10, выполняющего функцию переноса электронов в митохондриальной дыхательной цепи, сопровождается снижением синтеза АТФ, вследствие чего у пациентов с ИБС, активно принимающих статины содержание АТФ в миокарде снижается на 14%. Результаты этих исследований свидетельствуют о прооксидантном действии ингибиторов бета-гидрокси-бета-метилглутарил-коэнзим А-редуктазы (статинов) и о возможности предотвращения этого эффекта путём введения антиоксидантов [6].
При ранее проведённых исследованиях нами были отобраны продуценты новых гиполипидемических соединений, показана способность комплексных препаратов, выделенных из мицелия продуцентов в условиях in vivo снижать уровень в крови животных холестерина, триглицеридов, ЛПНП и повышать уровень ЛПВП [7].
Учитывая роль окислительного стресса в патогенетических механизмах развития атеросклероза, перспективным представляется скрининг природных соединений комплексного действия, нормализующих уровень липидов в организме и снижающих образование высокореактивных свободных радикалов кислорода.
Є
Таблица 1. Антиоксидантная активность комплекса 169 (подавление перекисного окисления липидов)
Концентрация препарата 16-9, мкг/мл Ингибирование ПОЛ, %
400 91
200 86
100 76
50 44
25 30
Материал и методы
Объектом исследования служили экстракты, полученные из штаммов грибов рода Вваыувпа № 161, № 162, № 164 и рода ЬвсатсШыш Бр. № 169, выделенных из почвы Тебердинско-го заповедника.
Культивирование грибов для получения биологически активных веществ осуществляли при глубинном культивировании в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 200 мл питательной среды А9 [8]. Ферментацию проводили на круговой качалке с частотой вращения от 3,3 с-1 до 4,3 с-1 при 24°С, в течение 14 сут.
По окончании ферментации мицелиальную массу отделяли центрифугированием. Активные соединения извлекали из биомассы ацетоном. Ацетоновые экстракты концентрировали на ротационном вакуумном испарителе (ИР-1) до водного остатка. Биологически активные вещества переводили в петролейный эфир или хлороформ. Экстракты концентрировали на вакуумном испарителе (ИР-1), осадки высушивали. Компонентный состав полученных таким образом препаратов исследовали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках 8!1иЫ (производства фирмы КауаЦег,Чехия), в системе растворителей петролейный эфир — ацетон (1,5 : 1). Дальнейшую очистку препаратов для получения активных фракций осуществляли хроматографическими методами.
Для изучения антиоксидантных свойств суммарных препаратов и отдельных фракций использовали методы для гидрофобных и гидрофильных систем.
Для гидрофобной системы (реакция подавления перекисного окисления липидов) применяли модифицированный нами метод, основанный на образовании малонового диальдегида при окислении субстрата (льняное масло) в присутствии инициаторов Ре2+/аскорбат (по реакции Фентона) [9,10]. После добавления в реакционную смесь ингибиторов окисления субстрата изменение интенсивности окраски оценивали спектрофотометрически при длине волны 532 нм. В качестве внутреннего контроля использовали раствор а-токоферола в концентрации 500 мкг/мл, ингибиторное действие которого в условиях эксперимента составило 78%.
Учитывая, что образуемые комплексные препараты состояли из отдельных фракций, которые могли проявлять как гидрофобные, так и гидрофильные свойства, был применен второй метод оценки антиоксидантной активности (АОА).
Рис. 1. Подавление оксидации препаратом № 169 в различных дозах.
Использовали метод, разработанный КвЫшШ еі а1. [11] и позволяющий оценить изучаемые вещества по способности «захвата» супероксид аниона (^2). Метод основан на восстановлении нитросинего тетразолия (КВТ) в присутствии НАДН, активированного феназинметосульфатом (РМ5). Интенсивность окраски реакционной смеси измеряли спектрофотометрически при длине волны 560 нм. В качестве внутреннего контроля использовали аскорбиновую кислоту, подавление оксидации которой в концентрации 50 мкг/мл составляло 60%.
Антиоксидантное действие испытуемых препаратов выражали в %, расчёт проводили по формуле:
% иіігибиции = ((А -А1)/А0) X 100%, где
Ад — проба без препарата (контроль), Аі — проба, содержащая исследуемый образец препарата.
Результаты и обсуждение
По литературным данным известно, что большинство антиоксидантов проявляют действие в определённом диапазоне концентраций и в некоторых условиях способны вместо подавления свободнорадикальных реакций вовлекаться в их дальнейшее развитие [12, 13]. Важным условием постановки эксперимента по выявлению АОА препаратов является выбор методики и диапазона концентраций, при которых они проявляют максимальную активность.
При изучении комплексного препарата № 169 выявлено его ингибирующее действие на пере-кисное окисление липидов. В табл. 1 представлены данные, отражающие результаты проведённых исследований.
Как видно из представленных данных, комплексный препарат № 169 проявляет АОА и плавную динамику изменения её значения в зависимости от концентрации. По результатам полученной зависимости для выделения активных фракций использовали в качестве отправной точки концентрацию 25 мкг, предполагая, что их ингибирующее действие на перекисное окисление будет значительно выше комплекса.
При изучении препарата № 169 методом определения АОА для гидрофильных веществ (удаление супероксид аниона из реакционной системы), подавление оксидации наблюдалось только при введении препарата в дозе 400 мкг/мл (рис. 1).
В более низких дозах наблюдалась выраженная прооксидантная активность, что позволило сделать предположение о наличии в комплексе компонента с выраженной прооксидантной активностью.
Из мицелия грибов рода Вєаиуєгіа № 161, № 162, № 164 были получены комплексные пре-
□ комплекс 169
дота оорагца (мкг)
Є
Таблица 2. Антиоксидантная активность комплексных препаратов из грибов рода Beauveria
Изучаемый комплекс из грибов рода Бєаиуєгіа (25 мкг/мл) Ингибиция, %
161 -1,6
162 46
164 31,5
Таблица 3. Антиоксидантная активность комплекса 169 и его отдельных фракций
Изучаемый образец (25 мкг/мл) Ингибиция, %
169 комплекс 32,5
Фракция на уровне витамина Д по данным ТСХ 70
Витамин Д аптечный 0
ГФК+эргостерол+фракция жиров 37,5
ГФК -20
ГФК+фракция жиров 48
Эргостерол -15,3
Фракция жирных кислот 68
Эфиры жирных кислот 0
Фракция 14+фракция 13 10
Фракция 14 12
Фракция 13 -21,5
Фракция 11 47
Фракция 10 95
параты и определена их АОА по способности ингибировать перекисное окисление липидов. Среднее значение по результатам трёх опытов приведено в табл. 2.
Из данных табл. 2 видно, что комплексный препарат № 161 обладает небольшой прооксидантной активностью, АОА комплексного препарата № 162 составила 46%, препарата № 164 — 31,5%. При измерении АОА методом для гидрофильных веществ (удаление супероксид аниона из реакционной системы) подавления оксидации не наблюдалось.
Рис. 2. Схематическое изображение фракционного состава комплексного препарата № 169, выявленного методом ТСХ.
В результате проведённых экспериментов были отобраны комплексные препараты № 169, № 162 и № 164 с антиоксидантной активностью.
Изучение фракционного состава комплексных препаратов осуществляли методом ТСХ. В качестве контроля на пластинку наносили известные соединения с аналогичной хроматографической подвижностью, предполагая возможность их присутствия в исследуемых препаратах
Комплексный препарат № 169 исследовали с помощью метода ТСХ в системе растворителей: петролейный эфир — ацетон (1,5 : 1) на пластинах 8Ии1Ы 254 иУ. Было обнаружено наличие большого количества компонентов в экстракте этого препарата: фракции, по хроматографической подвижности (Ш) сходной с витамином Д, голубого флюоресцирующего компонента, эргостерола, фракций, обозначенных нами 10 и 11, а также фракций 14. При проявлении хроматограммы парами йода была обнаружена фракция 13. Схематическое изображение хроматограммы воспроизведено на рис. 2.
Разделение и накопление фракций комплексного препарата № 169 проводили совместно с Да-ниленко А. Н. (Институт биохимической физики им. Н. М. Эммануэля) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Полученные индивидуальные фракции изучали на способность ингибировать образование перекисных радикалов. Полученные данные представлены в табл. 3.
Таким образом, комплексный препарат № 169 в дозе 25 мкг/мл ингибировал образование перекисных радикалов на 32,5%. Разделение комплекса позволило отобрать фракцию жирных кислот с АОА 68%; фракцию 10 и 11, АОА кото-
-О-
Є
Таблица 4. Антиоксидантная активность баверицина из комплекного препарата № 162
Концентрация активной фракции комплекса 162, мкг/мл Ингибиция, %
100 90
50 85
25 72
рых составляла 47 и 95% соответственно. Кроме того, получена фракция, сходная по хроматографической подвижности (Ш) с витамином Д и обладающая ингибирующей активностью в отношении пероксидных радикалов — 70%. Витамин Д не проявил антиоксидантной активности в эксперименте и использовался в качестве контроля для анализа активной фракции, хроматографическая подвижность которой совпадает с этим витамином.
После хроматографической очистки и разделения исходного комплексного препарата № 162, основная фракция по физико-химическим и структурным характеристикам (масс-спектрометрии, ядерного магнитного резонанса и парамагнитного резонанса) была определена как баверицин А (Даниленко А. Н., Затонский Г. В.).
Из литературных данных известно, что баверицин А является высокоактивным ингибитором ацил-КоА-холестерол-ацил-трансферазы (АХАТ), фермента который катализирует внутриклеточную этерификацию холестерина [14]. Продуцентами ингибиторов фермента АХАТ являются многие мицелиальные грибы [15,16]. Существует мнение, что АХАТ является одной из наиболее перспективных мишеней подавления развития гиперхолестеринемии. В нашем исследовании показано, что баверицины обладают также антиоксидантным действием. Очищенный баверицин А, выделенный из комплексного препарата № 162, был изучен на способность подавлять перекисное окисление в различных концентрациях (табл. 4).
Результаты эксперимента демонстрируют высокую активность выделенного соединения, входящего в состав комплекса № 162 как ингибитора липидной пероксидации.
ЛИТЕРАТУРА
Заключение
При изучении антиоксидантной активности комплексного гиполипидемического препарата № 169 выявлена способность подавлять как образование липидных пероксидов, так и супероксид-ных анионов. Показано, что АОА комплексного препарата № 169 в дозе 25 мкг/мл составляет 30%.
При изучении комплексного препарата № 169 по способности подавлять образования супероксид аниона, ингибирующий эффект наблюдался только в дозе 400 мкг/мл. Это дает основание предполагать, что фракции препарата № 169, отвечающие за АОА, обладают гидрофобными свойствами.
Выделены отдельные фракции комплекса № 169 с высокой антиоксидантной активностью: 10 и 11, фракция с Ш на уровне витамина Д и фракция жирных кислот. Все выделенные соединения обладают гидрофобными свойствами.
Максимальные антиоксидантные свойства при изучении экстрактов из мицелия грибов № 161, № 162, № 164 были выявлены у комплексного препарата № 162, АОА которого составляет 46% в концентрации 25 мкг/мл. Кроме того, была определена основная активная фракция комплекса № 162 — баверицин А, АОА этой фракции составляла 85% в дозе 50 мкг/мл и 75% в дозе 25 мкг/мл.
В результате проведённых исследований были отобраны фракции комплексных препаратов, продуцируемых грибными культурами, проявляющие высокую гиполипидемическую и антиоксидантную активности одновременно. В дальнейшем наиболее активные фракции (10 и 11) были исследованы на крысах на модели экспериментального атеросклероза и показали положительные результаты. Таким образом, исследование антиоксидантной активности является важной, а главное, доступной характеристикой выделяемых соединений при скрининге природных гиполипидемических соединений.
1. Болдъщв A. A., Юнeвa M. O., Copoкuнa E.B. и др. Антиоксидантные системы в тканях мышей с ускоренным темпом старения (SAM, Senescence Accelerated Mice). Биохимия 2001; 66: 115У—1163.
2. Бapceлъ B. A., Шeдpuнa И. С., Baxляeв B. Д. и др. ^стояние системы перекисного окисления липидов у больных ишемической болезнью сердца. Кардиология 1998; 5: 18—20.
3. Lusis A. J., Fogelman A. M., Fonarow G. C. Genetic Basis of Atherosclerosis: Part II. Clinical Implications. Circulation 2004; 110: 2066—2071.
4. J^auKun B. З. Tuxa3e A. К., К^инный A. И., Бeлeнкoв Ю. H. Антиоксиданты и атеросклероз: Критический анализ проблемы и направление дальнейших исследований. Патогенез 2004; 1: У1—86.
5. Лaнкuн B. З., Twca3e A. К., Бeлeнкoв Ю. Н. Антиоксиданты в комплексной терапии атеросклероза: pro et contra. Кардиология 2004,
2, У2—81.
6. J^auKun B. З., Tuxa3e A. К., Kyxap4yK B. B. Cвoбoднoрацикальнoe окисление липопротеинов низкой плотности in vivo при терапии атеросклероза ингибиторами бета-гидрокси-бета-метилглутарил-коэнзим А-редуктазы (статинами) и защитное действие природных и синтетических антиоксидантов. VI Междунар. Конф. Биоантиоксидант. М.: 2002: 339—34.
У. Чмeлъ Я. B., Бuбuкoвa М. B., Cnupuдoнoвa И. A. и др. C^nnn^ природных соединений с гиполипидемической активностью. Антибиотики и химиотер 2004; 8—9: 8—12.
e
8. Бибикова М. В., Рыбакова А. М., Вострое С. Н., Иваницкая Л. П. Оптимизация состава ферментационной среды для биосинтеза циклоспорина штаммами 392 и 1096. Успехи в области изучения и производства антибиотиков. Труды института ВНЦА-ВНИИА. Выпуск XX. М.: 1991: 8-13.
9. Клебанов Г. И., Бабенкова И. В., Теселкин Ю. О. Оценка антиокис-лительных свойств плазмы крови с применением желточных ли-попротеидов.Лабораторное дело 1988; 3: 59—62.
10. Schuh J. Oxygen-mediatel heterogeneity of apolow density lipoprotein. Proc Natl Acad Sci 1978; 75: 3173—3179.
11. Nishikimi M., Appaji N., Yagi K. The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen. Biochem Biophys Res Commun 1972; 46: 849—854.
12. Барабай В. А., Бездробная Л. К. Изменения прооксидантно-анти-оксидантного гомеостаза у крыс при введении 7,12-диметил-1,2-бензантрацена. Экспериментальная онкология 1992; 14: 1: 40—43.
13. Зайцев В. Г., Островский О. В., Закревский В. И. Связь между химическим строением и мишенью действия как основа классификации антиоксидантов прямого действия. Эксперим клин фарма-кол 2003; 66: 4: 66—70.
14. Klaric M. S., Pepeljinjak S. Beauvericin. Chemical and biological aspects and occurrence. Arh Hig Rada Toxikol 2005; 56: 343—345.
15. Nozawa K. Biologically active indoloditerpene from Aspergillus and Penicillium. Ann Meet Mycol 1994: 10—11.
16. Yang D. J., Tomoda H., Tabata N. et al. New isochromophilones VII—IX inhibitors of acyl-CoA-cholesterol acyltransferase produced by Penicillium multicolor. J Antibiot 1996; 49: 3: 223—228.
