CC BY
8
ЗА РУБЕЖОМ
УДК 616.153.963.-13-02:[613.27:546.175:613.24]-053.3(437)
ПРОБЛЕМА НИТРАТНОЙ ПИЩЕВОЙ МЕТГЕМОГЛОБИНЕМИИ У ГРУДНЫХ ДЕТЕЙ В ЧЕХОСЛОВАКИИ
Павел Шмидт и Зденек Кнотек Кафедра гигиены Института усовершенствования врачей, Прага
Известно, что нитратную пищевую метгемоглобинемию 1 у грудного ребенка описал впервые Сош1у (1945). С тех пор появились описания 1060 случаев этой болезни, в том числе 83 случая с летальным исходом. Профилактика этой болезни осуществляется в большинстве стран, где появляется детская метгемоглобинемия. В первую очередь сюда относится выработка стандартов допустимого количества нитратов в питьевой воде.
Приступая к изучению этой проблемы, мы ставили перед собой цель выяснить следующее: каковы масштабы заболеваемости и каковы области ее распространения;
Таблица 1 Результаты эпидемиологического исследования
что вызывает восстановление нитратов в нитриты в пищеварительном аппарате грудного ребенка? Почему заболевание
встречается только у некоторых детей, пьющих воду, содержащую нитраты? Какие эффективные профилактические меры следует принять для предупреждения заболевания?
Мы исследовали состояние грудных детей от рождения до 4 месяцев
жизни в 40 населенных пунктах, где встречаются нитраты в питьевой воде. У детей, страдающих метгемоглобинемией, мы изучали их возраст, время перевода на искусственное питание, способ искусственного вскармливания, количество нитратов в потребляемой ими воде, инкубационный период, клинические признаки и лабораторные данные. Всего обследовано 115 больных детей. Основные результаты обследования приведены в табл. 1.
В обследованных деревнях болело метгемоглобинемией 2% детей до 3 месяцев жизни, причем 60%из них были госпитализированы. У 40% младенцев заболевание протекало в легкой форме, с клинически замет-
Исследуемые данные Колебании ¡1
неличин
Возраст грудного ребенка
(в днях)......• . . 4—118 40,9
Инкубационный период
(в днях) ........ 1—73 18,7
Содержание нитратов в
воде (в мг/л)...... 41—776 257
Дневная доза (в мг/кг) 10,6—129 43,1
1 В СССР этот вид метгемоглобннемии называется водно-нитратной метгемоглобинемией, так как независимо от предрасполагающих условий (характер питательной смеси, состояние организма ребенка и др.) для возникновения метгемоглобннемии обязательным является наличие в воде повышенных концентраций нитратов. Именно решающую роль водного фактора отметил и Согп!у. — Р е д.
6*
83
ной сероватой окраской кожи и с содержанием 5—10% метгемоглобина в крови. У 8°/0 детей отмечен летальный исход. Все заболевшие получали сушеные молочные продукты Sunar, Eviko и Relakton, производимые в Чехословакии. Ни разу мы не наблюдали заболевания у детей, вскармливаемых сушеной пахтой Lakton. Количество потребляемых нитратов (в миллиграммах на 1 кг веса) не влияло на возникновение болезни и инкубационный период. Определенную роль играл возраст ребенка, очевидно, потому, что развитие заболевания зависит от внутренних факторов.
В лабораторных условиях мы исследовали 4 сорта сушеного молока чехословацкого производства: Sunar, Eviko, Relakton й Lakton. Пробы молока растворяли в стерильной воде, содержащей N03 в количестве
200 мг. Молоко культивировали в термостате при 37° в течение 15 и 22 часов. После инкубации в пробах определяли содержание нитритов колориметрическим путем. В качестве контроля применяли автоклавированные пробы молока; в этих пробах нитриты отсутствовали (табл. 2).
Следовательно, нитриты могут образоваться под прямым воздействием микроорганизмов, которые находятся в препаратах Sunar, Eviko и Relakton. Молоко Lakton не способствовало появлению нитритов. Ясно, что образование нитритов из нитратов, являющееся главным фактором заболевания метгемоглобинемией, зависит от типа молока, использованного для питания детей. В некоторых сортах молока содержатся микроорганизмы, способствующие преобразованию нитратов в нитриты, это спороносные микробы типа В. subtilis. Сушеная пахта" Lakton содержит микробы молочнокислого брожения Str. Lactis, которые выделяют антибиотики, подавляющие размножение спороносных микробов, способных вызвать восстановление нитратов в нитриты. Но если в молоко Lakton, подготовленное таким же способом, как и в предыдущих опытах, мы добавляли суточную культуру Е. coli, разбавленную обычным способом, то это молоко в значительной мере ингибировало восстановление.
Было проведено количественное исследование процесса восстановления нитратов в нитриты под воздействием спорообразующих микроорганизмов. Результаты приведены на рис. 1.
Микроорганизмы начинают восстанавливать нитраты в нитриты в условиях, когда количество микроорганизмов достигает величины порядка 106 в 1 мл молока и они обладают свойством производить эндо-фермент нитратредуктазу.
Таблица 2
Присутствие нитритов в автоклавированных пробах молока после добавки спорообразующих микроорганизмов из него
Сорт молока
Время прове-
дения анализа Sunar Eviko Relakton Lakton
Через 15 0
часов . . + + ±
Через 22 0
часа . . + -f- 1 +
часы
Рис. 1. Восстановление нитратов в нитриты в молоке в зависимости от времени.
1 — Бипаг; 2 — Еу!ко; 3 — Ке1аМоп.
В дальнейших наших опытах мы стремились выяснить, почему процесс восстановления не возникает в сушеной пахте Lakton. Оказалось, что метод ее производства отличается от способов получения остальных видов сушеного молока (молоко ображивается особой стрептококковой культурой), иной и состав микрофлоры пахты Lakton. Эти микроорганизмы вырабатывают в процессе своего метаболизма антибиотики низины, которые обладают термоустойчивостью и хорошей растворимостью при кислой реакции. Воздействие низина мы определяли следующим образом. В 10 мл молока Sunar, разбавленного водой, содержащей NOj" в количестве 600 мг/л, добавляли 1 г низина (Nisoplin — Research,
i, to
C\j _
7
s § j öl 0
SS
III ill
5 и па г 2амГоп Сорт молоко
Рис. 2. Средний уровень метгемоглобина у крысят-сосунков.
3 6 9 >2 и /в 2! 24 27 30 33 36 39 Время от начала опыта (б часах)
Рис. 3. Сравнение содержания метгемоглобина в крови у группы сосущих телят, кормленных молоком Бипаг и ЬаМоп. /— Бипаг; 2—ЬаШоп.
Таблица 3
Влияние добавки низина на появление нитратов в молоке Sunar
Dir. Alin and Barret, 1 г=1 млн. единиц), разбавленного физиологическим раствором. Через 15 часов инкубации при 37° присутствие нитритов устанавливали с помощью сульфаниловой кислоты и а-нафтиламина.
Действенность препарата проявилась при дозировке от 200 до ЮООед. на 10 мл молока. Весьма возможно, что действие препарата было бы более эффективным в условиях предельной растворимости при наличии кислотного показателя pH. В нашем опыте мы этого не делали, поскольку кислотный показатель pH обусловливает также рост микроорганизмов.
Низин препятствует восстановлению нитратов в нитриты, как это показано в опыте с молоком Sunar (табл. 3).
В дальнейшем были поставлены опыты на животных.
Группы сосущих крысиных детенышей (всего 150 животных) в возрасте 10 дней мы кормили молоком Sunar и Lakton. Крысы получали 3 дозы молока, приготовленного непосредственно перед опытом; каждая доза содержала 12 мг NO-T. Через час после приема последней дозы у животных определяли содержание метгемоглобина по Cruz. Разница между величинами, отмеченными после вскармливания молоком Sunar и Lakton, была высокодостоверной при применении теста при 1 % уровня достоверности (рис. 2).
После вскрытия крыс определяли содержание нитритов у них в желудке, двенадцатиперстной кишке и кишках. У крыс, которые питались молоком Sunar с нитратами, в содержимом желудка было найдено в среднем 30 мкг нитратов, в содержимом двенадцатиперстной кишки — 3 мкг; в кишках нитраты не обнаружены. У крыс, которые питались
Число единиц добавленного низина Номер опыта
1 2 3
200 000 _ _
20 000 — — —
2 000 — — —
1 000 — — —
200 + — —
100 + — +
30 + + +
молоком Lakton с нитратами, в содержимом желудка было обнаружено 2 мкг нитритов, в двенадцатиперстной кишке — 0,5 мкг; в кишках нитриты отсутствовали.
Дальнейшие опыты были поставлены на 12 сосущих телятах. Их кормили молоком Simar и Lakton, в котором содержался NaN03 в дозе 1 г/кг: 4 теленка получали Sunar, а 4 — Lakton; 4 теленка служили контрольной группой; через каждые 3 часа определяли содержание метге-моглобина в крови животных (рис. 3). Из рис. 3 видно, что метгемогло-бинемия возникала только у тех животных, которые получали нитраты в растворе молочного препарата Sunar.
Следующим этапом нашего исследования были наблюдения над грудными детьми в клинике. Девочку в возрасте 35 дней с тяжелыми аномалиями центральной нервной системы 6 раз в сутки кормили искусственной пищей, приготовленной из молока Sunar. В первый день в 7 часов 45 мин. она получала 500 мг NaN03 в чае; на следующий день в 6 часов ей давали вторую дозу 500 мг NaN03. Как выяснилось, в первый день максимальное содержание метгемоглобина в крови составляло 3,83%, а на второй день — 5,03%. У ребенка развился цианоз. Других клинических признаков не обнаружено, так как мы не допустили развития болезни.
Затем грудного ребенка в течение одной недели вскармливали сушеной пахтой Lakton. После этого он получал NaN03 в дозах 500 мг ежедневно в течение 3 дней. Ребенок оказался без клинических признаков заболевания, уровень метгемоглобина был в физиологических пределах. Так же протекал и опыт, поставленный на другом грудном ребенке— мальчике, страдавшем аномалиями центральной нервной системы. Ему давали 6 раз в сутки Lakton и в течение 4 дней он получал ежедневно 500 мг NaN03, растворенного в чае. У этого младенца не наблюдалось никаких клинических симптомов болезни; уровень метгемоглобина остался в физиологических пределах.
Нам довелось также наблюдать за клиническим течением метгемо-глобинемии в одном из учреждений для грудных детей вблизи Праги. В этом учреждении искусственное питание приготовляли на воде, содержащей NÓ3 в концентрации 40 мг/л. Для, искусственного питания применяли препарат Eviko, содержащий культуру В. subtilis. У одного ребенка выявлялись типические клинические признаки нитратной пищевой метгемоглобинемии. Ввиду того что этот ребенок страдал поносом, его начали кормить молоком Lakton; для разбавления вместо воды из мест ного источника использовали привозную газированную воду. После этого младенец быстро выздоровел, прибавил в весе; клинические признаки заболевания у него исчезли. Оказалось, что в газированной воде, которая в рассматриваемом случае заменила местную воду, содержание нитратов достигало 140 мг/л. Очень важно отметить и тот факт, что профилактическое действие молока Lakton оправдало себя, когда оно было введено ребенку в стадии полного развития заболевания.
В дальнейшем мы обратили внимание на глютатион (GSH). Этот полипептид, как известно, обладает ярко выраженной способностью влиять на потенциал окислительно-восстановительной системы, куда он включен. Добавление GSH к реагирующей системе в сущности не оказывает действия на энзиматический состав эритроцитов, ввиду того что наружная оболочка эритроцитов для глютатиона непроницаема.
При оценке окислительно-восстановительных способностей полипептида обнаружено, что он способен связываться с нитратами в форме, азотированного органического соединения. Мы проанализировали свойства содинения, которое образуется в результате реакции GSH с NO2. Группе из 6 молодых крыс вводили - мл раствора с содержанием 20 мг NO2 и 20 мг GSH внутрибрюшинно. В том и другом случае определяли метге-моглобин. Величины его различались у обеих групп животных на 5%.
Затем провели опыт на сосущих крысиных детенышах. Одной группе животных ввели 10 мг Ы02 перорально, другая группа крыс получила 10 мг N02 перорально в 0,5 мг того же раствора и 20 мг ОБН в 0,5 мг раствора внутрибрюшинно. Через 10, 20 и 35 мин. после введения раствора в каждой группе было забито 4 животных и определен метгемо-глобин. Процесс образования метгемоглобина показан на рис. 4. Нитриты, связанные с глютанионом, оказывают менее выраженное воздействие на развитие метгемоглобннемии у живот- ^ ных. 1
Прямое химическое взаимодейст- ^ вие может иметь серьезное значение § для веществ, содержащих БН-группу, | активное вмешательство которых в ди- | намику развития метгемоглобннемии ^ сейчас очень важно.
В 1961 и 1962 гг. мы клинически обследовали 549 детей в тех областях, где для приготовления искусственной детской пищи использовали воду, содержащую нитраты. У 328 детей брали кровь и определяли уровень метгемоглобина. Одновременно были исследованы все используемые источники воды на содержание нитратов. Результаты сопоставляли с данными об источниках воды, примененной для приготовления искусственной пищи. Величины сравнивали с физиологическим средним числом, полученным
ю э в 7 6
S «
J 2 / О
S /О IS 20 20 30 JJ Минуты
Рис. 4. Результаты опыта с применением глютатиона.
I — no2; 2 — no2+gsh.
искусственное питание
В SufaMn
Пищебарительный тракт
Почки
Рис. 5. Схема патогенеза алиментарной метгемоглобикемин.
в контрольной группе, где величины метгемоглобина достигали 0,86± 0,3%- Метгемоглобин определяли методом Cruz.
Во всех обследованных районах более 50% детей имело повышенный уровень метгемоглобина. Большинство этих детей было в возрасте около 3 месяцев, а 13% составляли возрастную группу от 3 месяцев до
Энзимная система
первого года. У детей старше 1 года не обнаружена метгемоглобинемия, вызванная потреблением воды, содержащей NO3.
Анализ полученных данных с точки зрения типа питания отдельных групп грудных детей показал, что ни в одном случае при уровне метге-моглобина, превышающем средние величины в контрольной группе, не был применен препарат Lakton. Дети получали молоко, способное восстанавливать нитраты в нитриты (Sunar, Eliko и Relakton). Отсюда вы-^ текает, что и небольшое количество нитратов может вызвать повышение" уровня метгемоглобина. Этот факт послужил основанием для рабочей гипотезы, которую мы проверяем в настоящее время.
На основе результатов наших опытов можно рассматривать механизм патогенеза нитратной пищевой метгемоглобинемии в том виде, в каком он представлен на рис. 5.
Нитраты, которые грудной ребенок, находящийся на искусственном вскармливании, получает с питьевой водой, восстанавливаются, в нитриты посредством практически чистой культуры спороносных микроорганизмов типа В. subtilis, находящихся в молочных препаратах Sunar, Eviko и Relakton. Этот механизм ускоряется в процессе редукции нитратов, способностью самих микроорганизмов восстанавливать нитраты в нитриты, затем постоянным действием окислительно-восстановитель-ной системы, потенциал которой способен до определенной степени редуцировать метгемоглобин обратно в гемоглобин и, наконец, способностью почек выделять резорбированные нитритовые ионы. Гармоническое действие всех названных факторов меняется индивидуально и определяет развитие заболевания. Восстановление нитратов в нитриты могло бы наступить при известных обстоятельствах под влиянием кишечной микрофлоры (Е. coli).
Оценка отдельных результатов, объясняющих патогенез заболевания, позволяет предположить, что существует возможность выработать эффективный способ профилактики метгемоглобинемии. Лабораторные опыты и наблюдения подсказывают, что одним из главных условий этого является подготовка искусственной пищи для грудного ребенка из молочных препаратов, в которых будут полностью отсутствовать микроорганизмы, способные восстанавливать нитраты в нитриты. Этим свойством обладает препарат Lakton, как мы убедились в этом на основе проведенных нами опытов; он способен также предотвратить редукцию, вызванную В. subtilis, и ингибировать восстановление, обусловленное Е. coli. Если в искусственное питание грудного ребенка будет включено молоко тех же бактериологических свойств, как и препарат Lakton, но более питательное, то это сможет быть прекрасным профилактическим средством.
Изучая острые формы заболевания, необходимо вместе с тем учитывать, что в областях с содержанием нитратов в питьевой воде, употребляемой для приготовления искусственной пищи, встречается значительное число грудных детей с повышенным уровнем метгемоглобина. Точно определить реальную опасность этого пока еще невозможно, однако мы полагаем, что угроза исходит с двух направлений. Во-первых, это относится к воздействию нитритов, оказывающих влияние преимущественно на кровообращение (понижение давления), затем на гладкую мускулатуру (релаксация) и, наконец, на сердце (ускорение или замедление сердечного ритма). Во-вторых, речь идет о влиянии нагрузки на окислительно-восстановительную систему. Некоторые авторы получили первый экспериментальный материал в этой области. Так, Jacobsen обнаружил, что после хронической нагрузки нитратами у кроликов повышается выделение желчных пигментов и уробилина, установил гипертрофию костного мозга, гемосидероз и слабо выраженную дегенерацию ткани печени и селезенки. У животных Тагг и Carter при хроническом
влиянии сублетальных доз NaNC>2 обнаружили гипертрофию селезенки и щитовидной железы.
В отличие от Kananadse и Sudotin мы не отметили повышения уровня метгемоглобина у детей старше 1 года. Более высокие уровни мет-гемоглобина, которые эти авторы нашли у детей после питья воды с содержанием нитратов, мы объясняем прежде всего неточностью методики, которой пользовались эти авторы.
Mucha, Kamenskij и Keleti не разделяют нашего взгляда на патогенез нитратной алиментарной метгемоглобинемии у грудных детей, поскольку они не верят в восстановительное действие спорообразующих микроорганизмов В. subtilis из сушеных молочных продуктов. Эти авторы, подобно нам, исследовали случаи непроявившейся метгемоглобинемии у детей в тех районах, где вода содержит нитраты. У некоторых детей они обнаружили метгемоглобин в таком количестве, которое указывало на то, что эти дети были поражены клиническим заболеванием. Это свидетельствует о недостаточной чувствительности метода, который применяли авторы для определения содержания метгемоглобина. То обстоятельство, что в молочных продуктах типа Sunar оказалось больше микроорганизмов, может служить подтверждением нашей теории, а обнаружение определенного небольшого количества спорообразующих микроорганизмов в молоке Lakton нисколько не опровергает нашу теорию, поскольку авторы определяли только присутствие микроорганизмов в молоке, но не способность восстанавливать нитраты в нитриты в отдельных видах молочных продуктов.
Трудно было бы отрицать, что восстановление нитратов в нитриты может быть вызвано действием обычной кишечной микрофлоры (т. е. Е. coli); это вытекает и из нашей схемы патогенеза заболевания. Вместе с тем, по нашему мнению, в большинстве случаев процесс восстановления возникает под действием фермента нитратредуктазы, вырабатываемого спорообразующими микроорганизмами В. subtilis из некоторых молочных продуктов.
Мы придаем большое значение окислительно-восстановительной системе в патогенезе нитратной пищевой метгемоглобинемии у грудных детей. В наших опытах решен вопрос об укреплении окислительно-вос-становительной системы путем введения веществ с SH-группами (глю-татион). Оказалось, что глютатион реагирует прямо с нитратами и что возникшее соединение обладает меньшей способностью окислять гемоглобин, чем нитриты, введенные без глютатиона. Под влиянием глюта-тиона образование метгемоглобина может осуществляться без помощи окислительно-восстановительной системы, путем прямого взаимодействия между глютатионом rf нитритами.
Выводы
1. Нитратная пищевая метгемоглобинемия вызвана восстановлени-. ем нитратов в нитриты, которые превращают гемоглобин в непригодный для переноса кислорода кровью метгемоглобин. Восстановление обусловливает и спорообразующие микроорганизмы типа В. subtilis, которые находятся в продуктах сушеного молока Sunar, Eviko и Reíakton.
2. В опытах in vitro и in vivo не удалось "вызвать заболевания, если нитраты содержались в растворе молочного препарата Lakton. Это обусловлено тем, что микроорганизмы молочного брожения, присутствующие в молоке Lakton, ингибируют продуктом своего метаболизма низином с антибиотическим действием рост восстанавливающих бактерий. Эти результаты были проверены и статистически оценены.
3. Опытные данные проверены наблюдениями в областях с наличием нитратов в питьевой воде. Клинически обследовано 549 детей. Более чем у половины детей, у которых исследовали содержание метгемоглобина
в крови, отмечен высший уровень этого вещества, статистически отличающийся от средних величин в контрольной группе. Повышение уровня метгемоглобина всегда отмечалось у детей, вскармливаемых молоком, содержащим культуру спороносных микроорганизмов, способных восстанавливать нитраты в нитриты.
^4. Изучение анамнеза 115 заболевших грудных детей после оценки результатов позволило установить, что все заболевшие получали искусственное питание, приготовленное из препаратов Sunar, Eviko и Re-lakton.
5. Исследована роль глютатиона, введенного в избытке в кровь подопытным животным. Установлено, что глютатион прямо реагирует с нитритами, поглощенными кровью, и резко меняет развитие метгемоглоби-немии. Как в остром опыте, когда оценивали разницу между двумя группами молодых лабораторных крыс, так и в длительном опыте, когда определяли уровень метгемоглобина в разные сроки, удалось доказать, что в присутствии глютатиона уровень метгемоглобина ниже. Этот факт свидетельствует о прямом взаимодействии нитритов с глютатионом.
6. Полученные результаты показывают, каким путем можно успешно разрешить проблему метгемоглобинемии в тех районах, где встречаются нитраты в питьевой воде, до тех пор, пока будет обеспечено надежное водоснабжение.
ЛИТЕРАТУРА
К a pan adze S., Gig. i San., 1961, N 9, с. 7.— Mucha V., К a men ski j P., К e 1 e t i J„ Там же, 1965, N 8, с. 16. — S u b b o t i n F. N.. Там же, 1961, N 2, с. 13. — Comí y H. H., J. A. M. A., 1945, v. 129, p. 112. — К no tek Z., Csl Hvg., 1960, т. 5, с. 160. — К n о t e k Z., Schmidt P., Ibid., 1960, т. 5, с. 592. — К n о t e k Z., Schmidt P., S o mor a J., Ibid., 1961, т. 6, с. 585. — К n о t e k Z., Schmidt P., Pediatrics, 1964, v. 34, p. 78. — К no tek Z., Schmidt P. Dusiénanová alimentárni methemoglobi-Jiemie u kojencu, Praha, 1965. — S с h m i d t P., К no tek Z., Prakt. Lék. (Praha), 1963, т. 43, c. 692, —Schmidt P., Knotek Z., M u s i I J., Csl Pediat., 1963, т. 18 с. 9.— S с h m i d t P., К n о t e k Z., Acta Hyg., 1961, т. 9, с. 2.
Поступила 6/1V 1966 г.
УДК 6I3.I65.6(063)(I00)«1965»
III МЕЖДУНАРОДНЫЙ КОЛЛОКВИУМ ПО УЛЬТРАФИОЛЕТОВОМУ ИЗЛУЧЕНИЮ
Проф. Н. М. Данциг (Москва)
4—7/Х 1965 г. в Штральзунде (ГДР) состоялся очередной, III международный коллоквиум по применению ультрафиолетового излучения в технике и науке, в том числе в гигиене. В работе коллоквиума приняли участие представители ГДР, СССР, Польши, Чехословакии, Болгарии и Югославии. III международный коллоквиум по сравнению с предшествующими (I в 1961 г. и II в 1963 г.) явился наиболее представительным по числу участвующих стран и делегатов. Естественно, что возросло и количество докладов (40), поставленных на обсуждение. Среди различных вопросов, обсуждаемых на коллоквиуме, основными были три: теория и механизм биологического действия ультрафиолетового излучения; опыт и практика применения ультрафиолетового излучения в народном хозяйстве, культуре и здравоохранении; ультрафиолетовые лампы и приборы для измерения ультрафиолетового излучения.
Наибольший интерес для врачей-гигиенистов имели доклады биологического профиля, в частности сообщения W. Eschke (Берлин) «Физические представления о модели первичного биофизического механизма
