CC BY
267
УДК 66.011
Доцент Д.С. Дворецкий, доцент Е.В. Пешкова, аспирант М.С. Темнов
(Тамбовский гос. техн. ун-т) кафедра технологии и оборудования пищевых и химических производств, тел. (4752) 63-94-42
Экспериментальное определение технологических режимов роста биомассы микроводоросли хлорелла с повышенным содержанием липидов
Обосновано применение микроводоросли Chlorella vulgaris штамм ИФР № С-111 в качестве источника сырьевых компонентов для производства биодизельного топлива третьего поколения. Проведены экспериментальные исследования, на основании которых разработаны технологические основы и модифицированные питательные среды для культивирования биомассы Chlorella vulgaris ИФР № С-111 с повышенным содержанием липидов.
The implementation of Chrorella vulgaris microalgae (strain IFR No. C-111) as a source of raw materials for third-generation biodiesel fuel production is justified. Experimental research has been conducted which allowed to develop techniques and modified broth for the cultivation of Chrorella vulgaris (strain IFR No. C-111) biomass rich in lipids.
Ключевые слова: микроводоросль Chlorella vulgaris, штамм ИФР № С-111, липиды, компоненты смесевого биодизельного топлива, технологические режимы культивирования, модифицированная питательная среда Тамийя, источники азотного питания.
В настоящее время перспективным является применение биомассы в производстве энергоносителей. Основным сырьем для получения биодизельного топлива являются растительные технические липиды, которые извлекают из возобновляемой биомассы (рапса, сои, рыжика, кукурузы) [1]. Использование биомассы микроводорослей в качестве источника сырья представляется наиболее оправданным в производстве биотоплива третьего поколения [1]. Для производства биотоплива используются нейтральные липиды - триацилглицериды. Синтез и накопление большого количества триацилглицеридов в биомассе микроводорослей происходит в условиях стрессового культивирования, осуществляемого подбором специальной питательной среды, температуры, освещения [4].
В исследовании Н.И. Черновой и др. [2] проведен сравнительный анализ урожайности масличных растений и микроводорослей при промышленном производстве технических липидов и показано, что из-за высокой продуктивности микроводорослей замена масличных культур на микроводорослевые позволит сократить площади выращивания в 5СН100 раз, используя земли, не пригодные для растениеводства.
В исследовании Б.К. Заядана и др. [3] выделены альгологически чистые культуры микроводорослей из различных водных экосистем, проведен скрининг по продуктивности выделенных культур и коллекционных штаммов микроводорослей.
С Дворецкий Д. С., Пешкова Е.В., Темнов М.С., 2014
Методом индуцированного мутагенеза (УФ-облучение, 254 нм, 40 эрг/мм2) и селекции получен мутантный штамм Chlorella pyrenoidosa C-2m2, характеризующийся высокой активностью биосинтеза и накопления липидов, и проведена оптимизация условий его культивирования. Установлено, что оптимальными условиями для интенсивного накопления липидов клетками Chlorella pyrenoidosa С-2ш2 является уменьшение концентрации азота в питательной среде в 10 раз (до 0,004 г/л) и освещенность на уровне 4 кАк.
Paul Held [4] изучал штаммы Chlorella vulgaris (2714) и два различных выделенных штамма Microcystis aeruginosa (LB 2238 и LB 2061). Клетки штаммов выращивались на средах BG11, ТАР и ТР. В результате было определено, что при выращивании штаммов на среде BG11 наибольшую продуктивность имеет Chlorella vulgaris 2714 - на 15-й день культивирования 38 миллионов клеток в 1 мл суспензии, Microcystis aeruginosa LB2238 и LB2061 - 8 миллионов клеток в 1 мл суспензии и 30 миллионов клеток в 1 мл суспензии. При выращивании штамма Chlorella vulgaris (2714) на средах BG11, ТАР и ТР наибольший прирост биомассы составил на среде ТАР.
В исследовании Eline Ryckebosch и др. [6] использовались штамм Phaeodactylumtri cornutum Ptl 8.6, который выращивали на питательной среде WC с добавлением 30 г/л искусственной морской соли. Также изучались штамы Nannochloropsis salina SAG 40.85, Chlorella vulgaris SAG 211-llb и Arthrospira platensis SAG 85.79. Nannochloropsis salina и Chlorella vulgaris культивировали при температуре 21,9 ± 0,5 °C и при использовании среды WC. Для морской микроводоросли Nannochloropsis salina добавлялось 30 г/л искусственной морской соли. Arthrospira platensis культивировали при температуре 21,9 ± 0,5 °С, для культивирования использовалась среда Spirulina (SAG, Германия). Клеточные стенки всех штаммов подвергались разрушению (обработкой в шариковой мельнице или ультразвуком), при этом максимальное количество липидов было экстрагировано из биомассы Nannochloropsis salina (35,1 ± 0,8 %), далее шли остальные штаммы: Phaeodactylumtri cornutum (28,7 ± 0,4), Chlorella vulgaris (21,7 ± 2,0), Arthrospira platensis (11,6 ± 0,8).
В исследовании Pandian Prabakaran et al. [7], были выбраны микроводоросли Chorella sp., Scenedesmus sp. и Neochloris sp. Микроводоросли инкубировали, используя среду BGH [7] при воздухообмене 0,3 об/м3 и освещенности на уровне
2.5 кАк. Сухой вес биомассы всех трех штаммов составил 0,5 г/л, наибольшая продуктивность была у штамма Chorella sp. и составила 52,7 мг/л-сут. Максимальная производительность липидов была у штамма Scenedesmus sp. и составила 9,5 мг/(л-сут). По результатам данного исследования, учитывая величины производительности биомассы и липидов, можно рекомендовать использовать штаммы Chorella sp. и Scenedesmus sp.
В исследовании Jae-Yon Lee et al. [8] были использованы микроводоросли Bot-ryococcus sp., Chlorella vulgaris и Scenedesmus sp. на среде BG11 при воздухообмене
0,3 об/м3. Дни инкубации штаммов Chlorella vulgaris, Scenedesmus sp. составили 7 дней, для штамма Botryococcus sp. в два раза больше - 14. Сухой вес биомассы всех трех штаммов составил 0,5 г/л, наибольшая продуктивность была у штамма Chorella vulgaris и составила 74,2 мг/л-сут. Максимальная производительность липидов была у штамма Botryococcus sp. и составила
11.5 мг/(л-сут), а у Chlorella vulgaris - 11,1 мг/(л-сут). Однако, учитывая тот факт, что дни инкубации штамма Chlorella vulgaris по сравнению со штаммом Botryococcus sp. в два раза меньше, а содержание липидов в них практически одинаковое, микроводоросли Chlorella vulgaris можно рекомендовать использовать в качестве сырья для производства биотоплива.
Таким образом, для производства биомассы в промышленном масштабе из всего многообразия микроводорослей пригодны штаммы рода Chlorella,
что обусловлено высокой скоростью роста, высоким содержанием триацилглицери-дов по отношению к сухой массе и устойчивостью к чужеродным биологическим агентам (грибы, бактерии, другие виды микроводорослей).
В качестве объекта исследования в данной работе использовался штамм микроводоросли Chlorella vulgaris ИФР № С-111 как наиболее приспособленный для культивирования в условиях средней полосы России [9].
Экспериментальная установка (рис. 1) представляет собой реактор цилиндрической формы объемом 0,002 м3 из прозрачного материала, снабжённый барботером, с помощью которого осуществлялось обогащение суспензии газо-воздушной смесью. Освещенность реактора была на уровне 10,6 кАк, что соответствует пределу насыщения по Винбергу.
Рис. 1. Лабораторный фотобиореактор для культивирования фотоавтотрофных микроорганизмов: 1 - реактор в форме цилиндра (h=400 мм, D=8 мм); 2 - барботажное устройство; 3 - панель с энергосберегающими лампами (освещенность слоя суспензии порядка 10 клк); 4 - компрессор; 5 - емкость для подачи питательной среды
Цель исследования - определение технологических режимов роста биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris штамма ИФР № С-111, обеспечивающих накопление нейтральных липидов для последующего их использования в качестве сырья для смесевого биодизельного топлива, а именно: выбор питательной среды, обеспечивающей наибольшую продуктивность микроводоросли, подбор компонентов питательной среды - источников азотсодержащих соединений и интервала оптимальных температур для роста биомассы микроводорослей хлорелла, а также условий стресса, стимулирующих накопление липидов в клетках рассматриваемого штамма.
Для проведения первого эксперимента штамм Chlorella vulgaris ИФР № С-111 культивировался на питательных средах Тамийя [1] и ТАР [2] при температуре 29 °С, уровне pH 6,2-8,0, при круглосуточном освещении энергосберегающими лампами с освещенностью на уровне 10,6 кАк, аэрация осуществлялась воздушной смесью с содержанием углекислого газа 0,04 %. Посевной материал составлял 20 % от общего объема суспензии (с концентрацией: Т106 кл/мл). Динамика прироста
штамма Chlorella vulgaris ИФР № С-111 на средах Тамийя и ТАР представлена на рис. 2.
среда Тамийя -»--среда ТАР
t, сут
Рис. 2. Накопление биомассы штамма Chlorella vulgaris ИФР NqC-111 на средах Тамийя и ТАР
Рис. 3. Динамика прироста биомассы на модернизированных средах Тамийя с разными источниками азота
I, сутки
Экспоненциальная фаза роста составила 8 сут и максимальный прирост биомассы - 55-106 кл/мл для среды Тамийя (8-е сут), максимальный прирост биомассы на среде ТАР был 15-106 кл/мл.
Согласно литературе различные соединения - источники азота обладают разной доступностью для клеток микроводоросли хлорелла, поэтому во втором эксперименте производилась оптимизация питательной среды по применению азотсодержащих соединений. Для этого применялись модифицированные питательные среды Тамийя, в которых в качестве источника азота использовались: нитрат калия в первом эксперименте, хлорид аммония - во втором и мочевина -в третьем (рис. 3). Условия культивирования: температура 29 °С, круглосуточная освещённость лампами на уровне 10,6 кЛк, концентрация посевного материала -2-106 кл/мл.
Результаты эксперимента показывают, что в качестве источника азотсодержащих соединений для накопления биомассы штамма Chlorella vulgaris ИФР № С-111 оптимально подходит нитрат калия, обеспечивающий двукратный прирост биомассы на 7-й день культивирования по сравнению со средой с мочевиной и более чем пятидесятикратный - при использовании питательной среды с хлоридом аммония. Объяснить низкий прирост на среде с источником азота - хлорид аммония можно тем, что хлорид аммония NH4CI - соль слабого основания гидрата аммиака NH.rHvO и сильной соляной кислоты НС1, в воде гидролизуется и дает кислую реакцию:
NH4CI + НОН <-► NH4OH + НС1 NH4+ + НОН <-► nh4oh + Н+, поэтому уровень pH в процессе культивирования на этой среде падал с 7,05 до 3,5.
Замедление прироста биомассы на среде с использованием мочевины можно объяснить тем, что Chlorella vulgaris содержит мочевинную амидазу, которая катализирует расщепление мочевины [2]:
C(NH2)2+AT®+H20=C02+2NH3+Aa®+Pi.
Установлено, что при культивировании штамма и использовании в качестве источника азота - мочевины, на 4-5-й день культивирования аммонийная форма азота может достигать в среде 40-60 % от общего содержания азота, что подкисляет среду и вызывает угнетение роста клеток.
Для определения интервала температуры культивирования, обеспечивающего высокую продуктивность по биомассе, штамм Chlorella vulgaris ИФР № С-111 культивировался на среде Тамийя, уровне pH 6,2-8,0, при круглосуточном освещении энергосберегающими лампами с освещенностью на уровне 10,6 кАк, аэрация осуществлялась воздушной смесью с содержанием углекислого газа 0,04 %, при температурах культивированиях 27,5, 29,5 и 35 °С. Посевной материал составлял 20 % от общего объема суспензии (с концентрацией 2-106 кл/мл). Динамика прироста биомассы клеток микроводорослей представлена на рис. 4.
- J5*
Рис. 4. Динамика прироста биожассы штажма Chlorella
vulgaris ИФР Nq С-111
в зависимости от температуры
Рис. 5. Накопление биожассы штажма Chlorella vulgaris ИФР Nq С-111 на стандартной и обедненной азотож средах Та-жийя
Анализ графиков показывает, что максимальный прирост биомассы штамма был при температуре суспензии 29,5 °С, и составил 53-10б кл/мл на 8-й день культивирования. Повышение температуры приводит к значительному снижению роста клеток. Такое поведение объясняется повышением растворимости и концентрации углекислого газа в культуральной жидкости, приводящим к ингибированию роста клеток микроводоросли.
Дефицит доступных азотсодержащих соединений в питательной среде создает стресс для клеток микроводорослей, которые стимулируют накопление липидов в клетках биомассы. При этом наблюдается снижение интенсивности биосинтеза белка, образование клеток, которые теряют способность к делению, но увеличиваются в диаметре и образуют глобулы, содержащие нейтральные липиды. Данные изменения в клетках наблюдаются при концентрации азота в питательной среде менее 80 мг/л. В зависимости от физиологических свойств штамма при азотном голодании накапливается до 50-80 % липидов от сухой массы клетки.
Для определения режимов, соответствующих стрессовым условиям, обеспечивающим максимальное накопление липидов внутри клетки, штамм Chlorella vulgaris ИФР № С-111 выращивался на стандартной и обедненной азотом средах Тамийя. Содержание азота в стандартной среде Тамийя было 231 мг/л, а на обедненной азотом среде Тамийя содержание азота было 50 мг/л. Посевной материал составлял 20 % от общего объема суспензии с концентрацией
1 • 10б кл/мл; температура культивирования - 29 °С, при круглосуточном освещении энергосберегающими лампами с освещенностью на уровне 10,6 кАк, аэрация осуществлялась воздушной смесью с содержанием углекислого газа 0,04 %.
Динамика прироста биомассы штамма Chlorella vulgaris ИФР № С-111 на стандартной и обедненной азотом среде Тамийя представлена на рис. 5.
Снижение роста клеток почти в 5,5 раз на среде, обедненной азотом, объясняется тем, что клетки Chlorella vulgaris не способны полностью поглощать азот из питательной среды. Таким образом, азот становится практически не доступен для клеток при остаточной концентрации 10 мг/л. Данный эксперимент позволил выявить нецелесообразность накопления биомассы Chlorella vulgaris ИФР № С-111 с применением среды с пониженным содержанием азота, поскольку такой режим способствует раннему наступлению стационарной фазы при концентрации клеток 9-10б кл./мл, однако такой режим можно рекомендовать на второй стадии культивирования для накопления липидов.
По результатам работы можно сделать следующие выводы:
- микроводоросль хлорелла является перспективным продуцентом при производстве компонентов смесевого биодизельного топлива - нейтральных липидов. На основании обзора информационных источников был обоснован выбор штамма микроводоросли Chlorella vulgaris ИФР № С-111 ;
- экспериментальные исследования позволили установить, что для накопительного культивирования биомассы Chlorella vulgaris ИФР № С-111 с повышенным содержанием липидов наилучшая продуктивность микроводоросли хлорелла достигается при использовании модифицированной среды Тамийя, содержащей в своем составе нитрат калия в качестве источников азота;
- наилучшая скорость роста биомассы наблюдается при температуре 29,5 °С;
- по достижении биомассой микроводоросли хлорелла стационарной стадии роста, следует создавать клеткам стрессовые условия путём снижения содержания доступных азотсодержащих соединений в питательной среде для стимулирования накопления внутриклеточных липидов. Установление оптимальных режимов накопления внутриклеточных липидов и режимов их выделения является предметом дальнейшего исследования.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в базовой части задания.
ЛИТЕРАТУРА
1. Дворецкий, Д.С. Технология получения биодизельного топлива с использованием гетерофазных катализаторов и СВЧ-нагрева [Текст] / Д.С. Дворецкий, С.А. Нагорнов, A.A. Ермаков, С.В. Неизвестная // Вопросы современной науки и практики. Университет имени В.И. Вернадского. - 2012. - Специальный выпуск (39). -С. 136-143.
2. Чернова, Н.И. Микроводоросли в качестве сырья для получения биотоплива [Текст] / Н.И. Чернова, С.В. Киселева, Т.П. Коробкова, С.И.Зайцев / / Альтернативная энергетика и экология. - 2008. - № 9. - С. 68-74.
3. Заядан, Б.К. Выделение, мутагенез и оптимизация условий культивирования штамовмикроводорослей для производства биодизеля [Текст] / Б.К. Заядан, С. Пуртон, А.К. Садвакасова, A.A. Усербаева, К. Болатхан // Физиология растений. - 2014. - № 1. - С. 135.
4. Held, Paul. Determination of Algal Cell Lipids Using Nile Red - Using Microplates to Monitor Neutral Lipids in Chlorella Vulgaris / Paul Held, Keri Raymond. -(http: / /www.biotek.com/resources/articles/nile-red-dve-algal.html).
5. Gouveia, Luisa / Microalgae as a Feedstock for Biofuels. Book / Luisa Gouveia. - Springer, 2011.
6. Ryckebosch, Е. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae / / Journal of the American Oil Chemists' Society. 2012. vol 89. P. 189198.
7. Pandian, P. A study on effective lipid extraction methods from certain fresh water microalgae // Elixir Bio Technology. 2011. vol 39. P. 4589-4591.
8. Jae-Yon Lee Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae // Bioresource Technology. 2010. Vol 101. P. 575-577.
9. Богданов, Н.И. Суспензия хлореллы в рационе сельскохозяйственных животных [Текст] / Н.И. Богданов. - Волгоград : «Здоровье и экология», 2007. - 48 с.
REFERENCE
1. Dvoretsky, D.S. Technology of Producing Biodiesel Using Heterophase Catalysts and Microwave Heating[Text]/ D.S. Dvoretsky, S.A. Nagornov, A.A. Ermakov, S.V. Neis-vestnaya // Questions of modern science and practice. Vernadsky University 2012. -vol 39. - P. 136-143.
2. Chernova, N.I. Microalgae as Source for Biofuels [Text] / N.I Chernova, S.V. Kiseleva, T.P. Korobkova, S.I. Zaitsev // Alternative Energy and Economy. 2008. vol 9. P. 68-74.
3. Zayadan, B.K. Isolation, mutagenesis and optimization of strain cultivation of microalgae for biodiesel production [Text] / / Vegetable physiology. 2014. vol 1. P. 135.
4. Held, Paul. Determination of Algal Cell Lipids Using Nile Red - Using Microplates to Monitor Neutral Lipids in Chlorella Vulgaris/ Paul Held, Keri Raymond. -(http: / /www.biotek.com/resources/articles/nile-red-dye-algal.html).
5. Gouveia, Luisa/ Microalgae as a Feedstock for Biofuels. Book / Luisa Gouveia. -Springer, 2011.
6. Ryckebosch, E. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae // Journal of the American Oil Chemists' Society. 2012. vol 89. P. 189-198.
7. Pandian, P.A. study on effective lipid extraction methods from certain fresh water microalgae // Elixir Bio Technology. 2011. vol 39. P. 4589-4591.
8. Lee, Jae-Yon et al. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae // Bioresource Technology. 2010. Vol 101. P. 575-577.
9. Bogdanov, N.I. Suspension of Chlorella in the diet of farm animals [Text] / N.I.Bogdanov. - Volgograd: « Health and ecology», 2007. - P.48.
