CC BY
74ЭНЕРГИЯ БИОМАССЫ
ENERGY OF BIOMASS
Статья поступила в редакцию 30.04.14. Ред. per. № 1994
The article has entered in publishing office 30.04.14. Ed. reg. No. 1994
УДК 620.95:504.7
ПРОБЛЕМЫ ПОЛУЧЕНИЯ БИОТОПЛИВА ТРЕТЬЕГО ПОКОЛЕНИЯ: ВОЗДЕЙСТВИЕ СТРЕССОРОВ НА НАКОПЛЕНИЕ НЕЙТРАЛЬНЫЕ ЛИПИДОВ В СИНЕ-ЗЕЛЕНЫ1Х ВОДОРОСЛЯХ
(ЦИАНОБАКТЕРИЯХ)
Н.И. Чернова, С.В. Киселева, С.И. Зайцев
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова 119991 Москва, Ленинские горы, д.1, географический факультет, НИЛ ВИЭ [email protected]
Заключение совета рецензентов 06.05.14 Заключение совета экспертов 14.05.14 Принято к публикации 21.05.14
Методы поиска новых нетрадиционных источников непищевого возобновляемого сырья для биотоплива третьего поколения на основе биомассы микроводорослей являются предметом рассмотрения в данной статье. Представлены результаты апробации метода скрининга липидосодержащих микроводорослей/цианобактерий на основе окрашивания клеток флуоресцентным красителем Нильским красным. Исследовано воздействие повышенной и пониженной инсоляции, субоптимальных температур и лимитирования азота и фосфора в питательных средах на содержание липидов в клетках клоновых культур A.platensis: шт.геехши 1/02-П и шт. rsemsu 1/02-Т. Показано, что исследуемые культуры под влиянием стрессоров могут аккумулировать в клетках нейтральные липиды до промышленно значимых количеств. Поскольку артроспира массово культивируется дешевым открытым способом без контаминации другими видами, отличается легкостью сбора урожая, ее можно рассматривать как перспективный источник сырья для производства биотоплива третьего и четвертого поколений, а также в сельском хозяйстве, фармацевтике, производстве биологически активных пищевых и кормовых добавок.
Ключевые слова: биоэнергетика, альгология, микроводоросли, цианобактерии, открытые и закрытые фотобиореакторы, биотопливо, биодизель, липиды, триацилглицериды, флуоресцентный краситель Нильский красный.
THIRD-GENERATION BIOFUEL: THE EFFECTS OF STRESSORS ON THE ACCUMULATION OF NEUTRAL LIPIDS IN BLUE-GREEN ALGAE
(CYANOBACTERIA)
N.I. Chernova, S. V. Kiseleva, S.I. Zaytsev
Renewable Energy Sources Laboratory Geographical Faculty of Lomonosov Moscow State University 1 Leninskiye Gory, Moscow, 119991
Referred 06.05.14 Expertise 14.05.14 Accepted 21.05.14
Methods of search for new non-traditional sources of non-food renewable raw materials for biofuel third generation based on biomass of microalgae are the topic of this article. The results of testing of a screening lipid-containing microalgae / cyanobac-teria based on staining with the fluorescent dye Nile red are presented. The effect of high and low light intensity, suboptimal temperatures and nitrogen and phosphorus starvation in the nutrient media on lipid content in the cells of selected clonal cultures A. platensis1/02-P and 1/02-T has been studied. It is shown, that the studied culture under the influence of stressors can accumulate in the cells of neutral lipids to commercially significant quantities. Since artrospira massively cultivated cheap open way without contamination of other species, characterized by its ease of harvest, it can be regarded as a promising source of raw material for the production of biofuel third and fourth generations , as well as in agriculture, pharmaceuticals, biologically active food and feed additives.
Key words: bioenergy, algology, rides, fluorescent dye Nile red.
microalgae, cyanobacteria, open and closed photobioreactors, biofuel, biodiesel, lipids, triacylglyce-
International Scientific Journal for Alternative Energy and Ecology № 12 (152) 2014
© Scientific Technical Centre «TATA», 2014
Чернова Надежда Ивановна
Сведения об авторе: ведущий научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории возобновляемых источников энергии (НИЛ ВИЭ) географического ф-та МГУ имени М.В. Ломоносова, к.б.н.
Образование: биолого-почвенный факультет МГУ имени М.В. Ломоносова.
Область научных интересов: биоконверсия солнечной энергии; водорослевая энергетика: скрининг микроводорослей и цианобактерий для их промышленного культивирования.
Публикации: более 100, в том числе патенты на изобретения.
Киселева Софья Валентиновна
Сведения об авторе: ведущий научный сотрудник НИЛ ВИЭ географического ф-та МГУ имени М.В. Ломоносова, к. ф.-м. наук.
Образование: физический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова.
Область научных интересов: оценка ресурсов возобновляемой энергетики, применение геоинформационных технологий в энергетике; лабораторное моделирование динамических процессов в океане.
Публикации: более 100, в том числе патенты на изобретения.
Зайцев Сергей Иванович
Сведения об авторе: ведущий научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории возобновляемых источников энергии (НИЛ ВИЭ) географического ф-та МГУ имени М.В. Ломоносова, к. ф.-м. н.
Образование: физический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова.
Область научных интересов: возобновляемая энергетика, в т.ч. установки солнечной энергетики и фотобиореакторы; лабораторное моделирование геофизических процессов в океане.
Публикации: более 80, в том числе патенты на изобретения.
Введение
Фотосинтезирующие микроорганизмы, в частности микроводоросли, являются объектом фотобиотехнологии. Повышенный интерес к биотехнологиям с применением микроводорослей и цианобактерий обусловлен использованием их биомассы не только для конверсии солнечной энергии в различные энергоносители, но и для получения биологически активных пищевых и кормовых добавок, ценных вторичных метаболитов, обладающих антивирусным, антибактериальным, противогрибковым, противомалярийным, противоопухолевым и противовоспалительными свойствами и имеющих терапевтическое, промышленное и сельскохозяйственное значение. В настоящее время масличные водоросли являются наиболее популярными в области микробного биотоплива из-за их способности производить значительные объемы триацилглицеридов (ТАГ). Топливо, производимое из водорослей, относят к биотопливу третьего (водоросли, специально выращиваемые для энергетических целей) и четвертого поколений (генетически модифицированные водоросли, конвертирующие С02 непосредственно в топливо). Научно-исследовательские работы авторов были направлены на разработку и апробацию крупномасштабных способов культивирования микроводорослей (МКВ), а также переработку микроводорослевой биомассы в удобные для использования виды сырья. 0бъектом исследования
были представители зеленых и сине-зеленых МКВ: хлорелла, дуналиелла и спирулина [1, 2, 3, 4, 5].
В связи с уникальностью компонентов биомассы изучалось применение МКВ спирулины/артроспиры в качестве биологически активных пищевых и кормовых добавок: были проведены испытания спирулины в качестве кормовой добавки в птицеводстве, животноводстве и звероводстве, разработаны методические рекомендации по ее применению и получены 3 патента РФ [6, 7, 8, 9]. Были разработаны теоретические подходы и созданы лабораторные модели интегрированных систем, в которых водоросли выступали в качестве: 1) источника метана и углекислого газа; 2) шлама, служащего удобрением и биостимулятором для растений; 3) пищевой и кормовой добавки [10, 11,12]. Объектом наших исследований были представители зеленых и сине-зеленых микроводорослей: хлорелла, дуналиелла и спирулина/артроспира.
В последние годы основным направлением научно-исследовательских работ авторов стал поиск новых нетрадиционных источников непищевого возобновляемого сырья для биотоплива третьего поколения на основе биомассы МКВ. С этой целью проводился скрининг МКВ, находящихся в коллекциях и выделенных из природных образцов [1, 13, 14, 15]. Такой интерес к микроводорослям обусловлен тем, что они удовлетворяют всем требованиям, предъявляемым к растительному энергетическому сырью, а по своей естественной биопродуктивности и энергосодержанию в десятки
Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология» № 12 (152) 2014 © Научно-технический центр «TATA», 2014
раз превышают традиционно используемые для этих целей сельскохозяйственные растения. Традиционно с микроводорослями связывали получение пере-этерификацией из содержащихся в них липидов биодизельного топлива. В настоящее время разработаны новые технологии получения из липидосодержащей биомассы топлива для военно-морского флота и авиации.
0пределяющим фактором использования водорослей в энергетических целях является высокое содержание в них неполярных липидов, в основном триацилглицеридов (ТАГ), являющихся лучшим источником для получения биотоплива, - и возможность управлять их накоплением путем изменения условий культивирования. 0бщее содержание липидов в микроводорослях обычно варьирует от 1-85% сухого веса, причем выше 40% обычно получается в условиях дефицита биогенов [16]. Такие факторы, как освещение, температура также оказывают влияние на липидное содержание и липидную композицию во многих водорослях [17, 18].
0днако внедрение перспективных штаммов-продуцентов липидов в производство биотоплива осложняется следующим известным обстоятельством: одновременное достижение высокой продуктивности по биомассе и по липидам при культивировании микроводорослей невозможно. Индукция биосинтеза и аккумулирования липидов может быть достигнута путем создания физиологического стресса: лимитирование или голодание по азоту и/или фосфору; максимальные или минимальные значения интенсивности светового потока, рН; температурный режим; облучение ультрафиолетом; воздействие тяжелых металлов и других химических веществ; осмотический стресс и др. 0дним из возможных путей максимального накопления биомассы микроводорослей с оптимальным содержанием липидов является проведение культивирования в две стадии [1, 5, 19, 20]. Первая стадия включает в себя максимальное накопление биомассы в оптимальных условиях роста. На второй стадии культивирования микроводорослей осуществляется перевод полученной биомассы в стрессовые условия для индукции синтеза и аккумулирования липидов.
В настоящее время одним из наиболее известных и культивируемых дешевым открытым способом видов микроводорослей является АгШгозрпа р1а1еш1Б (сине-зеленые микроводоросли согласно Международному кодексу номенклатуры
водорослей, грибов и растений или цианобактерии по современной бактериологической классификации). Микроводоросли/цианобактерии АтШто-5р1га/8р1гиИпа р1а1еш1Б (СуапорИусеае) выращиваются в мире открытым способом в больших масштабах и применяются как пищевая и кормовая добавка. Ценность биомассы различных штаммов А.рМеш18 определяется высоким содержанием легкоусвояемого белка, включающего все
незаменимые аминокислоты, углеводов, липидов, полиненасыщенных жирных кислот (особенно большим количеством ценных линолевой и у-линоленовой кислот), широким спектром витаминов группы В, наличием ß-каротина, фикоцианина, хлорофилла а и т.д. Преимуществами A.platensis являются ее способность расти в открытых культиваторах без контаминации другими микроорганизмами вследствие высокой щелочности питательной среды для ее выращивания (рН>8,5) и дешевый способ сбора биомассы. [1, 21]. Нами разрабатывалась биотехнология промышленного культивирования артроспиры в лабораторных, натурных экспериментах (Крым, Кацивели) и в условиях тепличных комплексов в различных регионах РФ, Украины, Приднестровья, Молдавии и Эстонии [1, 22, 23]. Значительный опыт работы с этими водорослями, относительно простые и дешевые технологии их выращивания и сбора биомассы позволили нам использовать их как модельный объект при отработке методов скрининга липидосодержащих микроводорослей, а также определении оптимальных условий накопления липидов в биомассе. С целью повышения содержания липидов мы осуществили культивирование нескольких штаммов этих микроводорослей двухстадийным способом.
с
Методы исследования
сэ
Штаммы микроводорослей и условия культивирования. В качестве объекта исследования были выбраны три клоновых культуры Arthrospira platensis (Nordst.) Geitl.: штамм rsemsu 1/02 (спиральный), штамм rsemsu 1/02-П (прямой) и штамм rsemsu 1/02-Т (релаксированный). A.platensis шт. rsemsu 1/02 (спиральный) выделен из фотокультиватора пилотной установки НИЛ ВИЭ, где она выращивалась в полунепрерывном режиме в течение 15 лет. В процессе изучения естественной изменчивости по морфологическим признакам клоновой культуры A.platensis шт. rsemsu 1/02 были получены два штамма: шт. rsemsu 1/02-П/03 (прямой) и шт .rsemsu 1/02-Т (релаксированный), отличавшиеся геометрией и размерами спирали от исходного штамма (штаммы были выделены н.с. НИЛ ВИЭ Т.П. Коробковой). Для культивирования штаммов используется классическая среда Заррука (жидкая и агаровая) [24]. Микроскопический анализ проводился на микроскопе «Axioplan 2 Imaging» с камерой высокого разрешения «AxioCam MBm» и модульной системой обработки и анализа изображений «AxioVision 3.1.» фирмы Carl Zeiss.
Для работ по культивированию микроводорослей-продуцентов липидов в лаборатории ВИЭ был разработан и смонтирован экспериментальный фотобиореактор (ФБР) для двухстадийного культивирования микроводорослей, включающий культиваторы открытого и закрытого
International Scientific Journal for Alternative Energy and Ecology № 12 (152) 2014
© Scientific Technical Centre «TATA», 2014
типа. Блок открытого культивирования состоит из 6 культиваторов, представляющих собой открытые кюветы размером 500x500 мм, в которых находится жидкая питательная среда с микроводорослями. Глубина слоя культуральной жидкости может изменяться от 50 до 100 мм. Каждый культиватор имеет свой независимый светодиодный источник освещения с определенным спектром и регулируемой интенсивностью светового потока. Разработанная нами светодиодная система освещения позволяет облучать микроводоросли фотонами разной длины волны с регулируемой интенсивностью. Система освещения включает в себя светильники с белыми, красными и синими светодиодами фирмы Edison Opto. Для получения максимальной и равномерной освещенности всей водной поверхности культиватора используются рассеивающие линзы. Измерения освещенности поверхности кювет ФБР осуществлялись с помощью прибора Flux Apogee (MQ-200). Поскольку только верхний слой культуральной жидкости был достаточно освещен, а световой поток должен равномерно распределяться по всему объему биомассы, необходимо было использовать перемешивающее устройство (скорость движения поверхностных мешалок порядка 0,1 м/с). Обогащение питательной среды углекислым газом осуществляется путем барботирования её газо......................................... а
воздушной смесью через распылители. Система газоподготовки включает в себя резервуар С02 (газгольдер объемом 600 л), смесители, подводящие трубки, микровентили, регулирующие скорость подачи газов и газовых смесей. Газгольдер является долговременным источником С02, обеспечивающим постоянное давление смеси на входе. Таким образом, решается проблема поддержания условий эксперимента постоянными в течение длительного периода. Предусмотрена регулировка концентрации С02 в каждом из культиваторов фотобиореактора отдельно. Контроль за составом газо-воздушной смеси осуществляется с помощью газоанализатора Drager X-am 7000 с диапазоном измерения 0,03-5%. Кроме того, использовались 2 больших плоскостных культиватора объемом по 500 л культуральной среды с аналогичной системой перемешивания. Для освещения применялись лампы ДРЛФ-400. Блок закрытого культивирования включает: 1) фотобиореакторы - колбы объемом 1-3 литра с подачей газо-воздушной смеси; 2) систему освещения - белые светодиодные светильники фирмы Edison Opto с рассеивающими линзами; 3) систему газоподготовки и газоанализатор Drager X-am 7000 (см. описание выше). На рис. 1 представлены фото отдельных блоков для культивирования микроводорослей .
Рис. 1. Установки для культивирования микроводорослей НИЛ ВИЭ: а - закрытые фотобиореакторы; б - малые открытые культиваторы (20-30 л); в - большие открытые
культиваторы (500 л) Fig. 1. Settings for the cultivation of microalgae NEIL RES: closed photo-bioreactors; small open cultivation (20-30 l); large outdoor cultivation (500 l)
tSJUEE
Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология» № 12 (152) 2014 © Научно-технический центр «TATA», 2014
73
Методы липидной индукции
Нами изучалось влияние повышенной и пониженной инсоляции, субоптимальных температур и лимитирования азота и фосфора в питательных средах на содержание липидов в клетках указанных МКВ. Оптимальный способ выращивания, как уже отмечалось нами выше, - двухстадийное культивирование в ФБР. Рассмотрим особенности двухста-дийного культивирования для A.platensis шт. rsemsu 1/02-П и шт. rsemsu 1/02-Т.
Получение посевного материала для первой стадии A.platensis шт. rsemsu 1/02-П проводили в закрытых ФБР объемом 1000 мл, содержащих 600 мл среды Заррука; барботаж смесью углекислого газа и воздуха с содержанием СО2 2% (объемных); освещение I = (55±5) дБ/(м2*с); световой режим - постоянный; Т = 25 ± 1°С; продолжительность культивирования - 14 сут. Полученным посевным материалом засевали плоскостные открытые культиваторы с питательной средой Заррука объемом 20 л с теми же условиями барботажа и освещенности. При таком способе культивирования достигалась продуктивность артроспиры по биомассе 10-12 г/м2 в сутки по сухому весу. Биомасса микроводорослей отделялась от культуральной жидкости фильтрацией на ситах с размером ячеек 150^200 мкм. На второй стадии получение биомассы A. platensis шт. rsemsu 1/02-П осуществлялось в условиях физиологического стресса (повышенная инсоляция и питательная среда, лимитированная по азоту). Биомассу МКВ, полученную на первой стадии выращивания, отделяли от культуральной жидкости фильтрацией, трижды промывали стерильной средой Заррука без азота и фосфора и помещали в плоскостные открытые культиваторы экспериментального модуля ФБР, заполненные 20 л питательной среды Заррука без азота и фосфора, при этом плотность культуры была относительно небольшой, чтобы созданный световой поток порядка 250 ± 25цБ/(м2*с) за счет поверхностного перемешивания культуральной жидкости равномерно облучал биомассу (световой режим -постоянный, Т = 25° ± 1°С). Голодание по азоту и фосфору и высокая освещенность создают для культуры физиологический стресс, при котором дальнейший рост и развитие микроводорослей тормозятся, но стимулируется аккумуляция липидов в клетках. В условиях физиологического стресса культура микроводорослей выдерживалась в течение 14 сут. Биомасса микроводорослей отделялась от культу-ральной жидкости фильтрацией на ситах. Кроме того, в НИЛ ВИЭ в течение более 20 лет поддерживается полунепрерывное культивирование данного штамма в больших открытых плоскостных культиваторах объемом 1000 л и 500 л (освещение I = 50±5 цБ/(м2*с); световой режим - постоянный; Т = 21±3°С; поверхностное перемешивание культураль-ной жидкости со скоростью порядка 0,1м/с). Эти условия также рассматривались нами как стрессовые.
A.platensis шт. rsemsu 1/02-T на первой стадии выращивали в закрытых ФБР объемом iGGG мл, содержащих 6GG мл среды Заррука; барботаж смесью углекислого газа и воздуха с содержанием 2% (объемных); освещение I = (55±5) ^E/^xc); световой режим - постоянный; Т = 25 ± i°C; продолжительность культивирования - i4 сут. На второй стадии часть биомассы, полученной на первой стадии отфильтровывали и трижды промывали стерильной средой Заррука без азота и фосфора, помещали в открытые плоскостные ФБР объемом i,G л с G,5 л среды Заррука без азота и фосфора на магнитные мешалки с интенсивностью перемешивания SGG об/мин; освещение I = (4GGi25) ^E/M2xc); световой режим - постоянный; Т = 25°±i°C; продолжительность культивирования - 2 сут. При этом плотность культуры была относительно небольшой, чтобы созданный световой поток за счет перемешивания равномерно облучал биомассу.
Удержание липидов в полученной биомассе определялось на спектрофлуориметре (Shimadzu) с красителем Нильским красным (определения выполнены н.с. HB. Лягиным из ИБХФ РАН в рамках совместного проекта TK № 16.5í2.ÍL2ÍS1, ФЦП «Исследования и разработки ...»). Предварительно биомассу MKB подвергали термообработке на водяной бане при 1GG°C в течение 1G мин. Экстракция липидов из предобработанной биомассы проводилась по методу Фольша [25], затем к 1G мкл органической фазы добавляли 2 мл 50мкM раствора Нильского красного в ДМ^. Интенсивность флуоресценции определяли при длинах волн 4S5 и бЗ5 нм для возбуждения и эмиссии соответственно.
Окрашивание клеток микроводорослей
флуоресцентным красителем Нильским красным
Проблема быстрого и точного качественного и количественного определения липидов в микроорганизмах в настоящее время привлекает к себе пристальное внимание. Традиционный весовой метод определения липидов занимает около 5 дней и требует выращивания и накопления биологического материала в количестве как минимум 1G - 15 мг по сырому весу и манипуляций с органическими растворителями. При этом на культивирование MKB требуется около месяца. B результате работа с культурами MKB является крайне утомительной и громоздкой. B настоящее время наиболее перспективным для таких целей является окрашивание клеток флуоресцентным красителем Нильским красным (9-диэтиламино -5Н-бензо [а] феноксазина-5 -один) (Nile Red fluorescence, BioReagent, 9S% HPLC, Product Number 19123, Sigma, CAS Number 73S5-67-3, Molecular Mass 31S,37; Molecular Formula C1GH1SN2O2). Нильский красный относится к так называемым флуоресцентным зондам, так как при добавлении к липидосодержащим клеткам его молекулы связыва-
International Scientific Journal for Alternative Energy and Ecology № 12 (152) 2014
© Scientific Technical Centre «TATA», 2014
ются с липидами, а из параметров флуоресценции можно извлечь определенную информацию о структуре и функции данных биологических объектов. Кроме того, такого рода экспресс-метод может быть использован при проведении скрининга липидосодержащих культур среди микроводорослей. Поскольку нами и другими исследователями отмечались трудности окрашивания зеленых микроводорослей красителем Нильским красным, раство-ренным в ацетоне, в качестве растворителя мы использовали диметилсульфоксид (ДМСО) [26]. Для выявления в клетках МКВ липидных включений проводили окрашивание Нильским красным по следующей методике: в 1 мл ДМСО (конц.) растворяли 1 мг порошка Нильского красного и добавляли 1мл физраствора; затем к капле суспензии клеток на предметном стекле добавляли каплю приготовленного раствора Нильского красного и закрывали покровным стеклом. В результате финальная концентрация ДМСО (v/v) составила 25%, а концентрация Нильского красного - 0,25 мг/мл. Окрашивание проводилив течение 10, 20, 30, 40, 50, 60 и 90 мин при комнатной температуре. Для регистрации флуоресценции использовали люминесцентный микроскоп Микмед-2, вар.11 (ЛОМО) при возбуждении световым пучком с длиной волны 450-480 нм и отрезающем светофильтре с полосой излучения фильтра 515 нм.
Результаты и их обсуждение
Отличительной особенностью штаммов, используемых для получения биомассы артроспи-ры/спирулины в промышленном масштабе, является их высокий полиморфизм, проявляющийся как в стационарных условиях культивирования, так и являющийся следствием измененных физико-химических условий выращивания [27]. Изменению подвергается в основном геометрия спирали вплоть до появления прямых трихомов, которые могут составлять от 10 до 100% биомассы. Появление в культиваторах прямых вариантов трихомов создает определенные трудности в технологическом процессе получения биомассы, связанные с установлением альгологической чистоты культуры [28]. Поддержание культур в коллекции, а также промышленное выращивание микроводорослей требует частых пересевов (пассажей), при которых происходит полная замена спиральных форм на прямые. Таким образом, возникает необходимость изучения морфологической изменчивости культуры при пассажах (рис. 2).
a ^lGG)
b ^lGGG)
c (x4GG)
d ^2GG)
e (x2GG)
Рис. 2. Морфологические варианты Arthrospiraplatensis: a - исходная культура шт. rsemsu 1/02; b, c - шт. rsemsu 1/02-Ф'; d - шт. rsemsu 1/02-П; e - шт. rsemsu 1/02-T Fig. 2. Morphological variants Arthrospira platensis: a - the original culture of strain rsemsu 1/02; b, c -strain rsemsu 1/02-F '; d - strain rsemsu 1/02-P; e - strain rsemsu 1/02-T
Мы изучали естественную изменчивость исходной клоновой культуры А.р1а1еш1Б шт. геегши 1/02 (рис. 2а) по морфометрическим признакам в зависи-
мости от числа пассажей в стабильных одинаковых условиях культивирования. В результате было установлено, что при многократных пассажах с интерва-
Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология» № 12 (152) 2014 © Научно-технический центр «TATA», 2014
лом в две недели появляются другие морфологические варианты: веретеновидные (рис. 2Ь), гантеле-видные (рис. 2с), прямые или слегка волнистые трихомы (шт. геешБи 1/02-П, рис. 2ф и слабо спирализо-ванные утолщенные (шт. геетои 1/02-Т. рис.2е). Дальнейшие исследования показали, что шт. геешБи 1/02-П и шт. геешБи 1/02-Т оказались стабильными при многочисленных пересевах и хранении, не ре-вертировали к исходной культуре (шт. геешБи 1/02), не давали новых вариантов в течение всего срока наблюдений (в течение 5 мес. при более чем 10 пас-
сажах) и при хранении культур в течение десяти лет. При этом сохранялись все полезные свойства биомассы, присущие исходному штамму геепши 1/02. Таким образом, было показано: геометрия трихомов и их размеры не могут служить основным таксономическим критерием для видовой систематики рода артроспира, что имеет фундаментальное и практическое значение в технологиях промышленного выращивания [9, 29].
Рассмотрим некоторые результаты воздействия стресса на изученные культуры (таблица).
Таблица
Содержание липидов в биомассе различных штаммов Arthrospira platensis, выращенных при различных условиях культивирования: (с) - опыт проводился в условиях стресса; (ci) - различные варианты стрессоров;
«без азота и фосфора» - вид стрессора
Table
The lipid content in biomass of different strains of Arthrospira platensis, grown under different culture conditions: (c) - the experiment was conducted under conditions of stress, (ci) - options stressors; "without nitrogen and
phosphorus" - the kind of stressor
Вариант опыта Род/вид/штамм Условия культивирования Содержание липидов, %
1 Arthrospira platensis шт. rsemsu 1/02-П Плоскостные открытые культиваторы ФБР с питательной средой Зар-рука объемом 20 л с применением барботажа смесью углекислого газа и воздуха с содержанием С02 2% (объемных); освещение I = (55±5) цБ/(м2хс); световой режим - постоянный; Т = 25±1°С; продолжительность культивирования - 14 сут. 19,0
1(c) Arthrospira platensis шт. rsemsu 1/02-П Условия физиологического стресса: плоскостные открытые культиваторы ФБР с питательной средой Заррука без азота и фосфора объемом 20 л с применением барботажа смесью углекислого газа и воздуха с содержанием С02 2% (объемных); освещение I = (250±5) цЕ/(м2хе); световой режим -постоянный; Т = 25±1°С; продолжительность культивирования - 14 сут. 30,9
2(ci) Arthrospira platensis шт. rsemsu 1/02-П Среда У Заррука, полунепрерывное культивирование в открытых плоскостных ФБР объемом 500 л с поверхностным перемешиванием; освещение I = (45±5) цЕ/(м2хе); световой режим - постоянный, Т =21°±1°С, продолжительность культивирования - 45сут. 45,7
2(C2) Arthrospira platensis шт. rsemsu 1/02-П Условия физиологического стресса: плоскостные открытые культиваторы ФБР с питательной средой Заррука без азота и фосфора объемом 20 л с применением барботажа смесью углекислого газа и воздуха с содержанием С02 2°% (объемный); освещение I = (215±5) цЕ/(м2хе); световой режим -постоянный; Т = 25±1°С; продолжительность культивирования - 15 сут. 32,0
2(сз) Arthrospira platensis шт. rsemsu 1/02-П Условия физиологического стресса: плоскостные открытые культиваторы ФБР с питательной средой Заррука без азота и фосфора объемом 20 л с применением барботажа смесью углекислого газа и воздуха с содержанием С02 2°% (объемный); освещение I = (160±5 цЕ/(м2хе); световой режим -постоянный; Т =25±1°С; продолжительность культивирования - 15 сут. 26,1
3 Arthrospira platensis шт. rsemsu 1/02-T Среда Заррука, культивирование в закрытых ФБР объемом 1,0 л с бар-ботажем воздухом, содержащим 2% С02(об.); освещение I = (55±5) цБ/(м2хс); световой режим - день: ночь = 16:8; Т = 25±1°С; продолжительность культивирования - 14 сут. 36,1
3(c) Arthrospira platensis шт. rsemsu 1/02-T Условия физиологического стресса: среда Заррука без азота и фосфора, культивирование в открытых плоскостных ФБР объемом 1,0 л с перемешиванием на магнитной мешалке (скорость 800 об/мин), освещение I = (400±25) цЕ/(м2хе); световой режим - постоянный, Т = 25°±1°С; продолжительность культивирования - 2 сут. 47,1
Видно, что под влиянием подобранных нами условий физиологического стресса (отсутствие азота и фосфора и повышенная/пониженная инсоляция) в
вариантах опыта 1, 1(с), 3 и 3(с) в обоих штаммах Arthrospira platensis шт. rsemsu 1/02-П и шт. rsemsu 1/02-Т наблюдается значительное увеличение со-
International Scientific Journal for Alternative Energy and Ecology № 12 (152) 2014
© Scientific Technical Centre «TATA», 2014
держания липидов: с 19, 0 до 30, 9% и с 36,1 до 47, 1% соответственно. Аналогичные результаты были получены в работе [30], где наибольшее содержание липидов (17,05%) в биомассе Spirulina platensis было обнаружено в опыте с нулевым содержанием азота в питательной среде. Промышленно значимое содержание липидов в культуре A. platensis шт. rsemsu 1/02-П, составляющее 45,7%, было получено также при культивировании ее в полунепрерывном режиме в открытом плоскостном ФБР объемом 500 л в течение длительного срока (45 сут.) в условиях, близких к стрессовым (вариант опыта 2(с1)), а именно: затенение культуры вследствие увеличения плотности, значительный дефицит основных биогенных элементов в питательной среде, возрастающий рН среды от 8,5 до 11,5 и отрицательное воздействие выделяемых метаболитов. Дальнейшее воздействие
других экспериментальных стрессоров на эту культуру (вариант опыта 2(с2), 2(с3)) не привело к дополнительному увеличению содержания липидов в клетках, напротив, их количество значительно уменьшилось. Таким образом, воздействие стрессовых условий является специфичным по отношению к разным штаммам, поэтому подбор стрессоров является штаммоспецифичным.
В экспериментах со стрессом была апробирована методика скрининга липидосодержащих микроводорослей путем окрашивания их флуоресцентным красителем Нильским красным. На рисунке 3 представлены микрофотографии двух клоновых культур А. рШет1ь: шт. гьетьи 1/02-П (прямой) и шт. гьетьи 1/02-Т (релаксированный), окрашенных Нильским красным.
A. platensis шт. rsemsu 1/02-П (х1500)
b
A. platensis шт. rsemsu 1/02-П (х1500) 3 суток стресса
A. platensis шт. rsemsu 1/02-П (х1500)
A. platensis шт. rsemsu 1/02-П (х1500) 6 суток стресса
ISMEE
Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология» № 12 (152) 2014 © Научно-технический центр «TATA», 2014
77
a
d
с
% i
A. platensis шт. rsemsu 1/02-П (x600)
f
A. platensis шт. rsemsu 1/02-П (x600) 8 суток стресса
g
A. platensis шт. rsemsu 1/02-T (x600)
h
A. platensis шт. rsemsu 1/02-T (x600) 2 cyTOK стресса
I
A. platensis шт. rsemsu 1/02-T (x600)
A. platensis шт. rsemsu 1/02-T (x600) 30 суток стресса
Рис. 3. Окрашивание трихомов различных штаммов Arthrospira platensis флуоресцентным красителем Нильским красным: a, c, e, g, i -культура в световом микроскопе; b, d, f, h, j - окрашенные культуры в люминесцентном микроскопе после стресса (стрелками обозначены липидные гранулы желтого цвета) Fig. 3. Staining trichomes different strains of Arthrospira platensis fluorescent dye Nile red: a, c, e, g, i and culture in the light microscope, b, d, f, h, j - painted culture in the fluorescence microscope after stress (arrows indicate lipid granules yellow).
International Scientific Journal for Alternative Energy and Ecology № 12 (152) 2014
© Scientific Technical Centre «TATA», 2014
e
Культуры, выращенные в течение 14 суток в оптимизированных условиях (близких к оптимальным) не окрашиваются Нильским красным (не дают свечения, не флуоресцируют), поэтому фото этих вариантов опытов мы не приводим. После воздействия изучаемых нами стрессоров на культуры и их окрашивания Нильским красным в трихомах наблюдается золотисто-желтая флуоресценция липидных глобул. Спустя 3 суток воздействия стресса на культуру A. platensis шт. rsemsu 1/02-П (рис.3 b) окрашенные липидные глобулы начинают давать видимую в микроскопе флуоресценцию, а через 6 суток - свечение липидных гранул становится максимальным и остается таковым в течение времени проведения эксперимента (рис.34 3f). Воздействие низкой освещенности (освещение I = 2-4 ^Е/(м2*с) и понижен-ojjj^ ной температуры (10°С) в течение 30 суток также приводит к положительному результату - аккумулированию в клетках нейтральных липидов (рис.3_|).
Результаты экспериментов убедительно доказывают возможность использования красителя Нильского красного для обнаружения внутриклеточных £ нейтральных липидов (ТАГ) при флуоресцентной микроскопии. Как показали эксперименты, на флуоресценцию Нильского красного влияют используемый растворитель, температура и продолжительность окрашивания: лучший результат для исследованных культур был получен при использовании в качестве растворителя ДМСО с финальной концен-~ трацией 25% (v/v); при этом прокрашивание липид-| ных глобул достигается через 30 мин при комнатной температуре. Этот краситель может служить примером витальной окраски, которая позволяет относительно быстро выявлять содержащиеся в клетках нейтральные липиды. Определение оптимальных условий накопления нейтральных липидов в разных штаммах МКВ можно также проводить на основе окрашивания клеток Нильским красным.
Представленные в данной работе штаммы микроводорослей включены в базу данных культур фото-трофных микроорганизмов, которая была разработана с участием авторов [31]. База данных имеет узкую тематическую направленность и содержит информацию о перспективных с точки зрения получения биотоплива третьего поколения штаммах микроводорослей, в том числе штаммах, находящихся в лабораторной коллекции НИЛ ВИЭ. База данных позволяет осуществлять поиск и выборку штаммов по таксономическим признакам, используемым для культивирования питательным средам; способам культивирования; уровням коммерциализации производства биомассы и т. д. Дальнейшие работы по поиску, выделению из природной среды, подбору результативных методов культивирования предполагают включение новых штаммов в коллекцию лаборатории и БД фототрофных микроорганизмов -перспективных продуцентов сырья для биотоплива.
При постановке задачи культивирования микроводорослей для целей энергетики абсолютно необхо-
димым является рассмотрение текущей и потенциальной рентабельности процесса, конкурентоспособности получаемого топлива - биодизеля, биокеросина и т.д. В нашей работе [32] были обозначены некоторые подходы к оценке энергетической эффективности производства биотоплива из водорослей. Был сделан анализ теоретического предела продуктивности микроводорослей с учетом КПД фотосинтеза и максимально возможного уровня падающей солнечной радиации. Показано, что для районов Земли с максимальным приходом солнечной энергии эти величины могут достигать 280 т/га/год, для южных регионов России - 200 т/га/год. При реально достижимом количестве липидов в клетках микроводорослей порядка 40% продуктивность по маслу составит соответственно 102 и 71 т/га/год. Полученные на практике рекордные значения продуктивности биомассы микроводорослей - до 100 т/га/год - в условиях лабораторного эксперимента и пилотных проектов в целом не противоречат приведенным оценкам и доказывают принципиальную возможность введения микроводорослей в качестве энергетической культуры.
0днако экономическая рентабельность остается главной проблемой получения биотоплива из водорослей. Крупные проекты, осуществленные в 2000-х годах [19, 33], показали, что произведенный биодизель стал рентабельным (сравнялся по стоимости с нефтью в 2003 г.: 56 и 55 $ за баррель соответственно) только в самом эффективном случае (продуктивность зеленой микроводоросли НаетаЮсоссш pluvialis по маслу от 11,4 (в среднем) до 27,5 т/га/год (в максимуме)) [19], когда в экономических расчетах учитывались полученные сопутствующие продукты с высокой добавленной стоимостью. В более пессимистичных оценках затраты на 1 л биодизеля из микроводорослей (при различных технологиях культивирования, различных продуктивностях штаммов и т.п.) превышали затраты на его производство из канолы (рапса) в 3-21 раза [32].
Возможные пути повышения эффективности энергетического использования микроводорослей можно сформулировать следующим образом:
- Увеличение доступной падающей солнечной энергии, что требует размещения плантаций микроводорослей в экваториальных районах.
- Увеличение эффективности переноса фотонов к клеткам микроводорослей, что может быть достигнуто усовершенствованием конструкции системы культивирования и сокращением внутренних потерь.
- Увеличение эффективности использования фотонов за счет сокращения потерь в результате фото-ингибирования и других уменьшающих рост эффектов.
- Повышение эффективности аккумулирования энергии в биомассе, т. е. увеличение доли поступившей в клетку энергии, которая тратится на прямое запасание ее в виде целевого продукта (липидов), а не на функционирование клетки.
Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология» № 12 (152) 2014 © Научно-технический центр «TATA», 2014
Заключение
Интерес к липидам микроводорослей в последние годы обусловлен их высоким потенциалом в качестве сырья для производства моторного топлива, а также для фармацевтической, химической и пищевой промышленности. В мире активно ведутся поисковые и селекционные работы с целью получения высокопродуктивных штаммов микроорганизмов.
Объектом исследования служили три выделенные нами клоновые культуры цианобактерий/сине-зеленых микроводорослей АйЬгоБрпа рМеш18 (N0^1) веШ.: штамм геешБи 1/02 (спиральный); штамм геетои 1/02-П (прямой) и штамм геешБи 1/02-Т (релаксированный). Изучение полиморфизма этих клоновых культур показало, что геометрия трихомов не может служить основным таксономическим критерием для видовой систематики рода артроспира, что имеет фундаментальное и практическое значение в технологиях промышленного выращивания этих МКВ.
Показано, что исследуемые культуры цианобак-терий/сине-зеленых микроводорослей под влиянием определенных стрессоров могут аккумулировать в клетках нейтральные липиды до промышленно значимых количеств. Поскольку артроспира массово культивируется дешевым открытым способом без контаминации другими видами, отличается легкостью сбора урожая, ее можно рассматривать как перспективный источник сырья для производства биотоплива третьего и четвертого поколений, а также в сельском хозяйстве, фармацевтике, производстве биологически активных пищевых и кормовых добавок.
В качестве эффективного и быстрого способа оценки содержания липидов в микроводорослях при скрининге штаммов можно использовать окрашивание клеток водорослей флуоресцентным красителем Нильским красным. Определение оптимальных условий накопления нейтральных липидов в разных штаммах МКВ можно также проводить на основе окрашивания клеток Нильским красным.
Выявлена корреляция результатов, полученных методом окрашивания красителем Нильским красным органического экстракта из клеток МКВ (количественный метод определения на спектрофлуори-метре) и окрашиванием клеток МКВ (качественный метод регистрации с помощью люминесцентного микроскопа). Это говорит о возможности использования данного качественного метода в альгологиче-ской практике при скрининге продуцентов липидов.
Созданный задел позволяет проводить работы в направлении селекционных и физиолого-биохимических исследований с целью увеличения выхода биомассы и повышения содержания липидов в полученной биомассе микроводорослей под воздействием различных стрессоров.
Список литературы
I.Чернова Н.И., Киселева C.B., Коробкова Т.П., Зайцев С.И. Микроводоросли в качестве сырья для получения биотоплива // Альтернативная энергетика и экология. 2008. № 9. С. 68-74.
2. Чернова Н.И., Коробкова Т.П. Ресурсные и экологические проблемы энергетического использования биомассы // Возобновляемые источники энергии: Лекции ведущих специалистов / Под ред. А. А. Соловьева, C.B. Киселевой. М.: Изд-во ЧеРо, 2008. Вып.5. С. 78-91.
3. Чернова Н.И., Коробкова Т.П., Киселева C.B., Зайцев С.И. Биомасса как энергетический ресурс // Труды КубГАУ. 2009. № 4(19). С.203-208.
4. Коробкова Т.П., Чернова Н.И. Микроводоросли , - возобновляемый энергоресурс: современные направления исследований // Возобновляемые источники энергии. Курс лекций: Учебное пособие / Под
ред. А.А.Соловьева, С.В.Киселевой М.: МИРОС, 2010. С.156-170.
5. Chernova N.I., Korobkova T.P. and Kiseleva S.V. Use of Biomass for producing liquid Fuel: Current State and Innovation // Thermal Engineering. 2010. Vol. 57, No. 11. Р. 937-945.
6. Околелова Т.М., Байковская И.П., Чернова Н.И. и др. Технология получения и применения биомассы спирулины в комбикормах для птицы. Методические рекомендации. РАСХН-ВНИИТИП. Сергиев Посад, 1996. 20 с.
7. Пат. 2034499 Российская Федерация, МКИ3 С1 6 А 23 К 1/16. Способ приготовления премикса для сельскохозяйственной птицы / Околелова Т.М., Байковская И.П., Криворучко Л.И., Соловьев А.А., Лямин М.Я., Чернова Н.И. // Открытия. Изобретения. 1995. № 13. 5
8. Пат. 2137402 Российская Федерация, МКИ3 С1 6 A 23 L 1/302, A 61 K 35/80. Пищевая добавка / Зайцев С.И., Киселева С.В., Лебедева Е.М., Лямин М.Я., Самойленко И.И., Соловьев А. А., Чернова Н.И. // Открытия. Изобретения. 1999. № 26.
9. Пат. 2322489 Российская Федерация, МПК6 C1 C12N 1/12 C12/R 1/89. Штамм Arthrospira platensis (Nordst.) Geitl. 1/02-T/03-5 - продуцент белковой биомассы / Коробкова Т.П., Чернова Н.И., Киселева С.В., Зайцев С.И.// Открытия. Изобретения. 2008. №11.
10. Чернова Н.И., Киселева С.В., Чернов Н.М. Пищевая ценность спирулины: опыт выращивания и применения // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2001. №6. С.60-63.
II. Чернова Н.И., Лямин М.Я., Киселева С.В. Использование спирулины в пищевых продуктах // Пищевая промышленность. 2002. №2. С.80-82.
12. Сенько О.В., Гладченко М.А., Лягин И.В., Никольская А.Б., Маслова О.В., Чернова Н.И., Киселева С.В., Коробкова Т.П., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С. Д. Трансформация биомассы фототрофных
International Scientific Journal for Alternative Energy and Ecology № 12 (152) 2014
© Scientific Technical Centre «TATA», 2014
микроорганизмов в метан // Альтернативная энергетика и экология. 2012. №3. С. 89-94.
13. Чернова Н.И., Коробкова Т.П., Киселева С.В., Зайцев С.И. Биотопливо третьего поколения из микроводорослей: получение производственных штаммов и технологии выращивания // Энергообеспечение и энергосбережение в сельском хозяйстве. Труды 7-й Межд. науч.-техн. конф. (18-19 мая 2010г.). М.: ГНУ ВИЭСХ, 2010. Ч.4. С. 307-312.
14. Chernova N.I., Korobkova T.P., Kiseleva S.V., Zaytsev S.I., Radomskii N.V. Microalgae as source of energy: current situation and perspectives of use / Sustainable Manufacturing. SeligerGunther (Ed.), Springer-Verlag Berlin Heidelberg, XIII, Chapter 5, 2012. P.221-224.
15. Raslavicius L., Semenov V.G., Chernova N.I., Kersys A.,Kopeyka A.K. The Promise and Challenges of Algae for Transportation Biofuels / Transport Means. Proceedings of 17th International Conference. October 24-25, «TECHNOLOGIJA» KAUNAS, Lithuania, 2013. P. 83-87.
16. Borowitzka M.A. Fats, oils and hydrocarbons // In: Borowitzka M.A , Borowitzka L.J., editors. Microal-gal biotechnology. Cambridge: Cambridge University Press, 1988. P. 257-287.
17. Соловченко А.Е., Чивкунова О.Б., Семенова Л.Р. и др. Влияние стрессов на содержание пигментов и жирных кислот липидов в клетках микроводоросли Desmodesmus sp из беломорского гидроида // Физиология растений. 2013. Т. 60. № 3. С. 1-10.
18. Guschina I.A., Harwood J.L. Algal lipids and Effect of the Environment on Their Biochemistry // Lipids in Aquatic Ecosystems / Eds. Kainz M., Brett M., Arts M. Dordrecht, Heidelberg, London. New York: Springer-Verlag, 2009. P. 1-24.
19. Huntley M., Redalje D. CO2 mitigation and renewable oil from photosynthetic microbes: a new appraisal // Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change. 2007. Vol.12, P.573-608.
20. Чернова Н.И., Коробкова Т.П., Радомский Н.В., Киселева С.В., Зайцев С.И., Гайнанова О.Ю. Использование способа двухстадийного культивирования в поиске перспективных штаммов микроводорослей для производства биотоплива / Труды 8-ой Межд. научно-техн. конф. «Энергообеспечение и энергосбережение в сельском хозяйстве» // ВИЭ. Местные энергоресурсы. Экология. М.: ГНУ ВИЭСХ, 2012. Ч. 4. С.196-203.
21. Коробкова Т.П., Чернова Н.И., Киселева С.В. Артроспира (спирулина) как объект микробиологической промышленности для получения нетрадиционных продуктов природного происхождения // Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты: Сборник научных трудов. Вып.13. М.: РАЕН, 2005. Вып.13, С. 3-26.
22. Алексеев В.В., Лямин М.Я., Чернова Н.И. и др. Энергетические плантации / Географический ф-т МГУ: «География, общество, окружающая среда», Том 3. Природные ресурсы и устойчивое развитие. М.: Изд. Дом «Городец», 2004. С.578-607.
23. Зайцев С.И., Лямин М.Я., Киселева С.В., Чернова Н.И., Соловьев А.А., Михайловская Н.Н. Водорослевая энергетика / Возобновляемая энергетика под ред. В.В. Алексеева, М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1999. С.37-114.
24. Пиневич В.В., Верзилин Н.Н., Михайлов А.А. Изучение Spirulina platensis - нового объекта для высокоинтенсивного культивирования // Физиология растений. 1970. Т.17, Вып. 5. С.1007.
25. Folch J., Lees M., Stanley G.H.S. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. Vol. 226, N.1. P. 497-509.
26. Guan-Hua Huang, Gu Chen, Feng Chen Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence // Biomass and Bioenergy. 2009. 33:1386-1392.
27. N. Jeeji Bai. Competitive exclusion or morphological transformation? А case study with Spirulina fusi-formis, Arch.Hydrobiol., Suppl. 71. Algol. Stud. 1985. 38/39. P.191-199
28. Сиренко Л.А., Шевченко Т.Ф. Альгологиче-ское загрязнение промышленных культур Spirulina Turp. и трудности их идентификации. Альгология. 1996. Т.6, № 1. С. 91-96.
29. Чернова Н.И., Коробкова Т.П. Изучение полиморфизма микроводорослей Spirulina/Arthrospira (Nordst.) Geitl. - объектов промышленного культивирования / Матер. Межд. науч.-практ. конф. «Водоросли и цианобактерии в природных и сельскохозяйственных экосистемах». 11-15.10.2010. Киров: Вятская ГСХА, 2010. С.314-318.
30. Uslu L., I§ik O., Kog K., Goksan T. The effect of nitrogen defiencies on the lipid and protein contents of Spirulina platensis //African Journal of Biotechnology. 2011. Vol.10 (3), P.386-389.
31. Чернова Н.И., Коробкова Т.П., Киселева С.В. и др. База данных «Культуры фототрофных микроорганизмов». Свидетельство о государственной регистрации № 2013620237. Зарегистрировано в Реестре баз данных 04 февраля 2013 г.
32. Чернова Н.И., Киселева С.В., Попель О.С. Эффективность производства биодизеля из микроводорослей // Теплоэнергетика. 2014. № 6. С.14-21.
33. heehan J., Dunahay T., Benemann J. and Roessler P. A Look Back at the U.S. Department of Energy's Aquatic Species Program - Biodiesel From Algae, Golden, CO, National Renewable Energy Institute, NREL/TP-580-24190, 1998. 328 p.
References
1. Tchernova N.Y., Kyseleva S.V., Korobkova T.P., Zajtsev S.Y. Mykrovodorosly v katchestve syhrjja dlja polutchenyja byotoplyva // Aljternatyvnaja ehnerg-hetyka y ehkologhyja. 2008. № 9. S. 68-74.
2. Tchernova N.Y., Korobkova T.P. Resursnyhe y ehkologhytcheskye problemyh ehnerghetytcheskogho yspoljzovanyja byomassyh // Vozobnovljaemyhe ystot-
ISJAEE
Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология» № 12 (152) 2014 © Научно-технический центр «TATA», 2014
81
chnyky ehnerghyy: Lektsyy vedushtchykh spetsyalystov / Pod red. A.A. Solovjheva, S.V. Kyselevoj. M.: Yzd-vo TcheRo, 2008. Vyhp.5. S. 78-91.
3. Tchernova N.Y., Korobkova T.P., Kyseleva S.V., Zajtsev S.Y. Byomassa kak ehnerghetytche-skyj resurs // Trudyh KubGHAU. 2009. № 4(19). S.203-208.
4. Korobkova T.P., Tchernova N.Y. Mykrovodo-rosly - vozobnovljaemyhj ehnerghoresurs: sovremen-nyhe napravlenyja yssledovanyj // Vozobnovljaemyhe ystotchnyky ehnerghyy. Kurs lektsyj: Utchebnoe po-sobye / Pod red. A.A.Solovjheva, S.V.Kyselevoj M.: MYROS, 2010. S.156-170.
5. Chernova N.I., Korobkova T.P. and Kiseleva S.V. Use of Biomass for producing liquid Fuel: Current State and Innovation // Thermal Engineering. 2010. Vol. 57, No. 11. R. 937-945.
6. Okolelova T.M., Bajkovskaja Y.P., Tchernova N.Y. y dr. Tekhnologhyja polutchenyja y prymenenyja byomassyh spyrulynyh v kombykormakh dlja ptytsyh. Metodytcheskye rekomendatsyy. RASKHN-VNYYTYP. Serghyev Posad, 1996. 20 s.
7. Pat. 2034499 Rossyjskaja Federatsyja, MKY3 S1 6 A 23 K 1/16. Sposob pryghotovlenyja premyksa dlja seljskokhozjajstvennoj ptytsyh / Okolelova T.M., Baakovskaja Y.P., Kryvorutchko L.Y., Solovjhev A.A., Ljamyn M.JA., Tchernova N.Y. // Otkryhtyja. Yzobrete-nyja. 1995. № 13.
8. Pat. 2137402 Ross^jskaaa Federatsyja, MKY3 S1 6 A 23 L 1/302, A 61 K 35/80. Pyshtchevaja dobav-ka / Zajtsev S.Y., Kyseleva S.V., Lebedeva E.M., Ljamyn M.JA., Samojlenko Y.Y., Solovjhev A.A., Tchernova N.Y. // Otkryhtyja. Yzobretenyja. 1999. № 26.
9. Pat. 2322489 Rossyjskaja Federatsyja, MPK6 C1 C12N 1/12 C12/R 1/89. Shtamm Arthrospira platensis (Nordst.) Geitl. 1/02-T/03-5 - produtsent belkovoj byomassyh / Korobkova T.P., Tchernova N.Y., Kyseleva S.V., Zajtsev S.Y.// Otkryhtyja. Yzobretenyja. 2008. №11.
10. Tchernova N.Y., Kyseleva S.V., Tchernov N.M. Pyshtchevaja tsennostj spyrulynyh: opyht vyhrashtchyva-nyja y prymenenyja // Vestnyk Rossyjskoj akademyy seljskokhozjajstvennyhkh nauk. 2001. №6. S.60-63.
11. Tchernova N.Y., Ljamyn M.JA., Kyseleva S.V. Yspoljzovanye spyrulynyh v pyshtchevyhkh pro-duktakh // Pyshtchevaja promyhshlennostj. 2002. №2. S.80-82.
12. Senjko O.V., Ghladtchenko M.A., Ljaghyn Y.V., Nykoljskaja A.B., Maslova O.V., Tchernova N.Y., Kyseleva S.V., Korobkova T.P., Efremenko E.N., Varfo-lomeev S.D. Transformatsyja byomassyh fototrofnyhkh mykroorghanyzmov v metan // Ajternatyvnaaa ehnerg-hetyka y ehkologhyja. 2012. №3. S. 89-94.
13. Tchernova N.Y., Korobkova T.P., Kyseleva S.V., Zajtsev S.Y. Byotoplyvo tretjhegho pokolenyja yz mykrovodoroslej: polutchenye proyzvodstvennyhkh shtammov y tekhnologhyy vyhrashtchyvanyja // Ehnerg-hoobespetchenye y ehnerghosberezhenye v seljskom khozjajstve. Trudyh 7-j Mezhd. nautch.-tekhn. konf. (1819 maja 2010gh.). M.: GHNU VYEHSKH, 2010. Tch.4. S. 307-312.
14. Chernova N.I., Korobkova T.P., Kiseleva S.V., Zaytsev S.I., Radomskii N.V. Microalgae as source of energy: current situation and perspectives of use / Sustainable Manufacturing. Seliger.Gunther (Ed.), SpringerVerlag Berlin Heidelberg, KHIII, Chapter 5, 2012. P.221-224.
15. Raslavicius L., Semenov V.G., Chernova N.I., Kersys A., Kopeyka A.K. The Promise and Challenges of Algae for Transportation Biofuels / Transport Means. Proceedings of 17th International Conference. October 24-25, «TECHNOLOGIJA» KAUNAS, Lithuania, 2013. P. 83-87.
16. Borowitzka M.A. Fats, oils and hydrocarbons // In: Borowitzka M.A , Borowitzka L.J., editors. Microal-gal biotechnology. Cambridge: Cambridge University Press, 1988. P. 257-287.
17. Solovtchenko A.E., Tchyvkunova O.B., Semenova L.R. y dr. Vlyjanye stressov na soderzhanye pygh-mentov y zhyrnyhkh kyslot lypydov v kletkakh mykro-vodorosly Desmodesmus sp yz belomorskogho ghy-droyda // Fyzyologhyja rastenyj. 2013. T. 60. № 3. S. 110.
18. Guschina I.A., Harwood J.L. Algal lipids and Effect of the Environment on Their Biochemistry // Li-pids in Aquatic Ecosystems / Eds. Kainz M., Brett M., Arts M. Dordrecht, Heidelberg, London. New York: Springer-Verlag, 2009. P. 1-24.
19. Huntley M., Redalje D. CO2 mitigation and renewable oil from photosynthetic microbes: a new appraisal // Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change. 2007. Vol.12, P.573-608.
20. Tchernova N.Y., Korobkova T.P., Radomskyj N.V., Kyseleva S.V., Zajtsev S.Y., Ghajnanova O.JU. Yspoljzovanye sposoba dvukhstadyjnogho kuljtyvyro-vanyja v poyske perspektyvnyhkh shtammov mykrovodoroslej dlja proyzvodstva byotoplyva / Trudyh 8-oj Mezhd. nautchno-tekhn. konf. «Ehnerghoobespetchenye y ehnerghosberezhenye v seljskom khozjajstve» // VYEH. Mestnyhe ehnerghoresursyh. Ehkologhyja. M.: GHNU VYEHSKH, 2012. Tch. 4. S.196-203.
21. Korobkova T.P., Tchernova N.Y., Kyseleva S.V. Artrospyra (spyrulyna) kak obohekt mykrobyolog-hytcheskoj promyhshlennosty dlja polutchenyja netra-dytsyonnyhkh produktov pryrod-nogho proyskhozhde-nyja // Netradytsyonnyhe pryrodnyhe resursyh, ynnovat-syonnyhe tekhnologhyy y produktyh: Sbornyk nautchnyhkh trudov. Vyhp.13. M.: RAEN, 2005. Vyhp.13, S. 3-26.
22. Alekseev V.V., Ljamyn M.JA., Tchernova N.Y. y dr. Ehnerghetytcheskye plantatsyy / Gheoghra-fytcheskyj f-t MGHU: «Gheoghrafyja, obshtchestvo, okruzhajushtchaja sreda», Tom 3. Pryrodnyhe resursyh y ustojtchyvoe razvytye. M.: Yzd. Dom «Ghorodets», 2004. S.578-607.
23. Zajtsev S.Y., Ljamyn M.JA., Kyseleva S.V., Tchernova N.Y., Solovjhev A.A., Mykhajlovskaja N.N. Vodoroslevaja ehnerghetyka / Vozobnovljaemaja eh-nerghetyka pod red. V.V. Alekseeva, M.: Yzd-vo Mosk. Un-ta, 1999. S.37-114.
International Scientific Journal for Alternative Energy and Ecology № 12 (152) 2014
© Scientific Technical Centre «TATA», 2014
24. Pynevytch V.V., Verzylyn N.N., Mykhajlov A.A. Yzutchenye Spirulina platensis - novogho obohek-ta dlja vyhsokoyntensyvnogho kuljtyvyrovanyja // Fy-zyologhyja rastenyj. 1970. T.17, Vyhp. 5. S.1007.
25. Folch J., Lees M., Stanley G.H.S. A simple method for the isolation and purification of to-tal lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. Vol. 226, N.1. P. 497-509.
26. Guan-Hua Huang, Gu Chen, Feng Chen. Rapid screening method for lipid production in al-ga based on Nile red fluorescence // Biomass and Bioenergy. 2009. 33:1386-1392.
27. N. Jeeji Bai. Competitive exclusion or morphological transformation? A case study with Spirulina fusi-formis, Arch.Hydrobiol., Suppl. 71. Algol. Stud. 1985. 38/39. P.191-199
28. Syrenko L.A., Shevtchenko T.F. Aljghologhyt-cheskoe zaghrjaznenye promyhshlennyhkh kuljtur Spirulina Turp. y trudnosty ykh ydentyfykatsyy. Aljghologhy-ja. 1996. T.6, № 1. S. 91-96.
29. Tchernova N.Y., Korobkova T.P. Yzutchenye polymorfyzma mykrovodoroslej Spiruli-na/Arthrospira
(Nordst.) Geitl. - obohektov promyhshlennogho kuljtyvyrovanyja / Mater. Mezhd. nautch.-prakt. konf. «Vodo-rosly y tsyanobakteryy v pryrodnyhkh y seljskokhoz-jajstvennyhkh ehko-systemakh». 11-15.10.2010. Kyrov: Vjathskaja GHSKHA, 2010. S.314-318.
30. Uslu L., I§ik O., Kog K., Göksan T. The effect of nitrogen defiencies on the lipid and pro-tein contents of Spirulina platensis //African Journal of Biotechnology. 2011. Vol.10 (3), P.386-389.
31. Tchernova N.Y., Korobkova T.P., Kyseleva S.V. y dr. Baza dannyhkh «Kuljturyh foto-trofnyhkh mykroorghanyzmov». Svydeteljstvo o ghosudarstvennoj reghystratsyy № 2013620237. Zareghystryrovano v Reestre baz dannyhkh 04 fevralja 2013gh.
32. Tchernova N.Y., Kyseleva S.V., Popelj O.S. Ehffektyvnostj proyzvodstva byodyzelja yz mykrovodoroslej // Teploehnerghetyka. 2014. № 6. S.14-21.
33. Sheehan J., Dunahay T., Benemann J. and Roessler P. A Look Back at the U.S. Department of Energy's Aquatic Species Program - Biodiesel From Algae, Golden, CO, National Renewable Energy Institute, NREL/TP-580-24190, 1998. 328 p.
Транслитерация по ISO 9:1995
rx-t
— TATA —
ISJAEE
Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология» № 12 (152) 2014 © Научно-технический центр «TATA», 2014
83
