CC BY
5
https://doi.org/10.33647/2074-5982-20-1-8-20
Ccc>
BY 4.0
ПРИНЦИПЫ СОЗДАНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОИ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГУМАНИЗИРОВАННЫХ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ, НЕСУЩИХ ГЕН HLA-C*07:02:01:01, КАК ПРООБРАЗ ИННОВАЦИОННЫХ ТРАНСГЕННО-НОКАУТНЫХ БИОМОДЕЛЕЙ
Н.Н. Каркищенко1, В.Н. Лазарев2, В.А. Манувера2, П.А. Бобровский2, Н.В. Петрова1*, Е.М. Колоскова3, Е.С. Глотова1
1 ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России» 143442, Российская Федерация, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1
2 ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина ФМБА России» 119435, Российская Федерация, Москва, Малая Пироговская ул., 1а
3 Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных -филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ им. акад. Л.К. Эрнста» 249013, Российская Федерация, Калужская обл., Боровск, п. Институт
Генетические отличия у представителей разных популяций оказывают влияние на механизм и эффективность лекарственных препаратов. Биомодели, учитывающие особенности генетического полиморфизма разных людей, позволяют полнее исследовать молекулярно-генетические механизмы действия фармакологических средств, включая иммунобиологические. Была создана рекомбинант-ная ДНК, кодирующая гибридный белок класса I MHC, содержащий ß2-микроглобулин человека, слитый с антигенпрезентирующими доменами (а1- и а2-домены) молекулы HLA-С*07:02:01:01, и а3-домен Н2-комплекса мыши. Очищенный линеаризованный фрагмент ДНК, содержащий целевую конструкцию, фланкированный регуляторными фрагментами, обеспечивающими его стабильную транскрипцию, использован для получения новой линии гуманизированных трансгенных мышей. Принципы конструирования гуманизированных трансгенных мышей путем кодирования химерного белка MHC класса I, содержащего антигенпрезентирующие домены HLA-С*07:02:01:01, аналогичны таковым при получении мышей гуманизированных трансгенных линий HLA-А*02:01:01:01 и HLA-B*18:01:01:02. Данные трансгенные линии лабораторных мышей являются самостоятельными биомоделями, а также используются в качестве базовых линий для получения на их основе соответствующих трансгенно-нокаутных линий.
Ключевые слова: генетическая конструкция, HLA-С*07:02:01:01, трансгеноз, гуманизированные трансгенные мыши
Конфликт интересов: авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование: работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУН НЦБМТ ФМБА России по теме «Получение новой линии гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-A*pX человека и нокаут комплекса H-2K мыши» (шифр: «Транснокаут-2024»). Для цитирования: Каркищенко Н.Н., Лазарев В.Н., Манувера В.А., Бобровский П.А., Петрова Н.В., Колоскова Е.М., Глотова Е.С. Принципы создания генно-инженерной конструкции для получения гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-С*07:02:01:01, как прообраз инновационных трансгенно-нокаутных биомоделей. Биомедицина. 2024;20(1):8-20. https://doi. org/10.33647/2074-5982-20-1-8-20
Поступила 15.01.2024
Принята после доработки 12.02.2024
Опубликована 10.03.2024
PRINCIPLES OF CREATION OF A GENETIC ENGINEERING CONSTRUCTION FOR OBTAINING HUMANIZED TRANSGENIC MICE WITH HLA-C*07:02:01:01, AS A PROMOTE OF INNOVATIVE TRANSGENIC AND KNOCKOUT BIOMODELS
Nikolay N. Karkischenko1, Vassili N. Lazarev2, Valentin A. Manuvera2, Pavel A. Bobrovsky2, Natalia V. Petrova1*, Elena M. Koloskova3, Elena S. Glotova1
1 Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia 143442, Russian Federation, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye gory Village, 1
2 Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of the Federal Medical
and Biological Agency of Russia 119435, Russian Federation, Moscow, Malaya Pirogovskaya Str, 1a
3 All-Russian Research Institute of Physiology, Biochemistry and Animal Nutrition — branch of the Federal Scientific Centre of Animal Husbandry—All-Russian Institute of Animal Husbandry named after acad. L.K. Ernst 249013, Russian Federation, Kaluga Region, Borovsk, Institut Village
Genetic differences in different populations influence the mechanism and efficacy of drugs. Biomodels that take into account the peculiarities of genetic polymorphism in different individuals allow to more fully investigate the molecular-genetic mechanisms of action of pharmacological agents, including immunobiolog-ical ones. Recombinant DNA encoding a hybrid MHC class I protein containing human B2-microglobulin fused with antigen-presenting domains (al and a2 domains) of the HLA-C*07:02:01:01 molecule and a3 domain of the mouse H2-complex was created. The purified linearized DNA fragment containing the target construct flanked by regulatory fragments ensuring its stable transcription was used to obtain a new line of humanized transgenic mice. The principles of designing humanized transgenic mice by encoding a chimeric MHC class I protein containing antigen-presenting domains HLA-C*07:02:01:01 are similar to those for obtaining mice of the HLA-А*02:01:01 and HLA-B*18:01:01:02 humanized transgenic lines. These transgenic lines of laboratory mice are independent biomodels, and also be used as baselines for obtaining corresponding transgenic and knockout lines.
Keywords: genetic design, HLA-C*07:02:01:01, transgenosis, humanized transgenic mice Conflict of interest: the authors declare no conflict of interest.
Funding: the article was carried out within the framework of the state assignment of the Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia on the topic "Obtaining a new line of humanized transgenic mice carrying the human HLA-A*pX gene and knockout of the mouse H-2K complex" (code: "Transknockout-2024").
For citation: Karkischenko N.N., Lazarev V.N., Manuvera V.A., Bobrovsky P.A., Petrova N.V., Koloskova E.M., Glotova E.S. Principles of Creation of a Genetic Engineering Construction for Obtaining Humanized Transgenic Mice with HLA-C*07:02:01:01, as a Promote of Innovative Transgenic and Knockout Biomodels. JournalBiomed. 2024;20(1):8-20. https://doi.org/10.33647/2074-5982-20-1-8-20
Submitted 15.01.2024 Revised 12.02.2024 Published 10.03.2024
Введение возникают проблемы в возможностях при-
Генетические отличия между этниче- менения одних и тех же препаратов и стра-
скими группами определяются полимор- тегий для лечения разных групп населения.
физмом генов в человеческих популяциях Возникает острая необходимость введения
по всему многообразию ферментативных новых норм по разработке и тестирова-
и метаболических систем, в связи с чем нию лекарственных препаратов с учетом
генетических особенностей как отдельных индивидуумов (персонализированная медицина), так и этнических групп (этническая фармакология) [2, 11, 13, 17]. Целенаправленное создание соответствующих животных биомоделей, в первую очередь гуманизированных мышей, в геном которых искусственно встроен один или несколько генов человека, позволяет быстро и надежно провести фармакологическую оценку исследуемых препаратов [2, 4, 6, 20]. Определение спектра генов, наиболее типичных для представителей разных этнических групп, в частности, самых крупных этносов многонациональной Российской Федерации, создание трансгенных гуманизированных животных-моделей, несущих соответствующие гены, является важнейшим этапом для выяснения особенностей генетических и эпигенетических механизмов патологических процессов и эффективности разрабатываемых лекарственных препаратов.
В НЦБМТ ФМБА России на протяжении 10 лет ведётся разработка гуманизированных биомоделей, а также поддерживаются уже созданные различные модели социально значимых заболеваний. В 2021 году мы создали полную гибридную ДНК-конструкцию с геном человека И1А-Л*02:01:01:01 [3]: выбор аллеля был обусловлен наибольшей частотой встречаемости у населения русской национальности HLA-А*02:01:01:01. Методом микроинъекций гибридной конструкции (ГК) в прону-клеус зигот были получены родоначальники новой гуманизированной трансгенной линии мышей-биомоделей, несущих ген И1Л-Л*02:01:01:01 [10]. По результатам селекционно-генетической работы с полученными трансгенными животными были определены три наиболее перспективные сублинии [5].
В данной работе рассматривается процесс разработки ГК, несущей фрагмент гена HLA-С*07:02:01:01, кодирующий
антигенпрезентирующие домены белка, для получения новой линии биомодели гуманизированных мышей. Выбор гена обусловлен статистикой распределения аллелей генов иммунного ответа среди населения нашей страны.
Несмотря на то, что гены ИЬЛ являются самыми полиморфными в геноме человека, ИЬЛ -аллели стабильны для популяций и сохраняются в ряду поколений. Знание частот встречаемости ИЬЛ-гаплотипов в популяциях необходимо для обнаружения подходящих доноров в различных популяционных генетических исследованиях и для изучения предрасположенности к заболеваниям среди населения. Частота встречаемости аллеля HLA-С*07:02 у населения разных регионов мира представлена на рис. 1.
Распределение аллелей гена HLA-С у доноров костного мозга из регистра ФГБУ ГНЦ Минздрава России, самоопределившихся как русские, соответствуют таковому в большинстве европейских популяций. Наиболее частотным в группе московских доноров является аллель ИЬЛ-С*07:02 (выявлен у 13,2%) [8]. Типирование на уровне второго поля (например, ИЬЛ-С*07:02) выявляет группу аллелей, кодирующих одинаковую аминокислотную последовательность пептидсвязывающих доменов. Типирование на уровне третьего поля (ИЬЛ-С*07:02:01) определяет группу аллелей, кодирующих одинаковую нуклеотидную последовательность всех экзонов гена ИЬЛ, типирование же на уровне четвертого поля позволяет определить конкретный аллель ИЬЛ -гена с нуклеотидными заменами не только в кодирующих, но и некодирующих регионах гена ИЬЛ. Для русской популяции (657 доноров Нижегородской области) были получены результаты на уровне четвертого поля по ИЬЛ -генам класса I. Установлены наиболее высокочастотные ИЬЛ -аллели: для гена HLA-А — это А*02:01:01:01 (26,9%), для HLA-В — В*07:02:01:01 (12,5%), для HЬA-С — С*07:02:01:03 (12,6%) [15].
Рис. 1. Встречаемость аллеля C*07:02 в разных регионах мира. Fig. 1. Occurrence of the C*07:02 allele in different regions of the world.
Полученные данные имеют значение: - при оценке генетически детерминированной функциональной активности естественных клеток-киллеров (NaturalKiller -NK) в исследовании их связи с разными заболеваниями и в вопросах взаимодействия между иммунной системой и репродукцией: в регуляции активности NK-клеток организма очень велика роль взаимодействия между иммуноглобулинподобными рецепторами (KIR) NK-клеток и их HLA-лигандами - некоторыми антигенами HLA I класса. Связывание HLA-лигандов с ингибирующими KIR-рецепторами (iKIR) приводит к подавлению функциональной активности NK-клеток, взаимодействие с активирующими KIR-рецепторами (aKIR) усиливает функциональную активность NK. KIR и HLA системы эволюционировали совместно, и репертуар KIR оказывает давление на баланс HLA -гаплотипов [19]. Полиморфизм KIR-генов и сочетания KIR-HLA являются важным иммуногенетиче-ским фактором, играющим существенную роль в предрасположенности и/или рези-
стентности к инфекционным, аутоиммунным и онкологическим заболеваниям;
- при трансплантации аллогенных ге-мопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) от неродственного или гаплоиден-тичного родственного донора;
- при изучении специфического иммунного ответа на инфекцию, вызванную СОУТО-19: некоторые генотипы ИЬЛ класса I могут быть связаны с критическим течением болезни [12, 22];
- в контроле течения ВИЧ-инфекции: в комплексе ИЬЛ обнаружены значимые полиморфизмы, связанные с уровнем вирусной нагрузки [14];
- при проведении антропологических исследований и при изучении ассоциаций ИЬЛ -генов с прочими социально значимыми заболеваниями.
Новая линия гуманизированных трансгенных мышей может быть использована для решения широкого круга задач, включая исследования инфекционных заболеваний, разработку и тестирование вакцин, тестирование безопасности и иммуногенности,
а также для исследований, направленных на изучение онкологических и аутоиммунных заболеваний. Данная модель позволит идентифицировать эпитопы, ограниченные супертипом HLA-C*07:02.
Материалы и методы
Получение первичного биоматериала
Для проведения HLA -типирования первичный материал (плазма крови донора с HLA-C*07:02:01:01) были любезно предоставлены сотрудниками лаборатории трансплантационной иммунологии ФГБУ «НМИЦ гематологии», которым авторы выражают глубокую благодарность. В процессе отбора доноров плазмы учитывались как фенотипические характеристики (отсутствие эпикантуса и пр.), так и генотипиче-ские маркёры, а также генеалогия человека. Бактериальные штаммы и клеточные линии В работе использовали штамм E. coli TOPIO ("Invitrogen", США), генотип F-mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) 980lacZAM15 AlacX74 nupG recAl araD139 A(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endAl X-. В работе использовали клеточную линии HEK-293FT ("Thermo Fisher Scientific", США), C2C12 ("ATCC", США). Плазмидные векторы В работе были использованы плазмид-ные векторы pсDNA3.4 ("Thermo Fisher Scientific", США), pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (Addgene #42230).
Список и последовательности использованных в работе праймеров приведены в табл. 1.
Результаты и их обсуждение
Дизайн гибридных ДНК-конструкций, включающих нуклеотидные последовательности 02-микроглобулина человека, а1- и а2-доменов МНС человека (ИЬЛ) и а3-домена МНС мыши
Для получения структурной части реком-бинантного гена было амплифицировано три ДНК-фрагмента:
1. Фрагмент гена р2-микроглобулина человека получали с ПЦР-амплификацией с парой праймеров b2mF/b2mR. В качестве матрицы использовали кДНК библиотеки, полученной из клеток линии НЕК293 с применением гексамерных праймеров;
2. Фрагмент структурной части гена HLAC, соответствующий антигенпре-зентирующим доменам а1, а2, получали с использованием пары праймеров 07F/07R и синтетической конструкцией гена HLA-C*07:02:01:01 («Евроген», Россия);
3. Фрагмент гена МНС, соответствующий домену а3 мышиного комплекса гистосов-местимости, получали с применением пары праймеров H2F-07/H2R и кДНК библиотеки, полученной из клеток коммерчески доступной линии мышиных миобластов С2С12 с использованием гексамерных праймеров.
Для сборки структурного гена 5 нг каждого из выделенных на этом этапе фраг-
Таблица 1. Олигонуклеотиды, использованные в работе Table 1. Oligonucleotides used in the work
Праймер 5'-3'- последовательность Введенный сайт
b2mF GTTCTAGAGCCACCATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAG Xbal
b2mR ACCTCATGCTGTGAGAGCATCCACCACCAGAGCCTCCA Линкер
07F TGGAGGCTCTGGTGGTGGATGCTCTCACAGCATGAGGT Линкер
07R CACATGAGCCTTTGGGGAATCGGCTCTCTGCAGTGTCTC
H2F-07 GAGACACTGCAGAGAGCCGATTCCCCAAAGGCTCATGTG
H2R ACCAAGCTTCACGCTAGAGAATGAGGGT Hindlll
cbhF TTGACTAGTCCGTTACATAACTTACGGTAAATGG Spel
cbhR GCTCTAGAACCTGAAAAAAAGTGATTTCAGGCAGGTG Xbal
ментов смешивали, добавляли ПЦР-смесь для полимеразы PhusionHigh-Fidelity DNA Polymerase ("Thermo Fisher Scientific", США), за исключением праймеров.
Программа амплификации
Применяли двухступенчатую амплификацию:
1. Первичная денатурация 2 мин при 95°С, 10 циклов в режиме: 98°С - 10 с, 60°С - 10 с, 72°С - 60 с.
2. В реакционную смесь вносили концевые праймеры b2mF/H2R и проводили еще 20 циклов ПЦР в том же режиме.
Полученный ПЦР-ампликон (содержит ген p-микроглобулина человека, соединенный через глицин-сериновый линкер с кодирующими последовательностями а1-, а2-доменов HLA-C*07:02:01:01 и а3-домена мышиного комплекса H-2K) клонировали в плазмиду pсDNA3.4 после предварительной обработки обоих компонентов эндонуклеазами рестрикции XbaI и HindIII: была получена промежуточная плазмида pсDNA3.4/b2m-C0702-h2k.
С использованием пары праймеров cbhF/ cbhR и плазмиды pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9, использованной в качестве матрицы, амплифицировали ДНК-фрагмент, соответствующий CBH-промотору (CMV-энхансер/промотор Р-актина цыплят). ПЦР-ампликон и pсDNA3.4/b2m-C0702-h2k были обработаны рестриктазами SpeI и XbaI, при этом из плазмиды pсDNA3.4/ b2m-C0702-h2k был удален исходный CMV-промотор. После лигирования была получена плазмида, содержащая генетическую последовательность, кодирующую гибридную молекулу комплекса гистосов-местимости первого класса, фланкированную CBH-промотором и WPRE-TK-PolyA терминирующим фрагментом, изначально входящим в состав плазмиды pсDNA3.4. Полученную плазмиду назвали pCBH-b2m-C0702-h2k (рис. 2).
С целью получения линейного фрагмента ДНК генной конструкции, пред-
назначенной для микроинъекции, плазмиду pCBH-b2m-C0702-h2k расщепляли эндонуклеазами рестрикции BglII и Sali. Продукты реакции разделяли с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле. Полосу, соответствующую по подвижности ДНК-фрагменту размером 3181 п.н., вырезали и выделяли из геля с помощью набора GeneJETGelExtractionKit ("Thermo Fisher Scientific", США). Концентрацию ДНК в конечном растворе определяли с помощью флуориметра Qubit ("Thermo Fisher Scientific", США). Схема полученной линеаризированной генной конструкции приведена на рис. 3, размеры и описание ее фрагментов - в табл. 2.
Ранее нами были детально описаны и охарактеризованы структурные фрагменты подобной генной конструкции - CBH-b2m-A0201-h2k [3], кодирующие гибридный HLA-A*02:01:01-H2 белок, слитый с ß2-микроглобулином человека. Данная работа дополнена обоснованием выбора промотора, общего для обеих генетических конструкций - первой (CBH-b2m-A0201-h2k) и второй (CBH-b2m-C0702-h2k).
Полученная тем или иным способом структурная часть гена (трансгена), ГК содержит информацию о структуре белка, но сама не может ее реализовать: нужны дополнительные механизмы для управления действием гена - структурные элементы - промоторы, терминаторы и энхансеры.
Промотор необходим для инициации и контроля транскрипции гена, определяет тканеспецифичность экспрессии белка. Терминатор отвечает за прекращение транскрипции, энхансеры (могут находиться в любой части генома) — последовательности ДНК, усиливающие транскрипцию при взаимодействии со специфическими белками.
Выбор промотора при создании трансгенных конструкций имеет особое значение: сильный промотор инициирует синтез мРНК часто, слабый — гораздо реже.
Рис. 2. Схема плазмиды pCBH-b2m-c0702-h2k, полученной на основе плазмиды-вектора pcDNA3.4. Примечание: плазмида содержит CBH-промотор, генр2-микроглобулина человека, соединенный последовательностью, кодирующей глицин-сериновый линкер, с последовательностью а1 а2-доменов молекулы HLA-C*07:02 и а3-домена молекулы H2K1, посттрансляционный регуляторный элемент WPRE и сигнал полиаденилирования TK PA. ДНК-последовательность CMV-промотора плазмиды pсDNA3.4 была заменена последовательностью CBH-промотора, амплифицированного с плазмиды pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9. Красными стрелками указаны сайты рестрикции для вырезания линейного фрагмента CBH-b2m-C0702-h2k. Fig. 2. Diagram of the pcpg-b2m-c0702-h2kplasmid obtained on the basis of the plasmid vector pcDNA3.4. Note: the plasmid contains a CBH promoter, a human P2 microglobulin gene connected by a sequence encoding a glycine-serine linker with a sequence of a1-a2 domains of the HLA-C*07:02 molecule and a3 domains of the H2Kk molecule, a posttranslational regulatory element WPRE and a polyadenylation signal TK PA. The DNA sequence of the CMV-promoter of the plasmid psDNA3.4 was replaced by the sequence of the CBH-promoter amplified from the plasmid pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9. The red arrows indicate the restriction sites for cutting out the linear fragment CBH-b2m-C0702-h2k.
СВН promoter ORF(b2m-C0702-h2k) ТКPA terminator
Рис. 3. Схема линейного фрагмента CBH-b2m-C0702-h2k ДНК, предназначенной для микроинъекций. Примечание: линейный фрагмент содержит CBH-промотор, структурную часть гена ft2m человека, соединен-ую глицин-сериновым линкером с а1-доменом молекулы HLA-C*07:02:01:01, а2-домен этой же молекулы HLA, а3-домен молекулы H-2K, посттрансляционныйрегуляторный элемент WPRE и сигнал полиаденилирования TKPA. Fig. 3. Scheme of a linear fragment offrag CBH-b2m-C0702-h2k DNA intended for microinjection. Note: the linear fragment contains the CBH promoter, the structural part of the human в2m gene, linked by a glycine-serine linker with the a1 domain of the HLA-C*07:02:01:01 molecule, a2 domain of the same HLA molecule, the a3 domain of the H-2K molecule, post-translational regulatory WPRE element and TK PA polyadenylation signal.
Таблица 2. Структура генной конструкции CBH-b2m-C0702-h2k Table 2. Structure of the gene constructCBH-b2m-C0702-h2k
Фрагмент Размер, п.н. Описание
CBH-b2m-C0702-h2k 3181 Генная конструкция
CBH 796 Промотор
ß2m человека 357
Экзон 1 67 Р2-микроглобулин человека
Экзон 2 279
Экзон 3 (до ТАА) 11
Линкер (Гли4Сер1) х3 45 Линкер
Фрагмент HLA C0702 540 Фрагмент МНС I класса человека (домены а1, а2)
Фрагмент h2k 501 Фрагмент МНС I класса мыши
mEx4 276 Домен а3 Н-2К
mEx5 120 Трансмембранный фрагмент белка
mEx6 33 Цитозольный фрагмент белка
mEx7 39
mEx8 32 Некодирующий экзон, нетранслируемая область
wPRE 676 Посттрансляционный регуляторный элемент
tK-PA-terminator 271 Сигнал полиаденилирования
Для экспрессии продукта в клетках эу-кариот может быть использован как промотор, характерный для собственных генов организмов, найденный в геноме, так и промотор вирусов, заражающих данный организм. Наиболее часто используемым промотором в составе генетических конструкций является промотор ранних генов цитомегаловируса СМУ, обладающий вы-
сокой активностью в различных клетках и тканях. Существенным недостатком СМУ и других универсальных вирусных промоторов является высокая подверженность метилированию в клетках млекопитающих и, вследствие этого, инактивация при интеграции трансгена в геном [23]. Вероятно, это один из механизмов противовирусной защиты человека. В некоторых случаях выявляется
15
интенсивный иммунологический ответ на трансгены с CMV-промотором, иногда трансген экспрессируется не во всех тканях. Так, при получении мышей с ГК, содержащей промотор CMV, трансген не экспресси-ровался в легких, печени, поджелудочной железе и мышечной ткани [7].
Для стимулирования экспрессии в большинстве тканей наряду с CMV широко используют и другие конститутивные промоторы, такие как промоторы 1а-субъединицы фактора элонгации человека (EF1a), ß-глюкуронидазы (GUSB) или убикви-тина C (UBC), ß-актина курицы (CBA). Введение в промотор CMV-энхансера усиливает экспрессию трансгена [21]. У CAG (синтетический промотор, содержащий ранний энхансер CMV, промотор ß-актина курицы и химерный интрон ß-актина курицы и ß-глобина кролика) в экспериментах транскрипционная активность была выше, чем у CMV [24]. Он был использован в одной из экспрессионных кассет (SEQ ID N0:2), предназначенных для вакцинации против вируса SARS-CoV-2 (Спутник V) [1]. Векторы с CAG обеспечивали долгосрочную экспрессию трансгенов во время дифференцировки стволовых клеток в мезодерму по сравнению с CMV и CBA промоторами [16]. Другая гибридная форма промотора CMV-CBA (CBh), включающая гибридный интрон (5'UTR CBA), и мышиного Minute virus (3'UTR MVM) давала устойчивую долговременную экспрессию во всех клетках [18, 21].
Для создания ГК с HLA нами был выбран CBH-промотор: широко используемая в CRISPR/Cas9 технологии плазмида pX330-U6-ChimericBB-CBh-hSpCas9 содержит CBH-промотор, обеспечивающий высокоэффективную транскрипцию эндонуклеазы Cas9 в клетках эукариот. Промотор включает в себя ранний энхансер CMV (286 п.н., делеция 18 п.н. по сравнению с CMV-энхансером), CBA-промотор (257 п.н., делеция 19 п.н. по сравнению
со стандартным промотором) и гибридный интрон (228 п.н., гибрид СВА- и МУМ-интронов) [18]. Использование СВН-промотора в составе ГК позволяет предположить эффективную экспрессию трансгена во всех органах и тканях полученных с ее использованием трансгенных животных.
Заключение
Число потребителей генно-модифици-рованных животных (ГМЖ) (трансгенных, нокаутных, гуманизированных) - в первую очередь, мышей и крыс - неукоснительно растет. Развитие отечественных лабораторий по производству ГМЖ открывает широкие возможности для создания биомоделей, отвечающих задачам конкретного исследования, а отсутствие карантина позволяет получать мышей в существенно более короткий срок и значительно снижает их себестоимость по сравнению с животными, приобретаемыми за рубежом.
ФГБУН НЦБМТ ФМБА России уже на протяжении 10 лет создает гуманизированных мышей-биомоделей для оценки метаболизма и эффективности лекарственных препаратов, разработки оптимальных способов исследования и лечения социально-значимых болезней человека [2, 3, 6].
Проведённая работа иллюстрирует процесс создания генно-инженерной конструкции, кодирующей гибридный белок МНС I класса, состоящий из антигенпрезентиру-ющих а1-, а2-доменов ЖА-С*07:02:01:01, а3-домена Н-2Кк мыши и стабилизированный р2-микроглобулином человека, соединенным гибким глицин-сериновым линкером с а1-доменом. Генетическая конструкция использована для получения новой линии гуманизированных трансгенных мышей, несущих ИЬЛ-С*07:02:01:01. Принципы конструирования данной трансгенной линии лабораторных мышей стали базовой основой и используются для получения новых линий гуманизированных трансгенно-нокаутных животных,
несущих гаплотипы доноров человека Н1А-А*02:01:01:01, HLA-B*07:02:01:01, HLA-B*18:01:01:02 и HLA-C*07:02:01:01 из регистра ФГБУ «НМИЦ гематологии», самоопределившихся как русские [9].
Создание широкой серии линий гуманизированных мышей с наиболее широко представленными вариантами HLA класса I для населения РФ позволит вплотную подойти как к популяционной, так и персонализированной медицине, эффективно решать такие задачи, как разработка и тестирование вакцин, анализ безопасности
и иммуногенности, изучение инфекционных, онкологических и аутоиммунных заболеваний. Основной нашей концепцией является направленный дизайн генетических конструкций на основе химерных ДНК-генов человека и мыши для последующей интеграции в геном мыши с целью получения новых гуманизированных трансгенных и трансгенно-нокаутных линий, т.е. мы переходим от случайного выбора или поиска животных к созданию адекватных и оптимальных линий под конкретные эксперименты.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ | REFERENCES
1. Зубкова О.В., Ожаровская Т.А., Должикова И.В., Попова О., Щебляков Д.В. Гроусова Д.М., Джа-руллаева А.Ш., Тухватулин А.И., Тухватули-на Н.М., Щербинин Д.Н., Есмагамбетов И.Б., Токарская Е.А., Ботиков А.Г., Ерохова А.С., Ижаева Ф.М., Семихин А.С., Борисевич С.В., Народицкий Б.С., Логунов Д.Ю., Гинцбург А.Л. Фармацевтическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты). Патент РФ № 2731342 C1, 2020. [Zubkova O.V., Ozharovskaya T.A., Dolzhikova I.V., Popova O., Shcheblyakov D.V. Grousova D.M., Dzharullaye-va A.Sh., Tukhvatulin A.I., Tukhvatulina N.M., Shcherbinin D.N., Esmagambetov I.B., Tokarska-ya E.A., Botikov A.G., Erokhova A.S., Izhaeva F.M., Semikhin A.S., Borisevich S.V., Naroditsky B.S., Logunov D.Yu., Ginzburg A.L. Pharmacevticheskoe sredstvo I sposob ego ispolzovania dlya indukcii specificheskogo immuniteta protiv virusa tyazhelogo ostrogo respiratornogo sindroma SARS-CoV-2 (vari-antyi) [A pharmaceutical product and a method of its use for the induction of specific immunity against the SARS-CoV-2 severe acute respiratory syndrome virus (variants)]. Patent RU No. 2731342 C1, 2020. (In Russian)].
2. Каркищенко В.Н., Болотских Л.А., Капанадзе Г.Д., Каркищенко Н.Н., Колоскова Е.М., Максимен-ко С.В., Матвеенко Е.Л., Петрова Н.В., Рябых В.П., Ревякин А.О., Станкова Н.В., Семенов Х.Х. Создание линий трансгенных животных-моделей с генами человека NAT1 и NAT2. Биомедицина. 2016;1:74-84. [Karkischenko V.N., Bolotskikh L.A., Kapanadze G.D., Karkischenko N.N., Koloskova E.M., Maksimenko S.V., Matveyenko E.L., Petrova N.V., Ryabykh V.P., Revyakin A.O., Stankova N.V., Semenov Kh.Kh. Sozdaniye liniy transgennykh zhi-
votnykh-modeley s genami cheloveka NAT1 i NAT2 [Creation of lines of transgenic animal models with human genes NAT1 and NAT2]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2016;1:74-84. (In Russian)].
3. Каркищенко В.Н., Петрова Н.В., Савченко Е.С., Огнева Н.С., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Манувера В.А., Бобровский П.А., Лазарев В.Н. Создание полных гибридных ДНК-конструкций с геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2021;17(1):10-23. [Karkischenko V.N., Petrova N.V., Savchenko E.S., Ogneva N.S., Koloskova E.M., Maksimenko S.V., Manuvera V.A., Bobrovsky P.A., Lazarev V.N. Sozdanie polnih gibritnih DNK-konstrukcij s genom cheloveka HLA-A*02:01:01:01 [Chimeric Construct Engineering with Human Variant HLA-A*02:01:01:01]. Biomeditsina [JournalBiomed]. 2021;17(1):10-23. (In Russian)].
4. Каркищенко В.Н., Рябых В.П., Каркищенко Н.Н., Дуля М.С., Езерский В.А., Колоскова Е.М., Лазарев В.Н., Максименко С.В., Петрова Н.В., Столярова В.Н., Трубицына Т.П. Молекулярно-генетические аспекты технологии получения трансгенных мышей с интегрированными генами N-ацетилтрансферазы (NAT1 и NAT2) человека. Биомедицина. 2016;1:4-17. [Karkischenko V.N., Ryabykh V.P., Karkischenko N.N., Dulya M.S., Ezerskiy V.A., Koloskova E.M., Lazarev V.N., Maksimenko S.V., Petrova N.V., Stolyarova V.N., Trubitsyna T.P. Molekulyarno-geneticheskie aspekty tekhnologii polucheniya transgennykh myshej s in-tegrirovannymi genami N-atsetiltransferazy (NAT1 i NAT2) cheloveka [Molecular and genetic aspects of the technology for producing transgenic mice with integrated genes of human N-acetyltransferase (NAT1 and NAT2)]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2016;1:4-17. (In Russian)].
5. Каркищенко Н.Н., Глотова Е.С., Петрова Н.В., Слободенюк В.В., Ларюшина Н.А., Петров Д.В.,
Васильева И.А., Дерябин К.Е. Генетический скрининг новой трансгенной гуманизированной по HLA-A*02:01:01:01 и hp2m линии мышей. Биомедицина. 2023;19(3Е):10-24. [Karkischenko N.N., Glotova E.S., Petrova N.V., Slobodenyuk V.V., Laryushina N.A., Petrov D.V., Vasil'eva I.A. Dery-abin K.E. Geneticheskij skrining novoj transgennoj gyman-izirovannoj po HLA-A*02:01:01:01 i hp2m linii myshey [Genetic screening of a new transgenic mouse line humanized for HLA-A*02:01:01:01 and hp2m]. Biomeditsina [JournalBiomed]. 2023;19(3Е):10-24. (In Russian)].
6. Каркищенко Н.Н., Рябых В.П., Каркищенко В.Н., Колоскова Е.М. Создание гуманизированных мышей для фармакотоксикологических исследований (успехи, неудачи и перспективы). Биомедицина. 2014;1(3):4-22. [Karkischenko N.N., Ryabykh V.P., Karkischenko V.N., Koloskova E.M. Sozdanie gu-manizirovannykh myshey dlya farmakotoksikologich-eskikh issledovaniy (uspekhi, neudachi I perspektivy) [Creation of humanized mice for pharmacotoxico-logical research (successes, failures and prospects)]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2014;1(3):4-22. (In Russian)].
7. Кондратьева Л.Г., Кашкин К.Н., Чернов И.П., Стукачева Е.А., Дидыч Д.А., Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д. PCNA: конститутивный промотор человека для экспрессии генов в целях их функционального и генно-терапевтического использования. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017; 3:89-92. [Kondratyeva L.G., Kashkin K.N., Chernov I.P., Stukacheva E.A., Dydich D.A., Kopantzev E.P., Sverdlov E.D. PCNA: konstitutivnij promotor cheloveka dlya ekspressii gen-ov v celyah ih phuncionalnogo I genno-terapevtich-eskogo ispolsovania. [PCNA: constitutive human promoter for expression of genes for their functional and therapeutic use]. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2017;3:89-92. (In Rusian)].
8. Кузьминова Е.П., Чапова Р.С., Хамаганова Е.Г. Распределение частот аллелей гена HLA-C И HLA-C1, -C2 групп лигандов для KIR среди потенциальных доноров костного мозга. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2016;12(2): 291-294. [Kuzminova E.P., Chapova R.S., Khamaganova E.G. Raspredelenie chastot allele gena HLA-C И HLA-C1,
-C2 grupp ligandov dlya KIR sredi potencialnih do-norov kostnogo mozga [Frequency distribution of alleles of the HLA-C and HLA-C1, -C2 ligand groups for KIR among potential bone marrow donors]. Mezhdunarodnyj zhurnal prikladnyh i fundamen-tal'nyh issledovanij [International Journal of Applied and Fundamental Research]. 2016;12(2): 291-294. (In Russian)].
9. Леонов Е.А. Аллельный и гаплотипический полиморфизм HLA-генов доноров гемопоэтических стволовых клеток регистра, самоопределившихся как русские: дисс. ... канд. биол. наук. М., 2022:117. [Leonov E.A. Allel'nyj i gaplotipicheskij polimorfizm
HLA-genov donorov gemopoeticheskih stvolovyh kle-tok registra, samoopredelivshihsya kak russkie [Allelic and haplotype polymorphism of HLA genes of donors of hematopoietic stem cells of the registry, self-identified as Russian]: dissertation ... Cand. Biol. Sci. Moscow, 2022:117. (In Russian)].
10. Савченко Е.С., Огнева Н.С., Каркищенко Н.Н. Эмбриологические аспекты создания новой гуманизированной трансгенной линии мышей с интегрированным геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2022;18(4):10-23. [Savchenko E.S., Ogneva N.S., Karkischenko N.N. Embriologicheskie aspekty sozdaniya novoj gumanizirovannoj transgennoj linii myshej s integrirovannym genom cheloveka HLA-A*02:01:01:01 [Embryological aspects of creation a new humanized transgenic mice with integrated human HLA-A*02:01:01:01 gene]. Biomedicina [JournalBiomed]. 2022;18(4):10-23. (In Russian)].
11. Степанов В.А. Геномы, популяции, болезни: этническая геномика и персонифицированная медицина. Acta Naturae (русскоязычная версия). 2010;2(4): 18-34. [Stepanov V.A. Genomi, populyacii, bolezni: etnicheskaya genomika i personificirovannaya medicina [Genomes, populations, diseases: ethnic genomics and personalized medicine]. Acta Naturae (Russian version). 2010;2(4):18-34. (In Russian)].
12. Суслова Т.А., Крохин А.А., Вавилов М.Н., Беляева С.В., Евдокимов А.В., Родионова Е.С., Султанова А.А., Чуманова Е.А., Миронова Е.А., Кофиади И.А. Генетические факторы, предрасполагающие к развитию COVID-19 (HLA, AB0, RH-HR). Вестник гематологии. 2021;17(3): 64-65. [Suslova T.A., Krokhin A.A., Vavilov M.N., Belyaeva S.V., Evdokimov A.V., Rodionova E.S., Sultanova A.A., Chumanova E.A., Mironova E.A., Kofiadi I.A. Geneticheskie factori, predpolagayuzhie k razvitiyu COVID-19 (HLA, AB0, RH-HR) [Genetic factors predisposing to the development of COVID-19 (HLA, AB0, RH-HR)]. Bulletin of Hematology. 2021;17(3):64-65. (In Russian)].
13. Сычев Д.А., Шуев Г.Н., Торбенков Е.С., Адрияно-ва М.А. Персонализированная медицина: взгляд клинического фармаколога. Consilium Medicum. 2017;19(1):61-68. [Sychev D.A., Shuev G.N., Torbenkov E.S., Adrijanova M.A. Personalizirovannaya medicina: vzglyad klinicheskogo farmakologa [Personalized medicine: clinical pharmacologist's opinion]. Consilium Medicum. 2017;19(1):61-68. (In Russian)].
14. Хаитов Р.М., Алексеев Л.П., Гудима Г.О., Кофиади И.А. Аллельные варианты генов человека, затрагивающие внутриклеточный жизненный цикл ВИЧ и регулирующие иммунный ответ на ВИЧ-инфекцию. Бюллетень сибирской медицины. 2019;18(1):119-130. [Khaitov R.M., Alexeev L.P., Gudima G.O., Kofiadi I.A. Allel'nie variant genov cheloveka, zatragivayushie vnutrikletochniy zhiznen-niy cikl VICh i reguliruyuzhie immunniy otvet na VICh-infekciyu [Allelic variants of human HIV in-
tracellular life cycle and regulating immune response of HIV infection]. Bulletin of Siberian Medicine. 2019;18(1):119-130. (In Russian)].
15. Хамаганова Е.Г., Абдрахимова А.Р., Леонов Е.А., Хижинский С.П., Гапонова Т.В., Савченко В.Г. Секвенирование следующего поколения в HLA-типировании больных с показаниями к трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток и их доноров. Гематология и трансфузи-ология. 2021;66(2):206-217. [Khamaganova E.G., Abdrakhimova A.R., Leonov E.A., Khizhinskiy S.P., Gaponova T.V., Savchenko V.G. Sekvenirovanie sleduyshego pokoleniya v HLA-tipirovanii bolnih s pokazaniami k transplantacii allogennih gemopo-eticheskih stvolovih kletok i ih donorov [Next generation sequencing HLA-typing of recipients and donors of allogeneic haematopoietic stem cells]. Russian Journal of Hematology and Transfusiology. 2021;66(2): 206-217. (In Russian)].
16. Alexopoulou A.N., Couchman J.R., Whiteford J.R. The CMV early enhancer/chicken p actin (CAG) promoter can be used to drive transgene expression during the differentiation of murine embryonic stem cells into vascular progenitors. BMC Cell Biol. 2008;9(2). DOI: 10.1186/1471-2121-9-2.
17. Brittain H.K., Scott R., Thomas E. The rise of the genome and personalised medicine. Clin. Med. (Lond.). 2017;17(6):545-551. DOI: 10.7861/clinmedi-cine.17-6-545.
18. Gray S.J., Foti S.B., Schwartz J.W., Bachaboina L., Taylor-Blake B., Coleman J., Ehlers M.D., Zylka M.J., McCown T.J., Samulski R.J. Optimizing promoters for recombinant adeno-associated virus-mediated gene ex-
pression in the peripheral and central nervous system using self-complementary vectors. Hum. Gene Ther. 2011;22(9):1143-1153. doi: 10.1089/hum.2010.245.
19. Kitpoka P., Tammakorn C., Chaisri S., Leelayuwat C., et al. Genetic profiles of killer-cell immunoglobu-lin-like receptors and HLA ligands in Thai blood donors. Human Immunology. 2016;77:470-475. doi: 10.1016/j. humimm.2016.04.019.
20. Marshall S., Madabushi R., Manolis E., Krudys K., Staab A., Dykstra K., Visser S.A.G. Model-Informed Drug Discovery and Development: Current Industry Good Practice and Regulatory Expectations and Future Perspectives. CPT Pharmacometrics Syst. Pharmacol. 2019;8(2):87-96. DOI: 10.1002/psp4.12372.
21. Powell S.K., Rivera-Soto R., Gray S.J. Viral expression cassette elements to enhance transgene target specificity and expression in gene therapy. Discov. Med. 2015;19(102):49-57.
22. Shkurnikov M., Nersisyan S., Jankevic T., Galatenko A., Gordeev I., Vechorko V., Tonevitsky A. Association of HLA Class I Genotypes With Severity of Coronavirus Disease-19. Front. Immunol. 2021;12:641900. DOI: 10.3389/fimmu.2021.641900.
23. Wang W., Jia Y.L., Li Y.C., Jing C.Q., Guo X., Shang X.F., Zhao C.P., Wang T.Y. Impact of different promoters, promoter mutation, and an enhancer on recombinant protein expression in CHO cells. Scientific Reports. 2017;8:10416.
24. Yang C.Q., Li X.Y., Li Q., Fu S.L., Li H., Guo Z.K., Lin J.T., Zhao S.T. Eval-uation of three different promoters driving gene expression in developing chicken embryo by using in vivo electroporation. Genet. Mol. Res. 2014;13:1270-1277.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ | INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Каркищенко Николай Николаевич, д.м.н., проф., акад. РАРАН, чл.-корр. РАН, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Лазарев Василий Николаевич, д.б.н., доц., ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Манувера Валентин Александрович, к.б.н., ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Nikolay N. Karkischenko, Dr. Sci. (Med.), Prof., Academician of the Russian Academy of Rocket and Artillery Sciences, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Vassili N. Lazarev, Dr. Sci. (Biol.), Assoc. Prof., Lopukhin Federal Research And Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Valentin A. Manuvera, Cand. Sci. (Biol.), Lopukhin Federal Research And Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Бобровский Павел Александрович, к.б.н., ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Петрова Наталья Владимировна*, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Колоскова Елена Михайловна, к.б.н., Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных -филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства - ВИЖ им. акад. Л.К. Эрнста»; e-mail: [email protected]
Глотова Елена Сергеевна, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»;
e-mail: [email protected]
Pavel A. Bobrovsky, Cand. Sci. (Biol.), Lopukhin Federal Research And Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Natalia V. Petrova*, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Elena M. Koloskova, Cand. Sci. (Biol.), All-Russian Research Institute of Physiology, Biochemistry and Animal Nutrition — branch of the Federal Scientific Centre of Animal Husbandry — All-Russian Institute of Animal Husbandry named after acad. L.K. Ernst; e-mail: [email protected]
Elena S. Glotova, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
* Автор, ответственный за переписку / Corresponding author
