CC BY
72
ПАТОФИЗИОЛОГИЯ
УДК: 577.3:612.018:612.112.94:615.37
И.Г. Ковшик, A.B. Шурлыгина, А.Н. Силков, C.B. Сенников, В.А. Труфакин
ПРОДУКЦИЯ ЦИТОКИНОВ КЛЕТКАМИ ЛИМФОИДНЫХ ОРГАНОВ МЫШЕЙ
ПОД ВЛИЯНИЕМ ВВЕДЕНИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 В РАЗНОЕ ВРЕМЯ СУТОК
НИИ клинической и экспериментальной лимфологии НИИ физиологии
НИИ клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск
Проведено исследование эффекта различных суточных режимов введения экзогенного интерлейкина-2 (ИЛ-2) на продукцию цитокинов клетками тимуса и селезенки мышей. Обнаружено, что утреннее введение интерлейкина-2 (ИЛ-2) приводит к появлению достоверных суточных вариаций спонтанной и стимулированной продукции интерферона-у клетками селезенки и отмене достоверных суточных вариаций стимулированной продукции ИЛ-2 тимоцитами. Эффекты вечернего введения ИЛ-2 заключаются в появлении достоверных суточных вариаций стимулированной продукции ИЛ-2 в селезенке, появлении достоверных суточных вариаций спонтанной продукции ИЛ-10 спленоцитами, повышении стимулированной продукции ИЛ-2 спленоцитами в 15.00 ч. Дальнейшие исследования могут иметь результатом разработку целенаправленных режимов цитокиновой хронотерапии._
Ключевые слова: интерлейкины, суточные вариации, лимфоидные органы, лимфоциты
Структурно-временная организация иммунной системы представлена комплексом биоритмов основных динамических процессов - пролиферации, дифференци-ровки, миграции, метаболизма и апоптоза иммуноком-петентных клеток, - находящихся между собой в определенных фазовых взаимоотношениях. Этот "внутренний временной порядок", по-видимому, обусловливает оптимальный уровень функционирования системы в каждый данный момент времени [2]. Циркадные ритмы обнаружены для целого ряда иммунологических параметров, в том числе и продукции цитокинов - интерлей-кинов, интерферона, фактора некроза опухоли [6-8, 11]. По-видимому, с этой ритмичностью связан феномен хроностезии иммунной системы к биологически активным веществам - гормонам, нейромедиаторам, цитоста-тикам, - который выражается в том, что применение экзогенного препарата в разное время суток приводит к различным эффектам, иногда - диаметрально противоположным [4]. С учётом этой закономерности строятся схемы хронотерапии, когда по разным параметрам определяется оптимальное время введения лекарственных препаратов с целью достижения наилучшего клинического эффекта.
В последнее время интенсивно ведутся исследования по выяснению механизмов действия и возможностей клинического использования цитокинов. Но до сих пор неизвестно, есть ли хронозависимость для их действия. Цель настоящей работы - исследование эффекта различных суточных режимов введения экзогенного интер- лейкина-2 (ИЛ-2) на продукцию цитокинов клетками тимуса и селезенки мышей.
Методика. Рекомбинантный интерлейкин-2 вводили мышам (СБЛхС57Б1)Р1, самцам в возрасте 3-4 мес.,
однократно в дозе 100 ЕД/мышь в утреннее (10.00 ч) или вечернее (20.00 ч) время. Контролем служили интакт-ные животные. На 3-ьи сутки после введения цитокина мышей забивали дислокацией шейного отдела позвоночника под легким эфирным наркозом в 10.00, 15.00 и 20.00 ч; в стерильных условиях извлекали у них тимус и селезенку; готовили клеточную суспензию. Затем клетки культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 2 мМ/л L-глутамина, 10% ЭТС, 100 мг/л ампициллина и 50 мг/л гентамицина, в присутствии Т-клеточного мито-гена конканавалина А (КонА) или без него в течение 48 ч. Концентрация клеток при культивировании была 106 клеток/мл. По завершении культивирования клеток образцы кондиционной среды собирали и определяли в них концентрацию цитокинов (интерферона-у (ИФН-у), ИЛ-2, ИЛ-10) электрохемилюминесцентным методом на приборе ORIGEN ANALISER, как описано ранее [1, 10].
В работе использовали специфические антитела; для определения мышиного ИФН-у были использованы мо-ноклональные антитела, меченые рутением (R&D, Cat № МАВ485), и поликлональные антитела, меченые био-тином (Peprotech, Cat № 500-P119); для ИЛ-10-поли-клональные антитела, меченые рутением (R&D, Cat № AB417-NA), и биотинилированные моноклональные антитела (R&D, Cat № MAB417); для ИЛ-2 - биотинилированные антитела (Peprotech, Cat № 500-P111Bt) и моно-клональные антитела (R&D, Cat № MAB702). Использованные антитела не способны перекрестно связывать другие цитокины. Соответствующие тесты проводятся фирмой-изготовителем, и их результаты заносятся в паспорта антител.
Для построения калибровочных кривых были использованы рекомбинантные цитокины: мышиный ИФН-у (R&D, Cat № 485-MI), мышиный ИЛ-10 (R&D, Cat № 417-ML), мышиный ИЛ-2 (Peprotech, Cat № 212-12). Работая с пробами кондиционной среды или с сыворотками, мы готовили калибровочные стандарты в идентичной среде либо в сыворотке для устранения ошибок при обработке полученных результатов, связанных с "эффектом матрикса".
В качестве твердофазного субстрата использовали магнитные стрептавидиновые бусы (Dynabeads® M-280 Streptavidin Coated Beads, Dynal Biotech).
Все эксперименты выполнены в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (приказ Минздрава СССР от 12.08.77 г.).
Результаты. Введение ИЛ-2 оказало определенное влияние на цитокинпродуцирующую функцию иммуно-компетентных клеток, причем это действие оказалось зависимым от времени его применения. При введении ИЛ-2 в 10.00 появились достоверные различия содержания ИФН-у в кондиционной среде культур нестимули-рованных и стимулированных спленоцитов, выделенных в разное время суток, которых не было ни в контроле, ни после вечернего введения ИЛ-2 (рис. 1). У мышей, получивших инъекцию ИЛ-2 утром спонтанная продукция ИФН-у спленоцитами, выделенными в 10.00, оказалась достоверно выше, чем аналогичный показатель клеток, выделенных в 20.00. В ответ на стимуляцию ми-тогеном "утренние" спленоциты продуцировали достоверно меньшие количества ИФН-у, чем "дневные".
После вечернего введения ИЛ-2 появились отсутствовавшие в контроле достоверные суточные вариации спонтанной продукции спленоцитами ИЛ-10: в кондиционных средах культур клеток, выделенных в 10.00, уровень цитокина оказался достоверно ниже аналогичного параметра для "дневных" и "вечерних" спленоци-тов (рис. 2).
Одним из важнейших параметров, характеризующих функциональное состояние иммунной системы, является отношение ИФН-у/ИЛ-10. Интерферон-у является главным цитокином Т-хелперов 1-го типа (Тх 1), участвующих преимущественно в клеточных иммунных реакциях. ИЛ-10 продуцируется Т-хелперами 2-го типа (Тх2), обеспечивающими гуморальный иммунитет. Данные субпопуляции Т-хелперов и секретируемые ими цитокины находятся в реципрокных взаимоотношениях [9]. В наших экспериментах выявлено, что суммарное соотношение ИФН-у/ ИЛ-10 в кондиционной среде стимулированных спленоцитов, выделенных в 10.00, 15.00 и 20.00 ч, достоверно увеличивалось после вечернего введения ИЛ-2 (38,91±13,92 пкг/мл - в контроле и 79,62±19,41 пкг/мл - после вечернего введения ИЛ-2; p<0,05). Это свидетельствует о том, что введение ИЛ-2 в 20.00 в большей степени стимулирует либо количественный рост Тх 1, либо их функциональную активность. В результате данная субпопуляция получает преимущество при ответе на митогенный стимул, что и приводит к повышению отношения ИФН-у/ИЛ-10 в кондиционных средах культур стимулированных спленоцитов. Эти данные совпадают с нашими предыдущими результатами, показавшими, что наиболее выраженное увеличение
в селезенке мышей количества CD4+-клeтoк наблюдается после вечернего введения ИЛ-2 [5].
Отмечено влияние введения экзогенного ИЛ-2 на его же продукцию клетками тимуса и селезенки. И утреннее, и вечернее введение ИЛ-2 повышало уровень данного цитокина в кондиционной среде стимулированных и нестимулированных культур "утренних" тимоцитов. После введения экзогенного ИЛ-2 в обоих суточных режимах циркадные вариации спонтанной продукции ИЛ-2, характерные для интактных животных, исчезали. Такое же действие ИЛ-2 на стимулированные тимоциты было отмечено только при его утреннем введении. После применения экзогенного цитокина в 20.00 достоверные суточные вариации ИЛ-2-продуцирующей функции тимоцитов сохранялись; характер их был аналогичен таковому у интактных животных, но снижался размах колебаний. Следует отметить, что в кондиционной среде культур тимоцитов, выделенных из организма интакт-ных мышей в 20.00, отмечена максимальная концентрация ИЛ-2, так что вечернее введение данного цитокина приходится на естественный максимум содержания и/или функциональной активности ИЛ-2-продуцирую-щей популяции клеток тимуса и "имитирует" нормальный суточный ритм продукции данного цитокина в тимусе (табл. 1). Возможно, что это обстоятельство и обусловливает сохранение суточных вариаций ИЛ-2-проду-цирующей активности тимоцитов после вечернего введения ИЛ-2. Вечернее введение ИЛ-2 повышало уровень данного цитокина в кондиционной среде стимулированных культур спленоцитов, выделенных в 15.00 и приводило к появлению достоверных суточных вариаций способности клеток селезенки продуцировать ИЛ-2 после стимуляции митогеном (табл. 2).
Таким образом, можно выделить следующие основные эффекты экзогенного ИЛ-2 на цитокинпродуциру-ющую активность клеток лимфоидных органов мышей. Некоторые из этих эффектов являются общими для обоих режимов введения ИЛ-2, а другие - характерны только для какого-то определенного времени воздействия. Общими влияниями для утреннего и вечернего введения ИЛ-2 являются отмена суточных вариаций спонтанной продукции ИЛ-2 тимоцитами, повышение спонтанной продукции ИЛ-2 тимоцитами в 10.00 (на минимуме его продукции у интактных мышей).
Эффекты утреннего введения ИЛ-2: появление достоверных суточных вариаций спонтанной и стимулированной продукции ИФН-у клетками селезенки; отмена достоверных суточных вариаций стимулированной продукции ИЛ-2 тимоцитами.
Эффекты вечернего введения ИЛ-2: появление достоверных суточных вариаций стимулированной продукции ИЛ-2 в селезенке; появление достоверных суточных вариаций спонтанной продукции ИЛ-10 сплено-цитами; повышение стимулированной продукции ИЛ-2 спленоцитами в 15.00; повышение соотношения ИФН-у/ИЛ-10 в кондиционной среде стимулированных спленоцитов, выделенных во всех исследованных временных точках (суммарно).
Из представленных данных видно, что утреннее введение ИЛ-2 в большей степени оказывает влияние на функциональную активность спленоцитов, причем это влияние носит стимулирующий и синхронизирующий характер преимущественно в отношении цитокина
Тх 1 - ИФН-у. В тимусе же, наоборот, проявляется десинхронизирующий эффект утреннего введения цито-кина на способность тимоцитов к митогениндуцирован-ной продукции ИЛ-2. Вечернее введение ИЛ-2 обладает синхронизирующим и стимулирующим действием на способность клеток селезенки продуцировать ИЛ-2 и ИЛ-10 (противовоспалительный цитокин, секретируе-мый Тх2). Можно предположить, что экзогенный ИЛ-2 влияет на суточную динамику баланса Тх 1 и Тх2 разными путями в зависимости от времени его введения. Утреннее воздействие влияет на суточную динамику количества или функциональной активности Тх 1, продуцирующих ИФН-у, а вечернее - на суточные вариации Тх2, секретирующих ИЛ-10.
Таким образом, обнаружена хроноэффективность экзогенного ИЛ-2 в отношении его влияния на цитокин-продуцирующую активность клеток тимуса и селезенки мышей, которая может быть обусловлена либо изменением соотношения клеточных субпопуляций в лимфо-идных органах, либо влиянием ИЛ-2 на функциональную активность определенных клеточных субтипов. В этой связи следует упомянуть результаты наших предыдущих исследований, которые показали, что влияния ИЛ-2, ИФН-у, комплекса провоспалительных цитоки-нов на морфофункциональные параметры иммуноком-петентных клеток людей и экспериментальных животных также зависят от времени их применения [3-5]. Особый интерес, на наш взгляд, вызывает тот факт, что разные режимы введения ИЛ-2 оказывают преимущественное влияние на продукцию разных цитокинов имму-нокомпетентными клетками. Это позволяет надеяться, что дальнейшие исследования могут иметь результатом разработку целенаправленных режимов цитокиновой хронотерапии, в зависимости от того, на какое нарушенное звено иммунитета требуется оказать наиболее сильное корригирующее воздействие.
CYTOKINE PRODUCTION BY THE CELLS OF LYMPHOID ORGANS UNDER THE INFLUENCE OF THE IL-2 INJECTION IN DIFFERENT TIME OF DAY
I.G. Kovshik, A.V. Shurlygina, A.N. Silkov, S.V. Sennikov, V.A. Trufakin
The effects of various daily regimens of IL-2 injection on cytokines production by mouse thymocytes and splenocytes are investigated. We have found, that the morning injection of IL-2 changes daily variations of IFN-y production by splenocytes and cancels daily variations of stimulated production of IL-2 by thy-mocytes. The effects of evening injection of IL-2 consist in occurrence of daily variations in stimulated production of IL-2 and spontaneous production of IL-10 by the splenocytes. The purpose of the further researches is development of chronotherapy by cytokines.
ЛИТЕРАТУРА
1. Использование электрохемилюминесцентного метода для количественного определения цитокинов в различных средах/С.В. Крысов, Д.Х. Курамшин, С.А. Силков, С.В. Сенников, В.А. Козлов // Клинич. лаб. диагностика. 2000. № 12. С. 39-43.
2. Труфакин В.А. Проблемы гистофизиологии иммунной системы / В.А. Труфакин, А.В. Шурлыгина // Иммунология. 2002. № 1. С. 4-8.
Рис. 1. Влияние различных суточных режимов введения ИЛ-2 на суточные вариации спонтанной и КонА-стимули-рованной продукции ИФН-у клетками селезенки мышей (СБЛх С57Б1)И.
А - спонтанная продукция, Б - КонА-стимулированная продукция; * - различия между показателями достоверны при р<0,05 (критерий Крускалла-Уоллеса)
Рис. 2. Влияние различных суточных режимов введения ИЛ-2 на суточные вариации спонтанной ИЛ-10 клетками селезенки мышей (СБЛхС57Б1)П.
* - различия между показателями достоверны при р<0,05 (критерий Крускалла-Уоллеса)
3. Труфакин В.А. Цитокины и биоритмы / В.А. Труфакин, А.В. Шурлыгина// Медицинская иммунология. 2001. Т. 3. № 4. С. 477-486.
4. Труфакин В.А. Экспериментально-теоретические предпосылки хроноиммунокоррекции / В.А. Труфакин, А.В. Шурлыгина// Бюл. Сибирского отделения РАМН. 2001. № 4. С. 24-26.
5. Хронозависимое влияние введения интерлейкина-2 на соотношение субпопуляций клеток тимуса у мышей / А.В. Шурлыгина, И.Г. Ковшик, Л.В. Вербицкая, В.А. Труфакин // Иммунология. 2000. № 1. С. 21-24.
6. Circadian secretions of IL-2, IL-12, IL-6 and IL-10 in relation to the light/dark rhythm of the pineal hormone melatonin in healthy humans / P. Lissoni, F. Rovelli, F. Brivio, O. Brivio, L. Fumagalli//Nat. Immun. 1998. Vol. 16. № 1. P. 1-5.
7. Circadian variations in proinflammatory cytokine concentrations in acute myocardial infarction / R.A. Dominguez, G.P. Abreu, M.J. Garcia, A. de la Rosa, M. Vargas, F. Mar-rero // Rev. Esp. Cardiol. 2003. Vol. 56. № 6. P. 555-560
8. Petrovsky y.Diurnal rhythms of pro-inflammatory cytokines: regulation by plasma Cortisol and therapeutic implications / N. Petrovsky, P. McNair, L.C. Harrison // Cytokine. 1998. Vol. 10. № 4. P. 307-312.
9. Xie H.F. Effect of corticosteroids on the balance of Th cytokines in patients with systemic lupus erythematosus / H.F. Xie, J. Li, W. Shi // Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2002. Vol. 27. № 6. P. 533-535.
10. Quantitative analysis of human immunoregulatory cytokines by electrochemiluminescence method / S.V. Sennikov, S.V. Krysov, T.V. Injelevskaya, A.N. Silkov, L.V. Grishi-na, V.A. Kozlov // J. Immunol. Methods. 2003. Vol. 275 (1-2). P. 81-88.
11. Relationship between 24-hour rhythm in antiviral effect of interferon-beta and interferon-alpha/beta receptor expression in mice / H. Takane, S. Ohdo, R. Baba, S. Koyanagi, E. Yukawa, S. Higuchi // Jpn. J. Pharmacol. 2002. Vol. 90. № 4. P. 304-312.
Таблица 1
Спонтанная и КонА-стнмулнрованная продукция ИЛ-2 тимоцитами,
выделенными в разное время суток после утреннего и вечернего введения ИЛ-2 (пкг/мл; M±m; количество животных в каждой группе - 18, в каждой временной точке - по 6 из каждой группы)
Экспериментальная группа 10.00 ч 15.00 ч 20.00 ч
Контроль (спонтанная продукция) 0,00±0,00 74,18±35,13* 1191,58±573,20*
Контроль (стимулированная продукция) 0,00±0,00 126,27±56,66* 4365±2902,44*
Введение ИЛ-2 утром (спонтанная продукция) 119,07±117,24# 12,67±6,29 66,79±35,46
Введение ИЛ-2 утром (стимулированная продукция) 132,92±98,19& 29,01±16,01 68,33±41,75
Введение ИЛ-2 вечером (спонтанная продукция) 75,16±34,16& 53,31±16,51 259,21±244,88
Введение ИЛ-2 вечером (стимулированная продукция) 0,66±0,63# 69,39±46,60* 100,66±61,53*
Примечание. * - отличия от точки 10.00 ч достоверны при p<0,05; # - отличия от контроля достоверны при p<0,05; & -отличия от контроля достоверны при p<0,001 (критерий Крускалла-Уоллеса).
Таблица 2
Продукция ИЛ-2 стимулированными и нестимулированными спленоцитами,
выделенными в разное время суток после утреннего и вечернего введения ИЛ-2 (пкг/мл; M±m;
количество животных в каждой группе - 18, в каждой временной точке - по 6 из каждой группы)
Экспериментальная группа 10.00 ч 15.00 ч 20.00 ч
Контроль (спонтанная продукция) 21,78±12,62 145,29±92,89 239,03±117,15
Контроль (стимулированная продукция) 616,53±196,84 348,43±79,19 795,42±333,39
Введение ИЛ-2 утром (спонтанная продукция) 10,55±6,11 162,62±113,81 270,47±258,57
Введение ИЛ-2 утром (стимулированная продукция) 621,10±128,13 843,76±241,33 477,19±142,14
Введение ИЛ-2 вечером (спонтанная продукция) 18,52±10,02 314,60±150,39 54,75±34,07
Введение ИЛ-2 вечером (стимулированная продукция) 1022,61±227,10* 836,33±303,60*# 413,04±151,74
Примечание. * - отличия от точки 20.00 ч достоверны при р<0,05; # - отличия от контроля достоверны при р<0,05 (критерий Крускалла-Уоллеса).
