CC BY
7
© Коллектив авторов, 2023
Бязрова М.Г.1-3, Порошина А.С.1, Сухова М.М.12, Фролов Е.А.1,
Шилкина А.Б.1, Латышева Е.А.1, Латышева Т.В.1, Филатов А.В.1' 2
Продукция цитокинов наивными В-лимфоцитами и В-клетками памяти при стимуляции in vitro
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», 119234, г. Москва, Российская Федерация
3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 117198, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. В литературе довольно подробно описана роль отдельных цитокинов в индукции дифференцировки различных субпопуляций В-клеток в плазмабласты и плазматические клетки. В то же время остается малоизученным вопрос о том, какие цитокины продуцируют сами В-лимфоциты и их субпопуляции.
Цель исследования - определить цитокиновый профиль В-лимфоцитов человека при стимуляции in vitro. В задачи исследования также входило сравнительное изучение спектра цитокинов, секретируемых наивными В-лимфоцитами, а также В-клетками памяти с переключенным и непереключенным синтезом Ig.
Материал и методы. Субпопуляции наивных В-лимфоцитов, а также В-клеток памяти с переключенным (IgG+CD27+) и непереключенным (IgM+CD27+) синтезом Ig выделяли с помощью проточного сортировщика клеток. Выделенные В-лимфоциты стимулировали in vitro в присутствии экзогенного ИЛ-21 и фидерных клеток, несущих молекулу CD40L. Супернатанты, собранные от стимулированных В-клеток, анализировали на наличие цитокинов. Исследование носило скрининговый характер. Чтобы охватить максимально широкую панель цитокинов, в работе использовался высокопроизводительный метод мультиплексного анализа. В тестируемую панель входили следующие цитокины: ЭФР, эотаксин, Г-КСФ, ГМ-КСФ, ИФН-а2, ИФН-у, ИЛ-10, ИЛ-12Р40, ИЛ-12Р70, ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-17А, ИЛ-1ЯЛ, ИЛ-1а, ИЛ-1Р, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, IP-10, MCP-1, MIP-1a, MIP-1P, RANTES, ФНОа, ФНОр, VEGF, ФРФ-2, ТФРа, Flt-3L, фракталкин, GRO, MCP-3, MDC, PDGF-AA, PDGF-AB/BB и ИЛ-9.
Результаты. Были получены и функционально охарактеризованы 3 субпопуляции стимулированных В-лимфоцитов: наивные В-лимфоциты, В-клетки памяти с переключенным (IgG+CD27+) и непереключенным (IgM+CD27+) синтезом Ig. Стимулированные В-лимфоциты характеризовались активной пролиферацией, приобретали фенотип плаз-мабластов и секретировали Ig. В-лимфоциты, стимулированные in vitro в системе ИЛ-21/ CD40L, продуцировали широкий спектр цитокинов. В наибольшей степени секретиро-вались IP-10, MDC и MCP-1. Секреция ИЛ-nA, HH-12P70, ТФРа, ИФН-у, ИЛ-3, ИЛ-5 и ИЛ-1Р была ниже уровня детекции. Наивные В-клетки секретировали цитокины ИЛ-10, MCP-3, MDC, ИЛ-1а, MCP-1, ФНОа и ФНОр более активно, чем В-клетки памяти. Для цитокинов ИЛ-10, MDC, MCP-1, ФНОа и ФНОр значимая разница прослеживалась в отношении обеих субпопуляций В-клеток памяти. Для MCP-3 значимая разница наблюдалась только в отношении В-клеток памяти с переключенным синтезом Ig, а для ИЛ-1а -только по сравнению с В-клетками памяти с непереключенным синтезом Ig.
Заключение. Определены цитокиновые профили активированных В-лимфоцитов и их субпопуляций. Полученные результаты показывают, что продукция цитокинов В-клетками в значительной степени зависит от активации и дифференцировки В-лим-фоцитов.
Ключевые слова: В-лимфоциты; стимуляция В-лимфоцитов; цитокины; система мультиплексного анализа Luminex; M.H-21/CD40L стимуляция; В-клетки памяти; плазмабласты; ELISPOT
Статья получена 03.08.2023. Принята в печать 27.08.2023.
Для корреспонденции
Филатов Александр Васильевич -доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: avfilat@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
Для цитирования: Бязрова М.Г., Порошина А.С., Сухова М.М., Фролов Е.А., Шилкина А.Б., Латышева Е.А., Латышева Т.В., Филатов А.В. Продукция цитокинов наивными В-лимфоцитами и В-клетками памяти при стимуляции in vitro. Иммунология. 2023; 44 (5): 575-585. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-5-575-585
Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-15-00289; https://rscf. ru/project/23-15-00289/.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Сбор и обработка материала - Бязрова М.Г., Порошина А. А., Сухова М.М., Шилкина А.Б.; написание текста, редактирование - Фролов Е.А., Филатов А.В.; окончательный вариант и целостность текста - Латышева Е.А., Латышева Т.В., Филатов А.В.
Byazrova M.G.1-3, Poroshina A.S.1, Sukhova M.M.1 2, Frolov E.A.1, Shilkina A.B.1, Latysheva E.A.1, Latysheva T.V.1, Filatov A.V.1 2
Production of cytokines by in vitro stimulated naive B lymphocytes and memory B cells
1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
2 M.V. Lomonosov Moscow State University, 119234, Moscow, Russian Federation
3 Peoples' Friendship University of Russia named after Patrice Lumumba of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, 117198, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Much attention is paid to the description of the role of individual cytokines in the induction of the differentiation of various subpopulations of B cells into plasmablasts and plasma cells. In contrast, little is known about which cytokines are produced by B-lymphocytes themselves and their subpopulations.
The aim of the study was to determine the cytokine profile of human B-lymphocytes during in vitro stimulation. The objectives of the study also included a comparative study of the spectrum of cytokines secreted by naive B-lymphocytes, as well as memory B-cells with switched and unswitched Ig synthesis.
Material and methods. Subpopulations of naive B-lymphocytes, as well as memory B-cells with switched (IgG+CD27+) and non-switched (IgM+CD27+) Ig synthesis were isolated using a flow cytometer. The isolated B lymphocytes were stimulated in vitro in the presence of feeder cells carrying the CD40L molecule and exogenous IL-21. Supernatants collected from stimulated B cells were analyzed for the presence of cytokines. The study was screening in nature. In order to cover the widest possible panel of lymphokines, a high-performance method of multiplex analysis was used in the work. The tested panel included the following lympho-kines: EGF, Eotaxin, G-CSF, GM-CSF, IFN-a2, IFN-y, IL-10, IL-12P40, IL-12P70, IL-13, IL-15, IL-17A, IL-1RA, IL-1a, IL-1P, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1a, MIP-1P, RANTES, TNFa, TNFp, VEGF, FGF-2, TGF-a, Flt-3L, Fractalkine, GRO, MCP-3, MDC, PDGF-AA, PDGF-AB/BB and IL-9.
Results. Three subpopulations of stimulated B lymphocytes were obtained and functionally characterized: naive B-lymphocytes, memory B cells with switched (IgG+CD27+) and unswitched (IgM+CD27+) Ig synthesis. Stimulated B lymphocytes were characterized by active proliferation, acquired the plasmablast phenotype and secreted Ig. B lymphocytes stimulated in vitro in the IL-21/CD40L system produced a wide range of cytokines. IP-10, MDC and MCP-1 were secreted to the greatest extent. The secretion of IL-17A, IL-12P70, TGFa, IFN-y, IL-3, IL-5 and IL-1P was below the level of detection. Naive B cells secreted the cytokines IL-10, MCP-3, MDC, IL-1a, MCP-1, TNFa and TNFp more actively than memory B cells. For the cytokines IL-10, MDC, MCP-1, TNFa, and TNFp, a significant difference was observed for both subpopulations of memory B cells. For MCP-3, a significant difference was observed only for memory B cells with switched Ig synthesis, and for IL-1a only when compared with memory B cells with unswitched Ig synthesis.
Conclusion. Cytokine profiles of activated B lymphocytes and their subpopulations were determined. The obtained results show that the production of cytokines by B cells is largely dependent on the activation and differentiation of B lymphocytes.
For correspondence
Alexander V. Filatov -Dr.Sci., PhD, Prof., Head of the Immunochemistry Laboratory of NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: avfilat@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
Keywords: B-lymphocytes; IL-21/CD40L stimulation; cytokines; Luminex assay; B memory cells; plasmablasts; ELISPOT
Received 03.08.2023. Accepted 27.08.2023.
For citation: Byazrova M.G., Poroshina A.S., Sukhova M.M., Frolov E.A., Shilkina A.B., Latysheva E.A., Laty-sheva T.V., Filatov A.V. Production of cytokines by in vitro stimulated naive B lymphocytes and memory B cells. Im-munologiya. 2023; 44 (5): 575-85. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-5-575-585 (in Russian)
Funding. The study was supported by the grant of Russian Science Foundation (RSF) No. 23-15-00289, https://rscf. ru/project/23-15-00289/.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Collection and processing of material - Byazrova M.G., Poroshina A.S., Sukhova M.M., Shilkina A.B.; text writing, editing - Frolov E.A., Filatov A.V.; the final version of the text - Latysheva E.A., Latysheva T.V., Filatov A.V.
Введение
Созревание и дифференцировка В-лимфоцитов представляет собой сложный многоступенчатый процесс [1]. Важные этапы созревания В-лимфоцитов проходят в зародышевых центрах вторичных лимфоидных органов, таких как селезенка и лимфатические узлы. Зародышевые центры представляют собой специализированные структуры, в которых В-клетки подвергаются быстрой пролиферации, соматической гипермутации и рекомбинации с переключением классов Ig и образованием высокоаффинных антител [2]. Во время созревания в зародышевых центрах В-клетки взаимодействуют с антиген-презентирующими клетками и Т-хелперами. Это взаимодействие приводит к отбору В-клеток с высокоаффинными рецепторами, что имеет решающее значение для их способности эффективно распознавать и нейтрализовать вторгшиеся патогены. Все эти процессы в значительной степени находятся под контролем антиген-специфических Т-хелперных (Th) клеток, а также антиген-презентирующих клеток. В-лимфоциты взаимодействуют с Th- и антиген-пре-зентирующими клетками с помощью межклеточных контактов с участием таких рецепторов, как CXCR5, PD-1, ICOS и CD40L [3], а также путем обмена цито-киновыми сигналами, включая интерлейкин-4 (ИЛ-4), ИЛ-10 и ИЛ-21 [4]. Набор цитокинов, которые производят Т-клетки и макрофаги, довольно хорошо известен [5]. В него, в частности, входят такие цито-кины, как ИЛ-3, ИЛ-5 и ИЛ-17А (продуцируются активированными Т-клетками), ИЛ-1Р и ТФРа (макрофаги), а также ИФН-у (НК-клетки) [6].
До сих пор в литературе основное внимание уделялось описанию роли отдельных цитокинов в диффе-ренцировке различных субпопуляций В-клеток в плаз-мабласты и плазматические клетки. При этом довольно мало известно о том, какие цитокины продуцируют сами В-лимфоциты и их субпопуляции. Для изучения цитокинов, продуцируемых В-клетками, необходима модель, которая может in vitro воспроизводить основные процессы, протекающие в зародышевых центрах. Такой моделью может являться стимуляция в системе ИЛ-21/ CD40L. ИЛ-21 является одним из наиболее критических факторов созревания В-клеток. ИЛ-21 действует как ключевой медиатор зависимых от Т-клеток иммунных
ответов и участвует в развитии и функционировании различных иммунных клеток [7]. Он способствует пролиферации и дифференцировке В-клеток, усиливает выработку антител. ИЛ-21 продуцируется преимущественно активированными CD4+-T-клетками и НКТ-клетками, однако наибольшая продукция приходится на субпопуляцию фолликулярных Т-хелперов (Tfh). Молекулой, которая регулирует функции В-клеток посредством прямого межклеточного контакта, является лиганд рецептора CD40 (CD40L) [8]. Взаимодействие CD40/CD40L индуцирует активацию, бластогенез и пролиферацию В-клеток [9]. Таким образом, ИЛ-21/ CD40L-стимуляция с помощью экзогенного ИЛ-21 и фидерных клеток, экспрессирующих молекулу CD40L, является наиболее простой моделью, которая воспроизводит in vitro основные процессы, протекающие в зародышевых центрах [10].
Цель настоящего исследования - изучение профиля цитокинов, продуцируемых В-лимфоцитами человека при стимуляции in vitro в системе HH-21/CD40L. Была также поставлена задача провести сравнительное изучение цитокинов, секретируемых наивными В-лимфоцитами, а также В-клетками памяти с переключенным и непереключенным синтезом Ig. Поскольку исследование носило скрининговый характер, для выполнения поставленной задачи мы использовали высокопроизводительный метод мультиплексного анализа Luminex.
Материал и методы
Участники исследования. В исследуемую группу были включены 10 здоровых добровольцев (3 женщины и 7 мужчин, средний возраст - 27 лет, в диапазоне от 23 до 39 лет). Исследование прошло предварительную этическую экспертизу и было одобрено Этическим комитетом Института иммунологии (протокол № 3-1, 11 марта 2020 г.). Исследование выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека в качестве испытуемого». Письменное информированное согласие получено от каждого участника исследования перед выполнением каких-либо процедур.
Выделение и стимуляция В-лимфоцитов. Мононуклеарные клетки выделяли из перифериче-
Э
10-,
s 3
а
а. =
4 я
5
8-
6-
4-
2-
А
,<Р Л Л N»
э
20 000 -|
15 000ч
« 10 000-
ад
5 000-
Л Л / £
IgM-секретирующие клетки 100-, •
50-
г? ,<5>" „d>
щи
N»
£
100-,
И
ё
50-
А
о
о
+
2
о
о
20 000 -,
15 000
я 10 000-
О
ад
5 000
Л
0
0
^ л л
s ^ ж
IgG-секретирующие клетки 100-, •
50-
ж г
г* ,<5>" „d>
£
Рис. 1. Функциональная характеристика субпопуляций В-лимфоцитов на 7-й день после ИЛ-21/СБ40Ь-стимуляции in vitro
А - пролиферация наивных (IgM+IgD+) В-лимфоцитов, В-кле-ток памяти с переключенным (IgG+CD27+) и непереключен-ным (IgM+CD27+) синтезом Ig; Б - доля клеток с фенотипом плазмабластов (CD27+CD38+); В - уровень секреции IgM и IgG; Г - доли IgM- и IgG-секретирующих клеток.
ской крови, собранной в гепаринизированные вакуумные пробирки. Кровь разбавляли 1 : 1 физиологическим раствором, забуференным фосфатом (ПанЭко, Россия), около 10 мл крови наслаивали на 3 мл раствора фиколла («ПанЭко», Россия) и центрифугировали в течение 30 мин при 2000 об/мин. Лимфоциты собирали пипеткой и промывали PBS, центрифугируя при 1700 об/мин в течение 10 мин. В-лимфоциты обогащали методом отрицательной иммуномагнитной сепарации с использованием набора Dynabeads Untouched human B cell kit (Thermo Fisher Scientific, США). Чистота выделенных В-лимфоцитов составляла не менее 98 %. Для фенотипирования и сортировки В-лимфоциты окрашивали следующими антителами: CD19-PE (клон LT19), CD27-PECy5.5 (клон LT27), CD38-PECy7 (клон LT38), IgG-FITC (клон CH1) и IgM-FITC (клон MA2), которые ранее были получены в нашей лаборатории [11]. Флуоресценцию клеток регистрировали с помощью проточного цитометра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США), оснащенного тремя диодными лазерами 488, 561 и 638 нм. Клетки сортировали на проточном сортировщике SH800S (Sony Biotechnology, США).
Выделенные В-лимфоциты суспендировали в среде DMEM/F12, содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки, 24 мкг/мл гентамицина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES (все «ПанЭко», Россия). Клетки высевали по 10 000 клеток на лунку в 96-луночный планшет и культивировали 7 дней при 37 °C в 5 % CO2 в присутствии 25 нг/мл ИЛ-21 (Peprotech, США) и фидерных клеток A549, несущих CD40L и обработанных 10 мкг/мл митомицина-С («Киова Хакко Когио», Япония) [12]. Индекс пролиферации определяли как отношение количества клеток на 7-й день культивирования к исходному количеству клеток.
Определение Ig методом иммуноферментного анализа (ИФА). 96-луночные планшеты с высокой сорбционной емкостью (Greiner, ФРГ), покрывали антителами против IgG (клон G4A6) или IgM (клон CH2) в концентрации 10 мкг/мл в течение ночи при 4 °C. Затем планшеты обрабатывали блокирующим буфером для ИФА («Хема», Россия). Супернатанты поликло-нально стимулированных В-клеток серийно разбавляли и инкубировали в течение 1 ч в планшетах для ИФА, после чего 3 раза промывали PBS/Твин20. Для количественного определения IgG и IgM использовали моно-клональные антитела CH1 и MA2, конъюгированные с пероксидазой хрена. Реагенты для вторичной детекции инкубировали в течение 1 ч, после чего планшеты 4 раза промывали PBS/Твин20 и реакцию проявляли добавлением раствора хромогена TMB («Хема», Россия). Реакцию останавливали с помощью 1 M HCl. Оптическую плотность при 450 нм измеряли с использованием планшетного ридера iMark (BioRad, США). Полученные данные анализировали с помощью программы Zemfira 4.0 (BioRad, США). Концентрацию антител вычисляли на основе стандартных кривых, полученных с использованием эталонных образцов.
0
0
0
0
0
1 000 000 100 000 10 000 f 1000 100 10 1
100 000 10 000 Ч 1000 t= 100 10
Наивные клетки
1
100 000 10 000 Ч 1000 t= 100 10
k
IgM+CD27+-^eTKH
&
1
IgG+CD27+-клетки
&
Рис. 2. Секреция цитокинов в супернатанты ИЛ-21/СБ40Ь-стимулированн^гх В-лимфоцитов на 7-й день культивирования in vitro А - наивные В-лимфоциты (IgM+IgD+); Б - В-клетки памяти с непереключенным (IgM+CD27+) синтезом Ig; В - В-клетки памяти с переключенным (IgG+CD27+) синтезом Ig.
Определение Ig-секретирующих клеток методом ELISpot (Enzyme-Linked ImmunoSpot Analysis).
Лунки 96-луночного планшета Multiscreen HTS Filter Plates (Merck, США) с размером пор 0,45 мкм покрывали кроличьими антителами против IgG или IgM человека (R&D Systems, США) в концентрации 10 мкг/лунку. В-клетки, полученные после поликлональной стимуляции, промывали в PBS и высевали в лунки (от 100 до 3000 клеток на лунку) предобработанных планшетов, инкубировали в течение 16 ч при 37 °C, 5 % CO2. Пятна, которые соответствовали антителосекретирующим клеткам, визуализировали с использованием IgG- или IgM-специфического реагента для детекции из набора B Cell ELISpot Development (R&D Systems, США). После завершения реакции планшеты сушили на воздухе и сканировали с помощью ридера CTL ImmunoSpot Analyzer (CTL, США).
Мультиплексный анализ цитокинов. Суперна-танты от стимулированных В-клеток собирали через
7 дней после начала стимуляции и отделяли от клеточного дебриса путем центрифугирования при 8000 об/мин в течение 5 мин. Далее супернатанты анализировали на наличие цитокинов с использованием набора Luminex (MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Premixed 41 Plex, Millipore, США). В тестируемую панель входили следующие цитокины: ЭФР, эотаксин, Г-КСФ, ГМ-КСФ, ИФН-а2, ИФН-у, ИЛ-10, Hn-12P40, Hn-12P70, ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-17А, ИЛ-IRA, ИЛ-1а, ИЛ-1Р, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, IP-10, MCP-1, MIP-1a, MIP-1P, RANTES, ФНОа, ФНОР, VEGF, ФРФ-2, ТФРа, Flt-3L, фрак-талкин, GRO, MCP-3, MDC, PDGF-AA, PDGF-AB/BB и ИЛ-9. Мультиплексный анализ проводили в соответствии с инструкциями производителя (Millipore, США).
Вкратце, микросферы, связанные с антителами, инкубировали с супернатантами в течение 1 ч. После промывки микросферы инкубировали с биотинили-рованными вторичными антителами. Реакцию прояв-
ИЛ-10
*
** т
100-,
10-
■
' 1
/ хО^
У ^
0
МСР-3
100-,
т т
10-
• •
/ У ^
э
100 000
10 000
1000
100
МБС
**
/ У ч# ^
э
100-,
10
ИЛ-1а
* т
^ ■
■: ••••,♦«•••• ••.....
А# л л
Э
1 000 000 -,
100 000 -
г 10 000 -|
и* =
1000-
100
МСР-1
йй
л# л л
э
ФНОа
*
100
10
* т
•••
л# л л
100-,
10-
ФНОР
**
* т
<9
У
хСУ хСУ
Рис. 3. Сравнение уровней цитокинов, секретируемых в культурах наивных В-лимфоцитов (IgM+IgD+), В-клеток памяти с непереключенным (IgM+CD27+) и переключенным (IgG+CD27+) синтезом Ig
■к
* т
1
т
* т
ляли окрашиванием микросфер с помощью конъюгата стрептавидина с фикоэритрином. Все инкубации проводились при комнатной температуре на шейкере для планшетов в соответствии с инструкциями производителей. Измерения производили на приборе MagPix equipment (Luminex, США). Концентрации образцов определяли по средней интенсивности флуоресценции по сравнению с 4- или 5-параметрической логистической стандартной кривой, полученной из стандартов с известной концентрацией, предоставленных производителем набора. Массив микросфер калибровали перед каждым анализом пробы и регулярно проверяли в соответствии с инструкциями производителя. Результаты мультиплексного анализа представлены в виде логарифмически преобразованных концентраций (пг/мл).
Статистическая обработка данных. Данные проточной цитометрии анализировали с помощью программы FlowJo X 10.0.7 (Becton Dickinson, США). Данные мультиплексного анализа обрабатывали с использованием программного обеспечения Belysa Immunoassay Curve Fitting Software (Luminex, США). Для построения графиков и статистического анализа использовали программное обеспечение GraphPad Prism версии 8.4.3 (GraphPad, США). Данные, полученные от одного донора, рассматривали как один эксперимент (n). Значимость различий между выборками оценивали с помощью теста Фридмана с последующим тестом Данна. Различия сравниваемых параметров считались статистически значимыми при p < 0,05. Данные на гистограммах показывают медиану и межквартильный размах.
Результаты
Прежде чем приступить к основной задаче нашей работы по определению профиля цитокинов, секрети-руемых отдельными субпопуляциями В-лимфоцитов при стимуляции in vitro, мы отработали методику получения субпопуляций В-лимфоцитов в предварительных экспериментах, а также охарактеризовали эти субпопуляции по способности к пролиферации и секреции Ig. После Hn-21/CD40L стимуляции на 7-й день тестировали В-клетки и супернатанты культур. Клетки всех исследуемых субпопуляций заметно пролифериро-вали (рис. 1А). Наиболее активно делились наивные В-лимфоциты, в меньшей степени пролиферировали В-клетки памяти (медиана индекса пролиферации 6,2 и 2,0 соответственно). Стимулированные В-лимфо-циты приобретали фенотип плазмабластов. Медианы долей CD27+CD38+-клеток составили 10, 60 и 80 %, соответственно (рис. 1Б). В субпопуляциях наивных В-лимфоцитов, а также В-клеток памяти с непереклю-ченным синтезом Ig наблюдалась заметная секреция IgM, но не IgG. Напротив, в культурах В-клеток памяти с переключенным синтезом Ig отмечалась продукция IgG, но не IgM. Секреция Ig регистрировалась как с помощью ИФА (рис. 1В), так и ELISpot (рис. 1Г).
В субпопуляциях IgM+IgD+ и IgM+CD27+ с использованием ELISpot наблюдались отдельные клетки,
которые секретировали Это может быть связано с некоторым неспецифическим фоном в этом тесте, но также может свидетельствовать о переключении синтеза которое происходило при ИЛ-21/СБ40Ь-стиму-ляции В-клеток. Таким образом, нами были получены функционально активные стимулированные клетки трех основных субпопуляций В-лимфоцитов: наивные, а также В-клетки памяти с переключенным и непере-ключенным синтезом ]£.
Убедившись, что полученные субпопуляции В-лим-фоцитов являются функционально активными, мы перешли к определению профиля цитокинов, которые секретировали клетки. Концентрацию цитокинов в супернатантах культур оценивали с помощью системы мультиплексного анализа Ьиштех. Результаты представлены в таблице. В супернатантах ИЛ-21/СБ40Ь-стимулированных клеток были определены уровни 40 цитокинов. Содержание различных цитокинов варьировало в диапазоне от 1 пг/мл до 12 нг/мл. В группу с высокой секрецией входили цитокины 1Р-10, МБС и МСР-1, концентрация которых превышала 2 нг/мл. Цитокины ИЛ-17А, ИЛ-12Р70, ТФРа, ИФН-у, ИЛ-3, ИЛ-5 и ИЛ-1Р регистрировались на уровне < 3 пг/мл, что находилось ниже уровня отсечки. Концентрация других цитокинов равномерно распределялась между этими экстремальными значениями (рис. 2). В контрольных экспериментах с супернатан-тами фидерных клеток без добавления В-лимфоцитов регистрировались фоновые уровни цитокинов.
Цитокиновые профили отдельных субпопуляций в целом не отличались друг от друга. Однако попарное сравнение выявило 7 цитокинов, для которых обнаруживалась статистически значимая разница. Наивные В-клетки секретировали цитокины ИЛ-10, МСР-3, МБС, ИЛ-1а, МСР-1, ФНОа и ФНОр более активно, чем В-клетки памяти (рис. 3). Для цитокинов ИЛ-10, МБС, МСР-1, ФНОа и ФНОр значимая разница прослеживалась в отношении обоих субпопуляций В-клеток памяти. Для МСР-3 достоверное отличие наблюдалось только в отношении В-клеток памяти с переключенным синтезом ]£, а для ИЛ-1а только при сравнении с В-клетками памяти с непереключенным синтезом ]£. Ни по одному из 40 цитокинов не наблюдалось значимых различий между отдельными субпопуляциями В-клеток памяти (см. таблицу).
Обсуждение
Для количественного определения цитокинов наиболее часто используется ИФА. Однако этот метод является малопроизводительным и одновременно позволяет определять довольно ограниченный набор цитокинов. Для проведения скрининговых исследований требуется применение более производительных методов. Такие возможности предоставляют различные системы мультиплексного анализа [13]. Из доступных систем мы выбрали Ьиштех с наиболее широкой цитокиновой панелью, которая включала более 40 различных ана-литов.
гол
Продукция цитокинов в культурах стимулированных субпопуляций В-лимфоцитов
Цитокины Наивные клетки 1§М+СБ27+-клетки 1§С+еБ27+-клетки Р
медиана, пг/мл 01-03 медиана, пг/мл 01-03 медиана, пг/мл 01-03 1§С+СБ27+ у* наивные клетки 1§М+СБ27+ у* наивные клетки
1Р-10 10 000,0 10 000,011 345,0 2757,6 1416,310 000,0 5095,7 1360,610 227,6 0,1720 0,1009
мое 12 537,5 5252,442262,4 5055,8 3113,77482,8 5080,4 921,79907,0 0,0052 0,0110
МСР-1 2654,9 281,010 000,0 603,6 193,81182,7 433,2 152,6995,6 0,0024 0,0219
Фракталкин 181,3 144,2-236,5 167,3 152,1-239,8 174,5 159,7-198,9 > 0,9999 > 0,9999
РБСЕАА 151,1 105,5-172,9 138,2 122,5-168,2 137,2 116,6-197,4 > 0,9999 > 0,9999
ФРФ-2 117,6 95,3-129,8 136,7 85,3-141,1 122,4 99,5-137,1 > 0,9999 0,1009
СЯО 96,4 69,6-162,7 100,7 68,7-122,3 99,0 66,9-117,2 > 0,9999 > 0,9999
Г-КСФ 75,2 61,6-101,8 80,4 70,7-94,7 76,7 67,7-87,2 > 0,9999 0,2806
ЯА]МТЕ8 152,9 58,1-193,4 71,9 47,3-111,9 60,8 38,8-159,9 0,5391 > 0,9999
ИФН-а2 50,4 45,3-61,0 55,9 50,5-60,8 51,8 48,8-63,5 0,9429 0,5391
ИЛ-4 55,7 47,7-86,2 48,4 46,9-71,2 50,8 42,0-64,0 0,2209 0,3526
РБСЕ-АБ/ББ 50,4 38,5-58,9 47,1 38,2-53,3 50,4 40,3-68,9 0,0760 > 0,9999
УЕСЕ 36,4 32,2-39,8 36,4 34,3-38,5 35,9 32,2-37,8 > 0,9999 > 0,9999
ИЛ-8 21,3 15,1-45,9 22,8 13,5-44,3 20,8 12,2-31,1 > 0,9999 > 0,9999
ФНОа 33,8 17,9-67,0 19,3 15,0-28,9 20,2 12,6-46,2 0,0417 0,0110
МСР-3 38,8 14,4-48,3 26,5 16,5-33,9 19,5 13,3-40,0 0,0304 0,2209
ИЛ-15 18,9 18,3-20,9 19,6 17,5-20,6 19,3 18,0-21,0 > 0,9999 > 0,9999
ИЛ-7 18,8 17,5-21,3 17,6 16,1-22,3 17,3 15,6-19,2 > 0,9999 > 0,9999
ИЛ-1а 18,7 14,8-20,9 16,5 12,9-18,1 16,7 12,9-20,2 0,3526 0,0417
ИЛ-6 14,9 5,9-21,7 15,7 7,5-18,8 13,9 7,9-20,1 > 0,9999 0,2209
И(--3Ь 13,5 11,8-16,3 13,6 13,3-15,6 13,6 10,7-15,3 > 0,9999 0,6563
М1Р-1Р 17,3 9,3-50,8 16,0 7,2-31,8 10,9 5,7-18,4 0,1325 0,5391
М1Р-1а 13,2 8,7-21,5 11,3 7,8-19,5 10,4 7,6-20,8 > 0,9999 > 0,9999
ФНОр 22,2 11,1-40,8 9,6 7,2-13,3 8,9 6,5-15,3 0,0052 0,0110
ЭФР 8,8 7,0-10,6 7,7 7,5-9,9 7,7 6,5-9,3 0,1720 0,4383
ИЛ-12Р40 7,3 6,5-9,5 8,0 6,5-9,2 7,3 6,0-8,5 > 0,9999 0,6563
Эотаксин 6,7 5,7-8,2 6,2 5,5-7,8 6,7 5,5-7,3 > 0,9999 0,6563
ГМ-КСФ 8,7 5,2-12,8 6,9 5,7-10,4 6,4 5,6-11,2 > 0,9999 > 0,9999
ИЛ-13 5,4 4,7-5,6 5,6 4,5-6,1 5,6 5,0-6,0 0,5391 > 0,9999
ИЛ-10 11,2 8,3-36,5 4,3 3,2-5,2 5,2 4,4-9,3 0,0417 0,0010
ИЛ-9 5,3 4,0-7,5 4,9 4,5-6,8 5,2 4,4-6,2 > 0,9999 > 0,9999
ИЛ-2 5,4 4,3-6,5 4,8 4,3-5,5 4,9 4,5-5,5 > 0,9999 > 0,9999
ИЛ-1ЯА 5,1 3,2-6,7 4,8 4,5-6,5 4,8 3,7-5,8 > 0,9999 > 0,9999
ИЛ-17А 3,4 2,8-4,1 3,3 2,9-3,8 3,3 3,1-3,8 > 0,9999 > 0,9999
ИЛ-12Р70 2,6 2,3-3,4 2,8 2,7-3,2 3,0 2,6-3,3 0,4383 0,6563
ТФРа 2,4 1,9-3,0 2,6 2,1-3,3 2,5 2,2-3,4 0,7907 0,1720
ИФН-у 1,6 1,2-1,9 1,4 1,2-1,8 1,6 1,3-1,9 > 0,9999 > 0,9999
ИЛ-3 1,5 1,4-1,6 1,5 1,4-1,5 1,5 1,4-1,5 > 0,9999 > 0,9999
ИЛ-5 1,3 1,2-1,4 1,2 1,2-1,3 1,3 1,2-1,3 > 0,9999 > 0,9999
ИЛ-1Р 1,1 0,8-1,4 1,0 0,8-1,4 1,0 0,8-1,3 > 0,9999 > 0,9999
Примечание. Статистически значимые различия (р < 0,05) выделены зеленым цветом.
Мы обнаружили, что стимулированные В-лимфо-циты секретируют довольно богатый спектр цитокинов. Представляет интерес сравнение этого набора с теми цитокинами, которые секретируют другие типы клеток. Считается, что наиболее активными продуцентами цитокинов являются макрофаги, которые секретируют цитокины как конститутивно, так и индуцированно
в ответ на воспалительные раздражители, например, на патогены. Макрофаги являются основными источниками таких провоспалительных цитокинов, как ФНОа, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8 и ИЛ-12 [6]. Наряду с этим они также активно продуцируют некоторые антивоспалительные цитокины, как например ИЛ-10 и ТФРр и хемокины М1Р-2а, ЯАОТБЗ и ИЛ-8.
Т-хелперы характеризуются различными цитокино-выми профилями в зависимости от того, к какой субпопуляции они принадлежат [14]. ТЫ-клетки отличаются повышенной секрецией ИФН-у и ФНОа, а ТЬ2-клетки в основном секретируют ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-13 [15]. ТЫ7-клетки специализируются на продукции ИЛ-17А, ИЛ-17Б, ИЛ-22, ИЛ-26 и ИФН-у [16]. Особенностью фолликулярных Т-хелперов является продукция ИЛ-21 и ИЛ-4 [17].
Цитокиновый профиль В-лимфоцитов изучен в меньшей степени [18]. Как правило, В-лимфоциты продуцируют цитокины только после стимуляции. В частности, было показано, что при активации В-клеток человека путем лигирования В-клеточного рецептора ВСЯ и СБ40 они секретируют цитокины ИЛ-6, ФНОа и ЬТ а [19]. В отличие от Т-клеток, отдельные субпопуляции В-клеток не отличаются по профилям цитокинов [15]. Тем не менее было показано, что экспрессия ИЛ-10 связана с принадлежностью В-клеток к регуляторной субпопуляции Breg [20].
Нами было обнаружено, что субпопуляция наивных В-лимфоцитов отличается от В-клеток памяти по секреции таких цитокинов, как ИЛ-10, МСР-1, МСР-3, МБС, ИЛ-1а, ФНОа и ФНОр. Все эти цитокины проявляют плейотропное действие и участвуют в различных иммунных реакциях, воспалительных процессах и кроветворении, тем не менее у каждого имеются некоторые особенности.
ИЛ-10 в основном продуцируется активированными макрофагами, в меньшей степени В-лимфоцитами [21]. Его основная активность связана с подавлением активации макрофагов и продукцией ФНО, ИЛ-1Р, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12 и ГМ-КСФ [6]. ИЛ-10 также повышает выживаемость, пролиферацию В-клеток и выработку антител [22]. Одной из наиболее интересных особенностей этого цитокина является его связь с Breg [20]. МСР-1 и МСР-3 относятся к наиболее плюрипотентным хемокинам. Они активирует все типы лейкоцитов, связываясь по крайней мере с четырьмя различными хемо-
киновыми рецепторами. Эти хемокины играют важную роль в нормальном гомеостазе, а также при различных патологиях, включая рак, аутоиммунные заболевания и хроническое воспаление [23]. Важной особенностью МСР-1 и МСР-3 является то, что они привлекают макрофаги во время воспаления и метастазирования. МБС участвует в иммунорегуляторных и воспалительных процессах [24]. Он проявляет хемотаксическую активность в отношении моноцитов, дендритных клеток, НК-клеток и хронически активированных Т-лимфоцитов. Он также демонстрирует умеренную активность в отношении первично активированных Т-лимфоцитов, но не обладает хемоаттрактантной активностью в отношении нейтрофилов, эозинофилов и покоящихся Т-лимфо-цитов. Известно, что макрофаги являются основным источником ИЛ-1а, тем не менее он также может выделяться В-клетками [6]. ФНОа и ФНОр принадлежат к одному семейству, оба являются провоспалительными цитокинами. Они участвуют в развитие лимфатических узлов [25].
Проведенный беглый обзор функциональных характеристик отмеченных цитокинов показывает, что все они участвуют в осуществлении функций В-лимфо-цитов путем привлечения в зародышевые центры макрофагов и активированных Т-клеток, а также влияют на функционирование самих В-лимфоцитов. После того как в скрининговом режиме мы определили цитокины, экспрессия которых отличалась в наивных В-лимфо-цитах и В-клетках памяти, можно перейти к более сфокусированному исследованию этих цитокинов и их роли в физиологии В-лимфоцитов.
Заключение
В исследовании были определены профили цито-кинов, продуцируемых активированными В-лимфоци-тами и их субпопуляциями. Полученные результаты показывают, что продукция цитокинов В-клетками значительно зависит от активации и дифференцировки В-лимфоцитов.
■ Литература
1. Cyster J.G., Allen C.D.C. B cell responses: cell interaction dynamics and decisions. Cell. 2019; 177: 524-40. DOI: https://doi. org/10.1016/j.cell.2019.03.016
2. De Silva N.S., Klein U. Dynamics of B cells in germinal centres. Nat Rev Immunol. 2015; 15: 137-48. DOI: https://doi.org/10.1038/nri3804
3. Mintz M.A., Cyster J.G. T follicular helper cells in germinal center B cell selection and lymphomagenesis. Immunol Rev. 2020; 296: 48-61. DOI: https://doi.org/10.1111/imr.12860
4. Vazquez M.I., Catalan-Dibene J., Zlotnik A. B cells responses and cytokine production are regulated by their immune microenvironment. Cytokine. 2015; 74: 318-26. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.cyto.2015.02.007
5. Liu C., Chu D., Kalantar-Zadeh K., George J., Young H.A., Liu G. Cytokines: from clinical significance to quantification. advanced science. 2021; 8: 2004433. DOI: https://doi.org/10.1002/advs.202004433
6. Arango Duque G., Descoteaux A. Macrophage cytokines: involvement in immunity and infectious diseases. Front Immunol. 2014; 5: 491. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2014.00491
7. Franke F., Kirchenbaum G.A., Kuerten S., Lehmann P.V. IL-21 in conjunction with anti-CD40 and IL-4 constitutes a potent polyclonal B cell stimulator for monitoring antigen-specific memory B cells. Cells. 2020; 9: 433. DOI: https://doi.org/10.3390/cells9020433
8. Elgueta R., Benson M.J., De Vries V.C., Wasiuk A., Guo Y., Noel-le R.J. Molecular mechanism and function of CD40/CD40L engagement in the immune system. Immunol Rev. 2009; 229: 152-72. DOI: https://doi. org/10.1111/j.1600-065X.2009.00782.x
9. Бязрова М.Г., Астахова Е.А., Спиридонова А.Б., Васильева Ю.В., Прилипов А.Г., Филатов А.В. Стимуляция В-лимфоцитов человека in vitro с помощью HH-21/CD40L и их характеристика. Иммунология. 2020; 41 (1): 18-27. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-6-00-00.
10. Kwakkenbos M.J., Helden P.M., Beaumont T., Spits H. Stable long-term cultures of self-renewing B cells and their applications. Immunol Rev. 2016; 270: 65-77. DOI: https://doi.org/10.1111/imr.12395
11. Лушова А. А., Жеремян Э.А., Астахова Е.А., Спиридонова А.Б., Бязрова М.Г., Филатов А.В. Субпопуляции В-лимфоцитов: функции
и молекулярные маркеры. Иммунология. 2019; 40 (6): 63-75. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-16009
12. Астахова Е.А., Фролов Е.А., Шилкина А.Б., Бязрова М.Г., Латышева Е.А., Латышева Т.В., Филатов А.В. Стимуляции В-клеток в системе HH-21/CD40L в норме и у пациентов с общей вариабельной иммунной недостаточностью. Иммунология. 2021; 41 (6): 631-40. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-631-640
13. Lash G.E., Pinto L.A. Multiplex cytokine analysis technologies. Expert Rev Vaccines. 2010; 9 (10): 1231-7. DOI: https://doi.org/10.1586/ erv.10.110
14. Raphael I., Nalawade S., Eagar T.N., Forsthuber T.G. T cell subsets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases. Cytokine. 2015; 74: 5-17. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cyto.2014. 09.011
15. Westerhof L.M., McGuire K., MacLellan L., Flynn A., Gray J.I., Thomas M. et al. Multifunctional cytokine production reveals functional superiority of memory CD4 T cells. Eur J Immunol. 2019; 49: 2019-29. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.201848026
16. Wilson N.J., Boniface K., Chan J.R., McKenzie B.S., Blumenschein W.M., Mattson J.D., et al. Development, cytokine profile and function of human interleukin 17-producing helper T cells. Nat Immunol. 2007; 8: 950-7. DOI: https://doi.org/10.1038/ni1497
17. Li H., Pauza C.D. CD25+ Bcl6low T follicular helper cells provide help to maturing B cells in germinal centers of human tonsil. Eur J Immunol. 2015; 45: 298-308. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.201 444911
18. De Gruijter N.M., Jebson B., Rosser E.C. Cytokine production by human B cells: role in health and autoimmune disease. Clin Exp Immunol. 2022; 210: 253-62. DOI: https://doi.org/10.1093/cei/uxac090
19. Duddy M.E., Alter A., Bar-Or A. Distinct profiles of human B cell effector cytokines: a role in immune regulation? J Immunol. 2004; 172: 3422-27. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.172.6.3422
20. Glass M.C., Glass D.R., Oliveria J-P., Mbiribindi B., Esqui-vel C.O., Krams S.M., et al. Human IL-10-producing B cells have diverse states that are induced from multiple B cell subsets. Cell Rep. 2022; 39: 110728. DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110728
21. Mosser D.M., Zhang X. Interleukin-10: new perspectives on an old cytokine. Immunol Rev. 2008; 226: 205-18. DOI: https://doi. org/10.1111/j.1600-065X.2008.00706.x
22. Radomir L., Kramer M.P., Perpinial M., Schottlender N., Raba-ni S., David K., et al. The survival and function of IL-10-producing regulatory B cells are negatively controlled by SLAMF5. Nat Commun. 2021; 12: 1893. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-021-22230-z
23. Singh S., Anshita D., Ravichandiran V. MCP-1: Function, regulation, and involvement in disease. Int Immunopharmacol. 2021; 101: 107598. DOI: https://doi.org/10.1016/j.intimp.2021.107598
24. Mantovani A., Gray P.A., Van Damme J., Sozzani S. Macrophage-derived chemokine (MDC). J Leukoc Biol. 2000; 68: 400-4
25. Furtado G.C., Pacer M.E., Bongers G., Bénézech C., He Z., Chen L., et al. TNFa-dependent development of lymphoid tissue in the absence of RORyt+ lymphoid tissue inducer cells. Mucosal Immunol. 2014; 7: 602-14. DOI: https://doi.org/10.1038/mi.2013.79
■ References
1. Cyster J.G., Allen C.D.C. B cell responses: cell interaction dynamics and decisions. Cell. 2019; 177: 524-40. DOI: https://doi. org/10.1016/j.cell.2019.03.016
2. De Silva N.S., Klein U. Dynamics of B cells in germinal centres. Nat Rev Immunol. 2015; 15: 137-48. DOI: https://doi.org/10.1038/nri3804
3. Mintz M.A., Cyster J.G. T follicular helper cells in germinal center B cell selection and lymphomagenesis. Immunol Rev. 2020; 296: 48-61. DOI: https://doi.org/10.1111/imr.12860
4. Vazquez M.I., Catalan-Dibene J., Zlotnik A. B cells responses and cytokine production are regulated by their immune microenvironment. Cytokine. 2015; 74: 318-26. DOI: https://doi.org/10.1016/j. cyto.2015.02.007
5. Liu C., Chu D., Kalantar-Zadeh K., George J., Young H.A., Liu G. Cytokines: from clinical significance to quantification. advanced science. 2021; 8: 2004433. DOI: https://doi.org/10.1002/advs.202004433
6. Arango Duque G., Descoteaux A. Macrophage cytokines: involvement in immunity and infectious diseases. Front Immunol. 2014; 5: 491. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2014.00491
7. Franke F., Kirchenbaum G.A., Kuerten S., Lehmann P.V. IL-21 in conjunction with anti-CD40 and IL-4 constitutes a potent polyclonal B cell stimulator for monitoring antigen-specific memory B cells. Cells. 2020; 9: 433. DOI: https://doi.org/10.3390/cells9020433
8. Elgueta R., Benson M.J., De Vries V.C., Wasiuk A., Guo Y., Noelle R.J. Molecular mechanism and function of CD40/CD40L engagement in the immune system. Immunol Rev. 2009; 229: 152-72. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1600-065X.2009.00782.x
9. Byazrova M.G., Astakhova E.A., Spiridonova A.B., Vasil'e-va Yu.V., Prilipov A.G., Filatov A.V. IL-21/CD40L stimulation of human B-lymphocytes in vitro and their characteristics. Immunologiya. 2020; 41 (6): 18-27. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-6-00-00 (in Russian)
10. Kwakkenbos M.J., Helden P.M., Beaumont T., Spits H. Stable long-term cultures of self-renewing B cells and their applications. Immunol Rev. 2016; 270: 65-77. DOI: https://doi.org/10.1111/imr.12395
11. Lushova A.A., Zheremyan E.A., Astakhova E.A., Spiridono-va A.B., Byazrova M.G., Filatov A.V. B-lymphocyte subsets: functions and molecular markers. Immunologiya. 2019; 40 (6): 63-76. DOI: https://doi. org/10.24411/0206-4952-2019-16009 (in Russian)
12. Astakhova E.A., Frolov E.A., Shilkina A.B., Byazrova M.G., Latysheva E.A., Latysheva T.V., Filatov A.V. Stimulation of B cells in the IL-21/CD40L system in healthy donors and in patients with common variable immunodeficiency. Immunologiya. 2021; 41 (6): 631-40. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-631-640 (in Russian)
13. Lash G.E., Pinto L.A. Multiplex cytokine analysis technologies. Expert Rev Vaccines. 2010; 9 (10): 1231-7. DOI: https://doi.org/10.1586/ erv.10.110
14. Raphael I., Nalawade S., Eagar T.N., Forsthuber T.G. T cell subsets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases. Cytokine. 2015; 74: 5-17. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cyto.2014.09.011
15. Westerhof L.M., McGuire K., MacLellan L., Flynn A., Gray J.I., Thomas M., et al. Multifunctional cytokine production reveals functional superiority of memory CD4 T cells. Eur J Immunol. 2019; 49: 2019-29. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.201848026
16. Wilson N.J., Boniface K., Chan J.R., McKenzie B.S., Blumenschein W.M., Mattson J.D., et al. Development, cytokine profile and function of human interleukin 17-producing helper T cells. Nat Immunol. 2007; 8: 950-7. DOI: https://doi.org/10.1038/ni1497
17. Li H., Pauza C.D. CD25+ Bcl6low T follicular helper cells provide help to maturing B cells in germinal centers of human tonsil. Eur J Immunol. 2015; 45: 298-308. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.201444911
18. De Gruijter N.M., Jebson B., Rosser E.C. Cytokine production by human B cells: role in health and autoimmune disease. Clin Exp Immunol. 2022; 210: 253-62. DOI: https://doi.org/10.1093/cei/uxac090
19. Duddy M.E., Alter A., Bar-Or A. Distinct profiles of human B cell effector cytokines: a role in immune regulation? J Immunol. 2004; 172: 3422-27. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.172.6.3422
20. Glass M.C., Glass D.R., Oliveria J-P., Mbiribindi B., Esquivel C.O., Krams S.M., et al. Human IL-10-producing B cells have diverse states that are induced from multiple B cell subsets. Cell Rep. 2022; 39: 110728. DOI: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110728
21. Mosser D.M., Zhang X. Interleukin-10: new perspectives on an old cytokine. Immunol Rev. 2008; 226: 205-18. DOI: https://doi. org/10.1111/j.1600-065X.2008.00706.x
22. Radomir L., Kramer M.P., Perpinial M., Schottlender N., Raba-ni S., David K., et al. The survival and function of IL-10-producing regulatory B cells are negatively controlled by SLAMF5. Nat Commun. 2021; 12: 1893. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-021-22230-z
23. Singh S., Anshita D., Ravichandiran V. MCP-1: Function, regulation, and involvement in disease. Int Immunopharmacol. 2021; 101: 107598. DOI: https://doi.org/10.1016/j.intimp.2021.107598
24. Mantovani A., Gray P.A., Van Damme J., Sozzani S. Macrophage-derived chemokine (MDC). J Leukoc Biol. 2000; 68: 400-4.
25. Furtado G.C., Pacer M.E., Bongers G., Bénézech C., He Z., Chen L., et al. TNFa-dependent development of lymphoid tissue in the absence of RORyt+ lymphoid tissue inducer cells. Mucosal Immunol. 2014; 7: 602-14. DOI: https://doi.org/10.1038/mi.2013.79
Сведения об авторах
Бязрова Мария Георгиевна - науч. сотр. лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; аспирант каф. иммунологии биол. факультета ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова; ассистент каф. иммунологии ФГАОУ ВО РУДН им. П. Лумумбы Мин-обрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: mbyazrova@list.ru https://orcid.org/0000-0002-9858-7596
Порошина Алина Сергеевна - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной аллергологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: alinaporoshina145@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-0400-2201
Сухова Мария Михайловна - лаборант лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; аспирант каф. иммунологии биол. факультета ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация E-mail: mary.sukhova13@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4572-1878
Фролов Евгений Александрович - мл. науч. сотр. отд. иммунопатологии взрослых ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: frolovevgeny@rambler.ru https://orcid.org/0000-0002-0800-5960
Шилкина Анна Борисовна - интерн ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: anyuta.spiridonowa@yandex.ru https://orcid.org/0000-0003-4229-3377
Латышева Елена Александровна - д-p мед. наук, вед. науч. сотр. отд. иммунопатологии взрослых ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ealat@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-1606-205X
Латышева Татьяна Васильевна - д-p мед. наук, проф., рук. отд. иммунопатологии взрослых и интенсивной терапии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: tvlat@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-1508-0640
Филатов Александр Васильевич - д-р биол. наук, проф., зав. лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. иммунологии биол. факультета ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация E-mail: avfilat@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
Authors' information
Maria G. Byazrova - Researcher of the Immunoche-mistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; PhD Student of Immunology Chair, Biology Faculty, M.V. Lomonosov MSU; Assistant of Immunology Chair, RUDN named after P. Lumumba of the MSHE of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: mbyazrova@list.ru https://orcid.org/0000-0002-9858-7596
Alina S. Poroshina - Junior Researcher of the Molecular Allergology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: alinaporoshina145@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-0400-2201
Maria M. Sukhova - Technician at the Immunochemistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; PhD Student of Immunology Chair, Biology Faculty, M.V. Lomonosov MSU, Moscow, Russian Federation E-mail: mary.sukhova13@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4572-1878
Evgeniy A. Frolov - Junior Researcher of the Adult Immu-nopathology Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: frolovevgeny@rambler.ru https://orcid.org/0000-0002-0800-5960
Anna B. Shilkina - Internist, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: anyuta.spiridonowa@yandex.ru https://orcid.org/0000-0003-4229-3377
Elena A. Latysheva - MD, PhD, Senior Researcher of the Adult Immunopathology Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ealat@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-1606-205X
Tatiana V. Latysheva - MD, PhD, Prof., Head of the Immunopathology and Intensive Care Depts., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: tvlat@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-1508-0640
Alexander V. Filatov - Dr.Sci., PhD, Prof., Head of the Immunochemistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of Immunology Chair, Biology Faculty, M.V. Lomonosov MSU, Moscow, Russian Federation E-mail: avfilat@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-6460-9427
