CC BY
8ПРОДУКЦИЯ РЕСВЕРАТРОЛА ЭНДОФИТНЫМ ГРИБОМ ASPERGILLUS CHEVALIERIGF14SMUZ В УСЛОВИЯХ ТВЕРДОФАЗНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ВИНОГРАДНЫХ ВЫЖИМКАХ Насметова С.М., Махкамов С.А., Гулямова Т.Г. https://doi. org/10.5281/zenodo.8364717
Аннотация. Изучена ресвератрол - продуцирующая активность эндофитного гриба Aspergillus chevalieri GF14SMUz при твердофазном культивировании на виноградных выжимках. Установлено, что максимальный выход ресвератрол- 16,4 мг/кг растительного субстрата наблюдается на 10 сутки при заданных условиях культивирования, рН-7 субстрата и высоты слоя субстрата - 10 мм.
Ключевые слова: ресвератрол, эндофит Aspergillus chevalieri GF14SMUz, твердофазная ферментация, виноградные выжимки.
Abstract. The resveratrol-producing activity of the endophytic fungus Aspergillus chevalieri GF14SMUz during solid-phase cultivation on grape pomace was studied. It was found that the maximum yield of resveratrol - 16.4 mg/kg of plant substrate - is observed on the 10th day under given cultivation conditions, substrate pH-7 and substrate layer height - 10 mm.
Annotatsiya. Aspergillus chevalieri GF14SMUz endofit zamburug'ini qattiq fazali ozuqa muhiti ya'ni qayta ishlangan uzum ikkilamchi chiqindisida o'stirish orqali resveratrol ishlab chiqarish faolligi o'rganildi. Aniqlanishicha, resveratrolning maksimal sintezi o'simlik substratiningma'lum o'stirish sharoitida 10-kunipH-7 va substrat qatlamining balandligi - 10 mm bo'lgan muhitda 16,4 mg/kg gacha ortgaligi aniqlandi
Ресвератрол (3,5,4' -тригидроксистильбен) это натуральный полифенольный антиоксидант, который обладает различной фармакологической и биологической активностью. Известны его противоопухолевые, противовоспалительные, нейропротекторные, гипогликемические и другие терапевтические свойства (1-3). Полифункциональное действие ресвератрола привлекает внимание многих исследователей, стремившихся максимизировать скорость его производства и найти альтернативные источники биосинтеза.
Чаще всего ресвератрол получают из листьев, кожуры и семечек темных сортов винограда (4). Однако этот метод, обладает значительными недостатками, такими как длительное время роста, высокая стоимость, снижение урожайности и потребность в индукции с помощью абиотических и биотических факторов (5).
За последние годы появилось много сообщений о том, что эндофитные грибы являются многообещающим источником соединений, продуцируемых растением-хозяином. Считается, что в ходе эволюции сосуществование микроорганизмов внутри тканей живого растения сопровождалось горизонтальным переносом генов, в результате которого сформировались общие пути биосинтеза вторичных метаболитов (6,7).
Вместе с тем, одной из ключевых проблем в коммерческом производстве является значительное снижение продукции вторичных метаболитов при повторяющемся монокультивировании эндофитов в аксенических условиях.
Возможным подходом для сохранения уровня продукции целевого метаболита, в частности, ресвератрола, перспективно использование компонентов естественной ниши эндофита, то есть, метаболитов растения-хозяина. В этой связи вполне рационально было
1582
бы использовать отходы переработки красного винограда для твердофазной ферментации отобранных штаммов, продуцирующих ресвератрол
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служил гриб Aspergillus chevalieri GF14SMUz, выделенный нами ранее из кожуры винограда сорта «Изабелла» и отобранный как перспективный и стабильный продуцент ресвератрола (8).
Растительный субстрат - сухие виноградные выжимки измельчали и пропускали через сито с размером ячеек 3 мм, помещали в 500 мл колбы Эрленмейера, увлажняли до 35% питательной модифицированной средой Чапека для грибов следующего состава: (K2HPO4 - 1,00, MgSO4 - 0,50, KCl - 0,50, FeSO4 - 0,01, глюкоза - 12,5, пептон - 6,25, вода - 1 л, рН 7,3 ± 0,2). Стерильные колбы с субстратом инокулировали спорами концентрацией 106-108 спор/мл, из расчета 1,5 мл на 5 г сухих выжимок. Колбы культивировали в термостате при 28°С и отбирали в динамике роста - на 7-е, 10-е и 13-е сутки.
Для определения влажности 1 г ферментируемого субстрата взвешивали (W1), затем высушивали при 100-105°С до абсолютно сухого веса (W2). Содержание влаги ферментационного субстрата вычисляли по формуле: Влажность = (W1) - (W2)/ (W1)*100%, где W1-масса навески виноградных выжимок до высушивания, г; W2- масса выжимок после высушивания, г.
Рост штамма и синтез ресвератрола рассматривали при различных значения pH субстрата - 5, 7, и 9. Для этого, виноградные выжимки с исходным значением рН-5 регулировали с использованием 1 М гидроксида натрия до нужного значения. Для определения влияния уровня субстрата на выход ресвератрола, использовали различную высоту субстрата - 10мм (25 г), 20мм (40 г) и 30мм (55 г).
После окончания культивирования ферментированный субстрат высушивали при 100-105°С, измельчали в фарфоровой ступке до порошкообразного состояния и использовали для экстракции ресвератрола. Образцы экстрагировали этилацетатом в соотношении (1:5). Извлеченные экстракты пропускали через бумажный фильтр и сушили на роторном испарителе при температуре 45°С до сухого остатка. Для количественного определения ресвератрола сухие экстракты повторно растворяли в соотношении (1:5) в 96% этиловом спирте, пропускали через мембранный фильтр 0,45 мкм и мерили на ВЭЖХ.
Система ВЭЖХ была оборудована насосами LC-15C, оснащена С18-колонкой. Состав элюента: ацетонитрил и 0.1% фосфорная кислота (30:70 v/v). Объем вводимого образца - 20 pl Скорость протока 1.0 мл/мин при длине волны 306 нм. В качестве контроля использовали стандартный транс-ресвератрол. Продуктивность грибного ресвератрола определяли по кривой стандартного ресвератрола (0,1-1 мг/мл) (Sigma-Aldrich) в аналогичных условиях.
Статистическую обработку результатов исследований и математический анализ экспериментальных данных проводили путем определения среднего значения искомой величины из 3-х повторностей и доверительного интервала при помощи программного пакета Microsoft Excel.
Результаты и их обсуждение
При рациональном отборе растений для поиска ресвератрол-продуцирующих эндофитов наиболее часто исследуются растения винограда. Действительно, преобладающее большинство сообщений касаются эндофитных грибов, колонизирующих
1583
V. vinifera, Vitis quinquangularis и Cayratia trifolia (9,10). Так, из V. vinifera и V. quinquangularis выделен ряд эндофитных грибов, отнесенных к роду Aspergillus. Из них стабильную способность продуцировать ресвератрол, проявлял A. stellifer, выделенный из листьев V. vinifera сорта Мерло. Уровень ресвератрола составил в эндофите составил 288 мкг/л при глубинной ферментации культуры (11). Из сорта Cabernet sauvignon выделен штамм Aspergillus niger, продуцирующий в глубинной культуре 1,48 мг/л ресвератрола (12).
Вместе с тем., одной из ключевых проблем в коммерческом производстве является значительное снижение продукции вторичных метаболитов при повторяющемся монокультивировании эндофитов в аксенических условиях. В связи с этим, нами впервые была изучена возможность культивирования эндофитного гриба Aspergillus chevalieri GF14SMUz на виноградных выжимках.
Установлено, что заданные условия ферментации: рН-7 субстрата, высота 2 см при влажности 35%, инокуляцией спорами концентрацией 108 спор/мл вполне подходят для успешного развития мицелия гриба. Культура глубоко прорастает в субстрат и образует на 7-е сутки хорошо сформированный мицелий. При этом, в динамике роста штамма показано, что наиболее высокий выход ресвератрола наблюдается на 10-е сутки роста и составляет -15,8±0,5 мг/кг субстрата.
Сутки
Рисунок 1. Продукция ресвератрола эндофитным грибом A. chevalieri GF14SMUz в динамике роста на виноградных выжимках
Известно, что значительную роль в метаболизме и/или биосинтезе вторичных метаболитов играет pH среды, так как это связано с клеточной стенкой и свойствами проницаемости клеточной мембраны для захвата ионов или их потери в питательной среде.
Нами установлено, что кислый рН 5 и сильно щелочной рН 9 значительно поддерживали рост культуры и производство т-ресвератрола. Нейтральный рН-7 был самым оптимальным для роста A. chevalieri GF14SMUz и производство т-ресвератрола (рис.2). Shi J etal. также сообщали, что самое высокое производство т-ресвератрола грибом Alternaria sp. MG1 было при pH- 7 (13).
1584
Рисунок 2. Продукцию ресвератрола при культивировании А. скеуаНеп 0¥148Миг при различных значениях рН субстрата
Исследована зависимость эффективности продукции ресвератрола в зависимости от высоты слоя субстрата. Установлено, что максимальный прирост накопления ресвератрола наблюдается при высоте слоя 10 мм и составляет 16,4±0,7 мг/кг субстрата (рис.3). Установленный параметр имеет практическое значение для проектирования и конструирования растительных камер твердофазного культивирования.
Рисунок 3. Влияние высоты слоя субстрата на продукцию ресвератрола
На рисунке 4 представлен ВЭЖХ анализ этанольного экстракта А. сквуаНвп ОЕ148Ыи2. Как видно из профиля ВЭЖХ, пик основного метаболита гриба соответствует по времени выхода стандартному ресвератролу -7,2 мин.
Следует отметить, что ранее при изучении продукции ресвератрола А. сЪе\а11ет1 ОЕ148Ыи в условиях глубинного культивировании на модифицированной среде Чапека-Докса, максимальный выход продукта максимально составлял 1450 мкг/лна 11 сутки культивирования (14).
1585
(а) (б)
Рисунок 4. Профиль ВЭЖХ анализа: стандарт транс-ресвератрол (а); экстракт виноградных выжимок, ферментированных A. chevalieri GF14SMUz (б)
Таким образом, при сравнительной оценке продуктивности ресвератрола после глубинной и твердофазной ферментации штамма следует, что метод твердофазной ферментации A. chevalieri GF14SMUz по многим показателям превосходит глубинное культивирование. Твердофазная ферментация позволяет сократить время культивирования при меньших затратах средств, связанных с необходимостью аэрации и использованием дорогостоящих питательных сред, а также более чем в 11 раз увеличить специфическую продуктивность ресвератрола.
Shi et al. сообщали, о колебаниях биосинтеза ресвератрола при глубинном культивировании Alternaría sp. MG1. Авторы предположили, что снижение биосинтеза ресвератрола может быть связано с отсутствием присутствия растения-хозяина во время культивирования грибов, что может привести к нестабильной экспрессии гена ресвератрола. Следовательно, исследование ключевых генов, кодирующих пути ресвератрола, даёт основную информацию о механизме трансформации и снижении продуктивности (13).
Из приведенных данных наших исследований, можно заключить, что значительное увеличение производства ресвератрола в штамме A. chevalieri GF14SMUzп ри SSF на виноградных выжимках можно объяснить значительной активацией генов биосинтеза стильбенов - фенилаланин-аммиак-лиаз (PAL) и стильбен-синтаз (STS), вызванных присутствием растения-хозяина.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что эндофитный гриб A. chevalieri GF14SMUz обладает большим потенциалом для улучшения продукции ресвератрола при твердофазной ферментации на виноградных выжимках в колбах за короткий период времени. Повышение производства ресвератрола штаммом A. chevalieri GF14SMUz за счет оптимизации процесса ферментации еще больше открывает возможности последующего улучшения культуры для коммерческого производства ресвератрола.
REFERENCES
1. Philipp Saiko, AkosSzakmary, Walter Jaeger, Walter Jaeger, Thomas Szekeres. Resveratrol and its analogs: Defense against cancer, coronary disease and neurodegenerative maladies or just a fad? Mutation Research/Reviews in Mutation Research Volume 658, Issues 1-2, January-February 2008; Pages 68-94.
1586
2. Baur, J. A., and Sinclair, D. A. (2006). Therapeutic potential of resveratrol: the in vivo evidence. Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 493-506. 3. Zordoky BN, Robertson IM, Dyck JR. Preclinical and clinical evidence for the role of resveratrol in the treatment of cardiovascular diseases. BiochimBiophysActa. 2014; 852:1155-1177.
3. Roat, C., and Saraf, M. Isolation and screening of resveratrol producing endophytes from wild grape Cayratiatrifolia. Int. J. Adv. Agric. Sci. Technol. 2017; 4, 27-33.
4. Wang, J., Yang, Y., and Yan, Y. (2018). "Bioproduction of resveratrol," in Biotechnology of natural products, eds W. Schwab, B. M. Lange, and M. Wüst (Berlin: Springer), 61-79.
5. Strobel, G., and Daisy, B. (2003). Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67, 491-502
6. Mohamed, H., Hassane, A., Atta, O., and Song, Y. Deep learning strategies for active secondary metabolites biosynthesis from fungi: harnessing artificial manipulation and application. Biocatal. Agric. Biotechnol. 2021; 38:102195.
7. S.M. Nasmetova, S.A. Makhkamov, D.M. Ruzieva, L.I. Abdulmyanova, K.V. Kondrasheva, T.G. Gulyamova. Isolation and Screening of Resveratrol-Producing Activity of Endophytes from VitisVinifera Grapes in Uzbekistan. Chinese journal of industrial hygiene and occupational diseases 2021, Vol.39No.13 p. 477-485.
8. Roat С., Saraf M. Isolation and screening of resveratrol producing endophytes from Wild Grape Cayratia Trifolia. // International Journal of Advances is Agricultural Science and Technology. 2017; V.4. №11. P. 27-33.
9. Handore A., Khandelwal Sh. Preliminary screening of resveratrol producing endophytes isolated from Vitis vinifera by technique of tissue culture. // International Journal of Advance Research and Science and Engineering. 2018; V.7. № 7. P. 142-151.
10. Roat, C., and Saraf, M.. Isolation and characterization of t-resveratrol and a-viniferin, a bioactive secondary metabolite of an endophytic fungus Aspergillus stellifer AB4, from Vitisvinifera.J. Microbiol. Biotechnol. Food Sci. 2020; 9, 708-713.
11. Liu, Y., Nan, L., Liu, J., Yan, H., Zhang, D., and Han, X. (2016a). Isolation and identification of resveratrol-producing endophytes from wine grape Cabernet Sauvignon. Springerplus 5:1029.
12. Shi, J., Zeng, Q., Liu, Y., and Pan, Z. Alternaria sp. MG1, a resveratrol- producing fungus: isolation, identification, and optimal cultivation conditions for resveratrol production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012; 95, 369-379.
13. Махкамов С.А., Насметова С.М., Гулямова Т.Г. Оптимизация продукции ресвератрола эндофитным грибом Aspergillus chevalieri GF-14 в условиях глубинного культивирования // Universum: химия и биология: электрон. научн. журн. 2023. 8(110).
1587
