CC BY
0
https://doi.org/10.33647/2713-0428-19-3E-10-24
(«О
BY 4.0
ГЕНЕТИЧЕСКИМ СКРИНИНГ НОВОЙ ТРАНСГЕННОЙ ГУМАНИЗИРОВАННОЙ ПО HLA-A*02:01:01:01 И hß2m ЛИНИИ МЫШЕЙ
Н.Н. Каркищенко, Е.С. Глотова*, Н.В. Петрова, В.В. Слободенюк, Н.А. Ларюшина, Д.В. Петров, И.А. Васильева, К.Е. Дерябин
ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России» 143442, Российская Федерация, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, 1
Создание новой гуманизированной трансгенной линии мышей-биомоделей, несущих ген HLA-A*02:01:01:01, требует разработки эффективного метода верификации наличия целевого трансгена в геноме животных. Нами была разработана система генетического скрининга животных на основе метода ПЦР в реальном времени и высокоспецифичных праймеров, позволяющих детектировать все функционально значимые части генетической конструкции. Кроме того, методом секвенирова-ния по Сэнгеру было показано отсутствие химеризма и полное соответствие первичной нуклеотид-ной последовательности трансгена HLA-A*02:01:01:01 заявленной генно-инженерной конструкции и гену HLA-A*02:01:01:01 человека. По результатам селекционно-генетической работы с полученными трансгенными животными были определены три наиболее перспективные сублинии, которые используются для выведения новой линии гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-A*02:01:01:01.
Ключевые слова: ПЦР в реальном времени, секвенирование по Сэнгеру, верификация трансгена,
HLA A*02:01:01:01, селекционно-генетическая работа
Конфликт интересов: авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование: работа выполнена в рамках Государственного задания «Создание трансгенных гуманизированных биомоделей с интегрированными генами HLA-A*02:101ßt русского человека» (шифр: «Трансгеноз-2021»).
Для цитирования: Каркищенко Н.Н., Глотова Е.С., Петрова Н.В., Слободенюк В.В., Ларюшина Н.А., Петров Д.В., Васильева И.А., Дерябин К.Е. Генетический скрининг новой трансгенной гуманизированной по HLA-A*02:01:01:01 и hß2m линии мышей. Биомедицина. 2023;19(3Е):10-24. https://doi.org/10.33647/2713-0428-19-3E-10-24
Поступила 10.04.2023
Принята после доработки 17.07.2023
Опубликована 06.11.2023
GENETIC SCREENING OF A NEW TRANSGENIC MOUSE LINE HUMANIZED FOR HLA-A*02:01:01:01 AND hp2m
Nikolay N. Karkischenko, Elena S. Glotova*, Nataliya V. Petrova, Vladimir V. Slobodenyuk, Nadezhda A. Laryushina, Dmitry V. Petrov, Irina A. Vasil'eva,
Kirill E. Deryabin
Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia 143442, Russian Federation, Moscow Region, Krasnogorsk District, Svetlye Gory Village, 1
The development of new humanized transgenic mouse biomodels with the HLA-A*02:01:01:01 gene requires effective methods for target transgene verification in the animal genome. In the present study, we
Каркищенко Н.Н., Глотова Е.С., Петрова Н.В., Слободенюк В.В., Ларюшина Н.А., Петров Д.В., Васильева И.А., Дерябин К.Е. «Генетический скрининг новой трансгенной гуманизированной по HLA-A*02:01:01:01 и hß2m линии мышей»
develop a system for genetic screening of animals based on real-time PCR and using highly specific primers to detect all functionally significant parts of the genetic construct. In addition, the Sanger sequencing method showed the absence of chimerism and complete correspondence between the primary nucleotide sequence of the HLA A*02:01:01:01 transgene and the developed engineered genetic construct and human gene HLA A*02:01:01:01. Based on the results of selection and genetic works with the resulting transgenic animals, three most promising sublines were identified. These lines are currently used for breeding a new line of humanized transgenic mice with the HLA-A*02:01:01:01 gene.
Keywords: real-time PCR, Sanger sequencing, transgene verification, HLA-A*02:01:01:01, selection and genetic work
Conflict of interest: the authors declare no conflict of interest.
Funding: the work was carried out within the framework of the State assignment "Creation of transgenic humanized biomodels with integrated HLA-A*02:101 pt genes of the Russian human" (code: "Transgeno-sis-2021").
For citation: Karkischenko N.N., Glotova E.S., Petrova N.V., Slobodenyuk V.V., Laryushina N.A., Petrov D.V., Vasil'eva I.A., Deryabin K.E. Genetic Screening of a New Transgenic Mouse Line Humanized for HLA-A*02:01:01:01 and hp2m. Journal Biomed. 2023;19(3E):10-24. https://doi.org/10.33647/2713-0428-19-3E-10-24
Submitted 10.04.2023 Revised 17.07.2023 Published 06.11.2023
Введение
Современные тенденции развития биомедицинских исследований диктуют новые требования по дизайну эксперимента, что преследует цель повышения качества и трансляционности получаемых результатов. Одним из ключевых моментов качественного исследования является выбор адекватной биомодели, максимально точно соответствующей задачам исследования. Однако с накоплением научных знаний исследователи сталкиваются с проблемой несоответствия существующих биомоделей актуальным данным, что осложняет дальнейшую работу и ставит под сомнение полученные результаты. Таким образом, важнейшей задачей современного биомоделирования является разработка и валида-ция актуальных биомоделей, отвечающих современным стандартам и критериям качества, применяемым в сфере биомедицинских исследований.
Особую роль среди биомоделей имеют гуманизированные животные. На сегодня биомодели, несущие гены человека, широко применяются для широкого спектра
исследований в различных областях науки. Анатомическая, физиологическая, нейро-биологическая и метаболическая аналогии [9, 14, 16, 22] основных животных биомоделей (мыши, крысы, мини-пиги [7, 10, 17, 23]) позволяют с высокой степенью достоверности моделировать различные патологические состояния человека, вплоть до создания биомоделей, воспроизводящих особенности конкретного человека. Совершенствование молекулярно-генети-ческих методов редактирования генома (CRISPR/Cas9, ZFNs, TALENs) позволяет в короткие сроки получить биомодель с заданными свойствами, отвечающую задачам исследования. Кроме того, неоспоримым преимуществом некоторых модельных животных (крысы, мыши) является возможность проследить возможные побочные эффекты в ряде поколений, что особенно важно для тестирования и контроля качества препаратов генной терапии [12].
Создание новых биомоделей тесно связано с необходимостью разработки современных методов для верификации модели и контроля качества вновь создаваемых
линий животных. Учитывая случайный механизм встраивания трансгена HLA-A*02:01:01:01, его интеграция может внести изменения в транскрипционную и функциональную активность региона встраивания [15] вплоть до нарушения работы собственных генов организма [19] или активации онкогенов [13], так же как и окружающая ДНК может привести к неконтролируемой экспрессии трансгена [23]. Тщательный генетический скрининг поголовья животных позволяет не только контролировать наследуемость интересующего признака, но и проводить эффективный отбор особей по различным критериям, таким как плодовитость и репродуктивный потенциал, сила экспрессии трансгена, отсутствие побочных эффектов, наличие мутаций и генетических перестроек и пр. Контроль генетической чистоты и отбор наиболее перспективных особей и сублиний для размножения являются предметом селекционно-генетической работы с новой линией животных биомоделей.
Как было описано ранее [6], нами были получены родоначальники новой гуманизированной трансгенной линии мышей-биомоделей, несущие ген HLA-A*02:01:01:01. Животные были получены методом микроинъекций линейного фрагмента (рис. 1) генно-инженерной конструкции (ГИК) в мужской пронуклеус зигот с последующим переносом потенциально модифицированных эмбрионов в репродуктивный тракт псевдобеременным самкам-реципиентам. Созданная ГИК кодирует химерную молекулу главного комплекса гистосовместимо-сти (MHC) класса I на поверхности клеток, состоящую из, а1-, а2- доменов HLA человека и а3-домена комплекса H 2K мыши, стабилизированную Р2-микроглобулином человека, соединённым глицин сериновым линкером с а1-, а2- доменами HLA. Данная биомодель может успешно применяться для решения широкого спектра исследовательских задач, включая исследования
иммунных реакций, инфекционных, аутоиммунных и онкологических заболеваний, а также разработки и тестирования вакцин и исследования в области фармакобезопас-ности и иммуногенности.
Целью настоящей работы было создание методики верификации трансгена НЬА-А*02:01:01:01 у полученных животных новой гуманизированной трансгенной линии и подтверждение соответствия нуклеотид-ной последовательности трансгена заявленной ГИК и гену И1А-А*02:01:01:01 человека, а также селекционно-генетическая работа с животными новой линии.
Материалы и методы
Экспериментальные животные
Для проведения селекционно-генетической работы использовались самки и самцы новой гуманизированной трансгенной линии мышей с интегрированным геном И1А-А*02:01:01:01 поколений F0-F3, полученные в ФГБУН «НЦБМТ ФМБА России», а также гибридные мыши линии СВЛ/1асхС57В1/6 ^1), полученные из филиала «Столбовая» ФГБУН «НЦБМТ ФМБА России». Животные содержались в системе индивидуальных вентилируемых клеток при световом режиме 12/12 со свободным доступом к еде и воде. Для получения F1 трансгенные особи F0 скрещивались с половозрелыми животными линии СВА/1асхС57В1/6 ^1), а для получения F2 и следующих поколений племядра формировали из подтверждённых особей предыдущего поколения по технологии инбред-ного скрещивания.
Биоматериал для генетического анализа
Материалом для исследования присутствия трансгена И1А-А*02:01:01:01 у мышей служили биоптаты хвоста. Для анализа пробы брали у всех животных, достигших возраста 3 недели.
Для определения нуклеотидной последовательности трансгена и степени химе-
Каркищенко Н.Н., Глотова Е.С., Петрова Н.В., Слободенюк В.В., Ларюшина Н.А., Петров Д.В., Васильева И.А., Дерябин К.Е. «Генетический скрининг новой трансгенной гуманизированной по HLA-A*02:01:01:01 и hß2m линии мышей»
ризма использовали леикоциты из цельной крови, а также биоптат внутренних органов взрослого животного — носителя гена HLA-A*02:01:01:01.
Выделение РНК
Получение препаратов РНК проводили с использованием набора реагентов РИБО сорб («AmpliSens», Россия) согласно инструкции производителя. Готовые растворы РНК хранили при температуре не выше +16°С не более 1 мес.
Обратная транскрипция
Получение кДНК для последующего анализа методом ПЦР проводили с использованием комплекта реагентов РЕВЕРТА-L («AmpliSens», Россия) согласно инструкции производителя. Готовый препарат кДНК хранится при температуре не выше минус 16°С в течение 1 недели или при температуре не выше минус 68°С в течение года.
Подбор праймеров
Для определения нуклеотидной последовательности праймеров было использовано программное обеспечение Vector NTI («ThermoFisher Scientific») и база данных BLAST. Синтез праймеров — «ДНК синтез» (Россия).
ПЦР в реальном времени
РВ-ПЦР проводили с использованием флуоресцентных зондов и специфических праймеров («ДНК синтез», Россия) на ам-плификаторе CFX-96 («Bio-Rad», США).
Классическая ПЦР
Реакцию проводили с использованием высокоспецифичных праймеров («ДНК синтез», Россия) на амплификаторе («ДНК Технология», Россия). Продукт ПЦР использовали для секвенирования по Сэнгеру.
Секвенирование по Сэнгеру
Процедуру проводили с использованием прямых и обратных праймеров на сек-венаторе Genetic Analyser 3500 («Applied Biosystems»). Обработку полученных результатов и сравнение и выравнивание последовательностей проводили с помощью программного обеспечения Vector NTI
(«ThermoFisher Scientific») и онлайн-моду-ля BLAST Align (https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/BlastAlign.cgi).
Результаты и их обсуждение
Дизайн системы верификации
трансгена HLA-A*02:01:01:01
методом ПЦР в реальном времени
ПЦР в реальном времени — это семейство методик количественной ПЦР со следующими чертами: а) определение выхода продукта реакции после каждого цикла амплификации; б) построение по этим данным кинетической кривой PCR; в) определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой. Для детекции ПЦР-продукта используются флуоресцентные метки, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР продукта — репортерную флуоресценцию. Данный метод позволяет точно и в короткий срок выявить нужную нуклеотидную последовательность в препаратах геномной ДНК или кДНК.
Для получения гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген HLA-A*02: 01:01:01 и презентирующих гибридные молекулы HLA класса I на поверхности клеток, была использована генно-инженерная конструкция CBH b2m А0201 h2k (структурные элементы представлены в табл. 1), линеаризованный фрагмент (рис. 1) которой был внесён в мужской про-нуклеус зигот мышей-доноров C57B1/6Y* CBA/lac. Гибридная молекула MHC класса I представляет собой белок, содержащий ß2-микроглобулин человека, слитый с а1-и а2-доменамиHLA-A*02:01:01:01, и а3-до-мен H 2К мыши (трансмембранная и цито-плазматическая части).
Нами осуществлен биоинформационный анализ последовательностей целевых участков ГИК с помощью базы NCBA, специфичных для отбора наиболее перспективных нуклеотидных последовательностей для использования в синтезе
Таблица 1. Структура генной конструкции CBH-b2m-A0201-h2k Table 1. Structure of gene construct CBH-b2m-A0201-h2k
Фрагмент Описание Размер, п.н.
CBH промотор 796
P2m человека кДНК Р2-микроглобулина человека 402
Линкер (Гли4 Сер1) х3 линкер 45
Фрагмент HLA-A0201 фрагмент кДНК МНС I HLA- А*02:01:01:01 класса человека (домены а1, а2) 540
Фрагмент h2k фрагмент кДНК МНС I класса мыши: домен а3 Н-2К, трансмембранный и цитозольный фрагменты 501
WPRE посттрансляционный регуляторный элемент 676
TK-PA-terminator сигнал полиаденилирования 271
frag CBH-b2m-A0201-h2k
3181 bp
Рис. 1. Схема линейного фрагмента frag CBH-b2m_A0201-h2k ДНК, предназначенного для микроинъекций. Fig. 1. Scheme of a linear DNA fragment frag CBH-b2m_A0201-h2k^for microinjection.
Таблица 2. Наборы праймеров для детекции структурных фрагментов генной конструкции CBH-b2m-A0201-h2k у трансгенных мышей методом РВ-ПЦР
Table 2. Sets ofprimers for detection of structural fragments of the CBH-b2m-A0201-h2k gene construct in transgenic mice using RT-PCR
Праймер Последовательность, 3'-5' Положение в трансгене
1 hb2m F TCACGTCATCCAGCAGAGAA hb2m
hb2m R CGTCATGTCTCGATCCCACT
hb2m Z ROX -CCATCCGACATTGAAGTTGACTTAC-BHQ-2
2 H2K F GGAGAAACACAGGTGGAAA 3'- фрагмент H2K
H2K R ACGGGAAGCAATAGCATGA 5'- фрагмент H2K
H2K Z ROX -CTCTCCCAGATTGTAAAGTGATGGT-BHQ-2
3 CBH F 5-TTACTCCCACAGGTGAGCG-3 CBH
CBH R 5-AGCGAGACATGGTGGCTCT-3
CBH Z ROX -CTGAGCAAGAGGTAAGGGTTTAAGG-BHQ-2
4 WPRE F 5-GACGAGTCGGATCTCCCTT-3 WPRE
WPRE R 5-TATCGACAGAGTGCCAGCC-3
WPRE Z ROX -TAACTGAAACACGGAAGGAGACAAT-BHQ-2
праймеров и флуоресцирующего зонда. В табл. 2 представлены нуклеотидные последовательности наиболее оптимальных праймеров и флуоресцентных зондов
для эффективной и высокоспецифичной детекции компонентов ГИК.
Для детекции наличия целевой модификации в геноме новой линии мышей —
Каркищенко Н.Н., Глотова Е.С., Петрова Н.В., Слободенюк В.В., Ларюшина Н.А., Петров Д.В., Васильева И.А., Дерябин К.Е. «Генетический скрининг новой трансгенной гуманизированной по HLA-A*02:01:01:01 и hß2m линии мышей»
Таблица 3. Олигонуклеотидные последовательности прямого и обратного праймера и флуоресцентного зонда для детектирования трансгенаHLA-A*02:01:01:01
Table 3. Oligonucleotide sequences of forward and reverse primers and fluorescent probe for detecting the HLA-A*02:01:01:01 transgene
Название праймера/зонда Олигонукпеотидная последовательность
b2mF 5'- TCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGT-3'
02R1 5'-GTCAACTCTGTGGGTCTGACTGTGAGCTTTCAC-3'
H B2mF 5'-TCACGTCATCCAGCAGAGAA -3'
H B2mR 5'-CGTCATGTCTCGATCCCACT-3'
H B2m Z (зонд) ROX -CCATCCGACATTGAAGTTGACTTAC-BHQ-2
трансгена HLA-A*02:01:01:01 — были подобраны и оптимизированы пары прай-меров и флуоресцентный зонд, представленные в табл. 3. С помощью первой пары можно верифицировать модификацию генома у полученных животных, подтверждая наличие аллель-специфической характеристики, тогда как вторая пара прай-меров дает ответ на наличие человеческого ß2-микроглобулина.
Стадию амплификации участка гена HLA-A*02:01:01:01 в режиме реального времени предполагается проводить в 25 мкл смеси на детектирующем ампли-фикаторе CFX-96 («Bio-Rad», США).
Состав реакционной смеси:
• ПЦР-буфер (х10): 700 mM^-HCl, pH 8,6 / 25°C, 166 mM (NH4)2SO4,
• 25 mM MgCl2,
• 0,2 mMdNTPs,
• Taq-полимераза.
Предполагаемые условия проведения амплификации: начальная денатурация при 95°C — 15 мин, затем 50 циклов: 94°C — 30 сек., 58°C — 30 сек., 72°C — 30 сек.
Разработанная методика верификации трансгена HLA-A*02:01:01:01 у мышей новой линии позволяет быстро, качественно и однозначно определить наличие целевой модификации генома. Относительная простота и доступность реактивов и оборудования позволяют в короткие сроки провести генетический скрининг поголовья животных для дальнейшей селекционно-генетической работы по выведению чистой линии или иных целей.
Дизайн системы для ПЦР детекции структурных фрагментов генной конструкции СBH-b2m-А0201-h2k у трансгенных мышей методом определения размеров амплификатов ПЦР в реальном времени позволяет быстро и качественно определить наличие трансгена в тканях и органах, однако метод позволяет получить достаточно короткие ампликоны (как правило, около 200 п.н.) и не позволяет определять достаточно протяжённые участки генома. Для определения точной первичной последовательности ГИК в геноме мышей была разработана методика получения ампликонов, кодирующих основные функциональные части трансгена, с применением метода классической ПЦР. В табл. 4 представлены праймеры, используемые для классической ПЦР, а на рис. 2 — схема детекции основных функциональных частей ГИК.
Полученные таким образом ампликоны могут быть использованы в дальнейшем как для верификации наличия трансгена методами электрофоретического фракционирования ДНК и определения размера ампликонов, так и служить материалом для определения точной нуклеотидной последовательности методом секвенирования по Сэнгеру. Подтверждение соответствия трансгена ИЬА-А*02:01:01:01 заявленной ГИК методом секвенирования по Сэнгеру Секвенирование является одним из ключевых методов в арсенале молекулярной би-
Таблица 4. Праймеры для ПЦР детекции структурных фрагментов генной конструкции CBH-b2m-A0201-h2k* Table 4. Primers for PCR structural fragments detection of the CBH-b2m-A0201-h2k construct*
№ Праймер Последовательность 5'-3' Соответствие ГИК Размер, п.н
1 hb2mF1 TCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGT b2m 372
tgR02 TGGTGAAGAAGTACCTCATGC HLA-А0201**
2 b2mF TGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACT b2m 780
m4ExR AGCTCCTCCCCATTCAACTGCCA H2Kk
3 H2K-F TGTGATGAAGATGAGAAGGAGAAACA H2Kk 340
WPRE-R TCATAAAGAGACAGCAACCAGGATTT WPRE
Примечание: * — см. схему детекции, рис. 2; ** — праймер, высокоспецифичный для HLA-0201. Note: * — see diagram of detection, fig. 2; **—primer, highly specific for the HLA-0201.
Рис. 2. Схема детекции структурных элементов конструкции CBH-b2m-A0201-h2k в геномном материале, выделенном из биологических образцов трансгенных мышей, несущих ген HLA-A*02:01:01:01. Fig. 2. Scheme for structural elements detection of a CBH-b2m-A0201-h2k construct in genomic material isolatedfrom biological samples of transgenic mice with the HLA-A*02:01:01:01 gene.
ологии, который позволяет точно установить первичную последовательность нуклеоти-дов в цепочке ДНК. Полученные при этом первичные данные с помощью специальных программ и анализа методами биоинформатики могут быть использованы для картирования ДНК, поиска последовательностей и других целей. В нашем случае использование данного метода позволяет подтвердить правильность нуклеотидной последовательности трансгена ИЬЛ-Л*02:01:01:01 и её соответствие заявленной ГИК и соответствующему гену человека.
В качестве матрицы для секвенирования мы использовали кДНК, полученную из выделенного препарата мРНК образцов ткани внутренних органов и лимфоцитов крови мышей, несущих ген ИЬЛ-Л*02:01:01:01. Выбор кДНК обоснован тем, что данной
процедурой мы подтверждаем не просто наличие гена в геноме животного, но и активный синтез нашей конструкции в клетках, т. е. транскрипционную активность трансгена, что может косвенно свидетельствовать о функциональной активности конечного продукта — гибридной молекулы MHC класса I на поверхности клеток.
Сравнение нуклеотидных последовательностей трансгена ИЬЛ-Л*02:01:01:01 из разных органов проводили выравниванием полученных сиквенсов относительно заявленной нуклеотидной последовательности генно-инженерной конструкции, а также гена ИЬЛ-Л*02:01:01:01 человека. Секвенирование проводили с использованием и прямых, и обратных праймеров.
На рис. 3 и 4 представлен пример сиквенса с прямым праймером нуклеотидной последо-
Каркищенко Н.Н., Глотова Е.С., Петрова Н.В., Слободенюк В.В., Ларюшина Н.А., Петров Д.В., Васильева И.А., Дерябин К.Е. «Генетический скрининг новой трансгенной гуманизированной по HLA-A*02:01:01:01 и hß2m линии мышей»
вательности трансгена HLA-A*02:01:01:01, крови (рис. 3а, 4а) и селезёнки (рис. 3б, 4б), полученной из образцов иммунокомпе- с цветовым обозначением функциональ-тентных органов и тканей — лимфоцитов ных частей.
GGCAGAGGTGAACCCAGGTTCATTGCCGTTGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTTCG
CTTCGACAGCGATGCTGCAAGTCAGAGGATGGAACCGAGAGCACCCTGGATCGAGCAG
GAAGGTCCTGAGTACTGGGATGGAGAGACCAGGAAGGTGAAAGCTCACAGTCAGACCC
ACAGAGTTGACCTTGGAACACTGAGAGGCTACTACAACCAGTCTGAGGCAGGCAGCCA
CACAGTGCAGAGGATGTATGGCTGTGATGTTGGCAGCGACTGGAGGTTCCTGAGAGGCT
ACCATCAGTATGCCTACGATGGCAAGGACTACATTGCTCTGAAGGAGGACTTGAGAAGC
TGGACAGCAGCTGACATGGCAGCACAGACCACCAAGCACAAGTGGGAAGCTGCTCATG
TTGCTGAGCAACTGAGAGCCTATCTGGAAGGCACCTGTGTGGAGTGGTTGAGACGCTAT
CTGGAGAATGGCAAGGAGACCTTGCAGAGAACCGATTCCCCAAAGGCTCATGTGACCC
GTCACAGCAGACCTGAAGATAAAGTCACCCTGAGGTGCTGGGCTCTCGGCTTCTACCCT
GCTGACATCACCCTGACCTGGCAGTTGATGGGRRRRRRRRSYWWA
GGCAGAGGTGAACCCAGGTTCATTGCCGTTGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTTCG
CTTCGACAGCGATGCTGCAAGTCAGAGGATGGAACCGAGAGCACCCTGGATCGAGCAG
GAAGGTCCTGAGTACTGGGATGGAGAGACCAGGAAGGTGAAAGCTCACAGTCAGACCC
ACAGAGTTGACCTTGGAACACTGAGAGGCTACTACAACCAGTCTGAGGCAGGCAGCCA
CACAGTGCAGAGGATGTATGGCTGTGATGTTGGCAGCGACTGGAGGTTCCTGAGAGGCT
ACCATCAGTATGCCTACGATGGCAAGGACTACATTGCTCTGAAGGAGGACTTGAGAAGC
TGGACAGCAGCTGACATGGCAGCACAGACCACCAAGCACAAGTGGGAAGCTGCTCATG
TTGCTGAGCAACTGAGAGCCTATCTGGAAGGCACCTGTGTGGAGTGGTTGAGACGCTAT
CTGGAGAATGGCAAGGAGACCTTGCAGAGAACCGATTCCCCAAAGGCTCATGTGACCC
GTCACAGCAGACCTGAAGATAAAGTCACCCTGAGGTGCTGGGCTCTCGGCTTCTACCCT
GCTGACATCACCCTGACCTGGCAGTTGATGGGRRRRRRRRSYWWA
Рис. 3. Сиквенс с прямым праймером трансгенаHLA-A*02:01:01:01: а — лимфоциты крови, б — селезёнка. Цветом обозначены функциональные части трансгена: hb2mg — фрагмент бета-2-микроглобулина человека, Linker — линкер, 0201 — HLA-A*02:01:01:01, H2 — фрагмент H2Kмыши.
Примечание: обнаружена однонуклеотидная замена в области H2: триплет СТТ (Leu) заменен на СТС (Leu) — без изменения аминокислотного состава конечного белка (выделена красным).
Fig. 3. Sequence with a forward primer of the HLA-A*02:01:01:01 transgene: a — blood lymphocytes, б — spleen. The color indicates the functional parts of the transgene: hb2mg — fragment of human beta-2-microglobulin, Linker — linker, 0201 — HLA-A*02:01:01:01, H2 — fragment of mouse H2 K.
Note: a single nucleotide substitution was detected in the H2 region: the triplet CTT (Leu) was replaced by CTC (Leu) — without changing the amino acid composition of the final protein (highlighted in red).
Сравнение полученных из образцов тканей нуклеотидных последовательностей показало не только 100% соответствие (рис. 5) первичной последовательности заявленной ГИК и гену ИЬЛ-А*02:01:01:01 человека, но и отсутствие химеризма,
что является важным показателем наследуемого признака.
Таким образом, полученные животные несут полный и транскрипционно активный трансген ИЬЛ-Л*02:01:01:01, целиком соответствующий заявленной
Рис. 4. Сиквенс с прямым праймером b2mgF ПЦР-ампликонов ДНК мышей, несущих ген HLA-A*02:01:01:01: а — лимфоциты крови, б — селезёнка.
Скриншоты окна программы Chromas: блоками выделены фрагменты фланкирующих HLA-0201 последовательностей: вверху слева — линкер, внизу справа — H2-k.
Fig. 4. Sequence with forward primer PCR amplicons of b2mgF DNA from mice with HLA A*02:01:01:0. a — blood lymphocytes, b — spleen.
Screenshots of program Chromas: fragments of HLA-0201 flanking sequences are highlighted in blocks: top left — linker, bottom right — H2-k.
генно-инженернои конструкции и гену ИЬЛ-Л*02:01:01:01 человека. Сравнение нуклеотидных последовательностей из разных органов расхождений в первичной структуре трансгена не выявило. Селекционная работа с животными, несущими трансген ИЬЛ-Л*02:01:01:01, в поколениях F1—F3
Трудоёмкость процесса получения новых линий трансгенных животных накладывает ответственность на сотрудников вивария. Грамотная селекционная работа с полученными родоначальниками новой линии позволяет за обозримый период времени получить достаточное количество животных, покрывающих как нужды
Каркищенко Н.Н., Глотова Е.С., Петрова Н.В., Слободенюк В.В., Ларюшина Н.А., Петров Д.В., Васильева И.А., Дерябин К.Е. «Генетический скрининг новой трансгенной гуманизированной по HLA-A*02:01:01:01 и hß2m линии мышей»
Query 1261 GCATTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATT 1320
Query 1321 CACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCC 1380
Query 1381 CAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGACGCGTGGTGGAGGTGGCAGTGGAGGTGGAGG 1440
Sbjct 1 шшшшшшшшшшашш 48
Query 1441 CTCTGGTGGTGGAGGATCTCACAGCATGAGGTACTTCTTCACCAGCGTGTCCAGACCTGG 1500
sbict 49 шшшшшшшшшшшшшаш к.
Query 1501 CAGAGGTGAACCCAGGTTCATTGCCGTTGGCTACGTGGACGACACCCAGTTCGTTCGCTT 1560
Sbict 169 ШШШШШШ1ШШШШШШШ 168
Query 1561 CGACAGCGATGCTGCAAGTCAGAGGATGGAACCGAGAGCACCCTGGATCGAGCAGGAAGG 1620
sbjct 169 ШШШШШШ1ШШШШШ1Ш 228
Query 1621 TCCTGAGTACTGGGATGGAGAGACCAGGAAGGTGAAAGCTCACAGTCAGACCCACAGAGT 1680
Sbict 229 ш1ншш1шшш1ш1шш 288
Query 1681 TGACCTTGGAACACTGAGAGGCTACTACAACCAGTCTGAGGCAGGCAGCCACACAGTGCA 1740
Sbict 289 шшшшшшшшшшшшшшшшш 348
Query 1741 GAGGATGTATGGCTGTGATGTTGGCAGCGACTGGAGGTTCCTGAGAGGCTACCATCAGTA 1800
sbict 349 шшшш1шшшш1шшшшшшшш 438
Query 1801 TGCCTACGATGGCAAGGACTACATTGCTCTGAAGGAGGACTTGAGAAGCTGGACAGCAGC I860
Sbict 409 шшшшшшшмшшшшшшшшаш 468
Query 1861 TGACATGGCAGCACAGACCACCAAGCACAAGTGGGAAGCTGCTCATGTTGCTGAGCAACT 1920
sbict 469 ШШШ1ШШШ1ШШШШШ 528
Query 1921 GAGAGCCTATCTGGAAGGCACCTGTGTGGAGTGGTTGAGACGCTATCTGGAGAATGGCAA 1980
sbict 529 шшшшшшшшшшашашшш s8a
Query 1981 GGAGACCTTGCAGAGAACCGATTCCCCAAAGGCTCATGTGACCCGTCACAGCAGACCTGA 2040
Sbict 589 шшшшшшшшшашшшашшшшша 648
Query 2041 AGATAAAGTCACCCTGAGGTGCTGGGCTCTCGGCTTCTACCCTGCTGACATCACCCTGAC 2100
Sbict 649 lllllllwjhllu 708
Query 2101 CTGG СAGTTGAATGGGGAGGAG CTGAC CCAG GAC ATGGAGCTTGTG GAG AC CAGGC CTGC 2160
Query 2161 AGGAGATGGAAC CTTC СAGAAGTGGG СATCTGTGGT CGTG С С TCTTGG G AAGGAG СAGTA 2220
Query 2221 CTACACATGCCATGTGTACCATCAGGGACTGCCTGAGCCTCTCACCCTGAGATGGGAGCC 2280
Рис. 5. Сравнение нуклеотидной последовательности трансгена hb2mg-Linker-0201-H2, полученной из лимфоцитов крови, с соответствующей нуклеотидной последовательностью ГИК CBH-b2m-A0201-H2K (BLAST, Alien, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Get&RID=HWE90DX711N).
Fig. 5. Comparison of the nucleotide sequence of the hb2mg-Linker-0201-H2 transgene from blood lymphocytes with the corresponding nucleotide sequence of the CBH-b2m-A0201-H2K construct (BLAST, Alien, https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi?CMD=Get&RID=HWE90DX711N).
исследователей, так и ресурсный фонд племенных ядер для поддержания линии. Особую роль в процессе выведения новой линии играет внимательность при подборе пар, отбор наиболее перспективных плем-ядер и сублиний для размножения, а также обязательный генетический скрининг поголовья животных.
После микроинъекций ГИК в пронукле-усы зигот и трансплантации выживших эмбрионов псевдобеременным самкам-реципиентам нами была получена 91 живая особь, 18 из которых несли искомую модификацию генома. Соотношение полов среди трансгенных особей составило 1:1 (9 самцов и 9 самок). Для проведения селекционной работы и выведения новой линии были сформированы 18 сублиний. Самок и самцов поколения F0, несущих трансген ИЬЛ-Л*02:01:01:01, скрещивали с противоположным полом с гибридными особями линии СВА/1асхС57В1/6 ^1) в возрасте 2 мес. В результате скрещивания было получено 190 мышей (поколение F1), из которых 28 особей показали наличие гена ИЬЛ-Л*02:01:01:01.
Для дальнейшей селекционно-генетической работы и получения поколений F2-F3 в племядра отбирали положительных по трансгену И1Л-Л*02:01:01:01 особей предыдущего поколения по схеме инбредно-го скрещивания. В табл. 5 показана динамика передачи трансгена в поколениях F0-F3.
Из табл. 5 видно, как растёт процент трансгенных особей с увеличением поколения, что свидетельствует о стойком наследовании данного признака. По ходу селек-
ционно-генетической работы проводилась выбраковка сублиний и племядер, имеющих низкий потенциал размножения и/или передачи признака. В качестве критериев для выбраковки нами были определены следующие: низкая сила экспрессии трансгена, невысокий показатель наследования трансгена, сниженные показатели фертильности и плодовитости (удлинённый репродуктивный цикл, небольшое количество детёнышей в помёте, каннибализм, неразвитый материнский инстинкт). Для выведения новой линии одновременно производится размножение животных трех поколений, не менее пяти племядер в каждом, что соответствует стандартам разведения лабораторных мышей и позволяет безопасно наращивать поголовье животных без риска потерять линию. На сегодняшний день для активного размножения и выведения чистой линии выделены 3 сублинии, имеющие наилучшие показатели как по транскрипционной активности трансгена (силе экспрессии трансгена), так и по плодовитости и эффективности передачи признака в ряде поколений. Кроме того, генетический скрининг поголовья животных показал отсутствие химеризма при передаче искомого признака, а также наследование полной (т. е. с сохранением всех функциональных элементов, без потери каких-либо участков) генетической конструкции, что свидетельствует о стабильности передачи трансгена от поколения к поколению.
Заключение
Нами была проведена работа по созданию методики эффективной и высокоспе-
Поколение F0 F1 F2 F3
Доля трансгенных особей в поколении, % 20 15 46 68
Всего особей в поколении 91 190 98 156
Всего трансгенных особей в поколении 18 28 45 106
Таблица 5. Динамика передачи трансгена и наращивания поголовья в трансгенной линии мышей, несущих ген HLA-A*02:01:01:01
Table 5. Dynamics oftransgene transmission and population growth in a transgenic line ofmice with HLA-A*02:01:01:01 gene
Каркищенко Н.Н., Глотова Е.С., Петрова Н.В., Слободенюк В.В., Ларюшина Н.А., Петров Д.В., Васильева И.А., Дерябин К.Е. «Генетический скрининг новой трансгенной гуманизированной по HLA-A*02:01:01:01 и hß2m линии мышей»
цифичной системы детекции трансгена ИЬЛ-Л*02:01:01:01 у мышей новой гуманизированной трансгенной линии. Использование специально подобранных и адаптированных праймеров и метода ПЦР в реальном времени позволяет точно и относительно быстро определить наличие всех функционально значимых элементов ГИК в геноме мышей. Использование в РВ-ПЦР высокоспецифичных флуоресцентных зондов служит дополнительным контролем качества проведения исследования.
Далее методом секвенирования по Сэн-геру было показано полное соответствие первичной нуклеотидной последовательности трансгена ИЬЛ-Л*02:01:01:01 заявленной ГИК и гену человека. Кроме того, для генетических исследований нами была использована кДНК, что говорит о транскрипционной активности трансгена и служит косвенным подтверждением функциональной активности конечного продукта — химерной молекулы МНС класса I на поверхности клеток мышей новой линии.
В ходе селекционно-генетической работы с животными новой линии проводился строгий отбор особей и сублиний для размножения. Дополнительно проводили генетический анализ на наличие полной ГИК в геноме и отсутствие химеризма в органах и тканях. Животные, имеющие низкий репродуктивный потенциал, сниженные показатели экспрессии трансгена и/или нарушения в первичной структуре ГИК, из размножения исключались. На сегодня для выведения новой гуманизированной трансгенной линии мышей, несущих ген И1Л-Л*02:01:01:01, отобраны 3 сублинии, максимально соответствующие нашим критериям качества. В ряде поколений наблюдается постепенное увеличение доли особей, положительных по трансгену ИЬЛ-Л*02:01:01:01, что свидетельствует
об успешной реализации стратегии размножения и стойком полном наследовании искомого признака.
Созданная на базе НЦБМТ ФМБА новая гуманизированная трансгенная линия мышей, несущих ген ИЬЛ-Л*02:01:01:01, отражает популяционные особенности иммунного ответа, характерные для населения России. Однако анализ распределения аллелей главного комплекса гисто-совместимости среди мировых популяций [7, 21] свидетельствует о наличии данной аллели в иных мировых сообществах, преимущественно, у евопеоидов, что говорит об универсальности применения созданной биомодели для различных исследований в области медицины и фармакологии [8, 11, 20, 21]. Огромный опыт по биомоделированию социальнозначимых заболеваний [5] и созданию и верификации [1-4] гуманизированных трансгенных моделей позволяет НЦБМТ ФМБА России создавать уникальные биомодели, соответствующие современным стандартам качества. Успешное применение актуальных методов и подходов к биомоделированию позволяет в кратчайшие сроки реализовывать поставленные задачи. Контроль и совершенствование внутренних протоколов работы позволяют сохранять высокий уровень проведения научных исследований и строгое следование принципам 3R [18].
Таким образом, в настоящее время продолжается активная селекционно-генетическая работа по выведению новой линии гуманизированных трансгенных мышей, несущих ген ИЬЛ-Л*02:01:01:01. Полученные животные могут быть использованы для различных исследований, включая исследования иммунных реакций, инфекционных, аутоиммунных и онкологических заболеваний, а также разработки и тестирования вакцин и исследования в области фармако-безопасности и иммуногенности.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ | REFERENCES
1. Каркищенко В.Н., Болотских Л.А., Капанадзе Г.Д., Каркищенко Н.Н., Колоскова Е.М., Максимен-ко С.В., Матвеенко Е.Л., Петрова Н.В., Рябых В.П., Ревякин А.О., Станкова Н.В., Семёнов Х.Х. Создание линий трансгенных животных-моделей с генами человека NAT1 и NAT2. Биомедицина. 2016;1:74-84. [Karkischenko V.N., Bolotskih L.A., Kapanadze G.D., Karkischenko N.N., Koloskova E.M., Maksimenko S.V., Matveyenko E.L., Petrova N.V., Ryabyh V.P., Revyakin A.O., Stankova N.V., Seme-nov H.H. Sozdanie linij transgennyh zhivotnyh-modelej s genami cheloveka NAT1 i NAT2 [Creation of lines of transgenic animal models with human NAT1 and NAT2 genes]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2016;1:74-84. (In Russian)].
2. Каркищенко В.Н., Рябых В.П., Болотских Л.А., Семенов Х.Х., Капанадзе Г.Д., Петрова Н.В., Езерский В.А., Жукова О.Б., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Столярова В.Н., Трубицина Т.П. Физиолого-эмбриологические аспекты создания трансгенных мышей с интегрированными генами NAT1 и NAT2 человека. Биомедицина. 2016;1:52-65. [Karkischenko V.N., Ryabyh V.P., Bolotskih L.A., Semenov H.H., Kapanadze G.D., Petrova N.V., Ezerskij V.A., Zhukova O.B., Koloskova E.M., Maksimenko S.V., Stolyarova V.N., Trubicina T.P. Fiziologo-embriologicheskie aspekty sozdaniya trans-gennyh myshej s integrirovannymi genami NAT1 i NAT2 cheloveka [Physiological and Embryological Aspects of Creation of Transgenic Mice with Integrated Human NAT1 and NAT2 Genes]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2016;1:52-65. (In Russian)].
3. Каркищенко В.Н., Рябых В.П., Каркищенко Н.Н., Дуля М.С., Езерский В.А., Колоскова Е.М., Лазарев В.Н., Максименко С.В., Петрова Н.В., Столярова В.Н., Трубицина Т.П. Молекулярно-генетические аспекты технологии получения трансгенных мышей с интегрированными генами N-ацетилтрансферазы (NAT1 и NAT2) человека. Биомедицина. 2016;1:4-17. [Karkischenko V.N., Ryabyh V.P., Karkischenko N.N., Dulya M.S., Ezerskij V.A., Koloskova E.M., Lazarev V.N., Maksimenko S.V., Petrova N.V., Stolyarova V.N., Trubicina T.P. Molekulyarno-geneticheskie aspekty tekhnologii polucheniya transgennyh myshej s inte-grirovannymi genami N-acetiltransferazy (NAT1 i NAT2) cheloveka [Molecular genetic aspects of the technology for obtaining transgenic mice with integrated human N-acetyltransferase (NAT1 and NAT2) genes]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2016;1:4-17. (In Russian)].
4. Каркищенко Н.Н., Петрова Н.В., Слободенюк В.В. Высокоспецифичные видовые праймеры к генам Nat1 и Nat2 для сравнительных исследований у человека и лабораторных животных. Биомедицина. 2014;1(2):4-24. [Karkischenko N.N., Petrova N.V.,
Slobodenyuk V.V. Vysokospetsifichnye vidovye pra-jmery k genam Nat1 i Nat2 dlya sravnitel'nykh issledo-vanij u cheloveka i laboratornykh zhivotnykh [Highly specific species primers for the Nat1 and Nat2 genes for comparative studies in humans and laboratory animals]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2014;1(2):4-24. (In Russian]).
5. Помыткин И.А., Каркищенко В.Н., Фокин Ю.В., Нестеров М.С., Петрова Н.В. Модель фатального острого поражения легких и острого респираторного дистресс-синдрома. Биомедицина. 2020;16(4):24-33. [Pomytkin I.A., Karkischenko V.N., Fokin Yu.V., Nesterov M.S., Petrova N.V. Model' fatal'nogo ostro-go porazheniya legkikh i ostrogo respiratornogo dis-tress-sindroma [A Model of Fatal Acute Lung Injury and Acute Respiratory Distress Syndrome]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2020;16(4):24-33. (In Russian)]. DOI: 10.33647/2713-0428-16-4-24-33.
6. Савченко Е.С., Огнева Н.С., Каркищенко Н.Н. Эмбриологические аспекты создания новой гуманизированной трансгенной линии мышей с интегрированным геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2022;18(4):10-23. [Savchenko E.S., Ogneva N.S., Karkischenko N.N. Embriologicheskie aspekty sozdaniya novoj gumanizirovannoj transgennoj linii myshej s integrirovannym genom cheloveka HLA-A*02:01:01:01 [Embryological Aspects of Creation a New Humanized Transgenic Mice with Integrated human HLA-A*02:01:01:01 gene]. Biomedicina [Journal Biomed]. 2022;18(4):10-23. (In Russian)].
7. Aigner B., et al. Transgenic pigs as models for transla-tional biomedical research. Journal of molecular medicine. 2010;88:653-664.
8. Bai J., Wang J., Yang Y., Wang F., He A., Zhang W. Identification of HLA-A*0201-restricted CTL Epitopes for MLAA-34-specific Immunotherapy for Acute Mono-cytic Leukemia. J. Immunother. 2021;44(4):141-150.
9. Beckford-Vera D.R., Gonzalez-Junca A., Janneck J.S., Huynh T.L., Blecha J.E., Seo Y., Li X., VanBrocklin H.F., Franc B.L. PET/CT Imaging of Human TNFa Using [89Zr] Certolizumab Pegol in a Transgenic Preclinical Model of Rheumatoid Arthritis. Mol. Imaging Biol. 2020;22(1):105-114.
10. Carter D.B., et al. Phenotyping of transgenic cloned piglets. Cloning and stem cells. 2002;4:131-145.
11. Chen Z., Ruan P., Wang L., Nie X., Ma X., Tan Y. T and B cell Epitope analysis of SARS-CoV-2 S protein based on immunoinformatics and experimental research. J. Cell Mol. Med. 2021.
12. Chu M.L., Moran E. The Limb-Girdle Muscular Dystrophies: Is Treatment on the Horizon? Neuro-therapeutics. 2018;15(4):849-862.
13. Giraldo P., Rival-Gervier S., Houdebine L.M., Montoliu L. The potential benefits of insulators on het-erologous constructs in transgenic animals. Transgenic Res. 2003;12:751-755.
Каркищенко Н.Н., Глотова Е.С., Петрова Н.В., Слободенюк В.В., Ларюшина Н.А., Петров Д.В., Васильева И.А., Дерябин К.Е. «Генетический скрининг новой трансгенной гуманизированной по HLA-A*02:01:01:01 и hß2m линии мышей»
14. Levedakou E.N., Popko B. Rewiring enervated: thinking LARGEr than myodystrophy. J. Neurosci. Res. 2006;84(2):237-243.
15. Ma L., Wang Y., Wang H., Hu Y., Chen J., Tan T., Hu M., Liu X., Zhang R., Xing Y., Zhao Y., Hu X., Li N. Screen and Verification for Transgene Integration Sites in Pigs. Sci. Rep. 2018;8(1):7433.
16. Paquet D., Kwart D., Chen A., et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature. 2016;533:125-129.
17. Rogers C.S., et al. Disruption of the CFTR gene produces a model of cystic fibrosis in newborn pigs. Science. 2008;321:1837-1841.
18. Russell W.M.S. BRL. The Principles of Humane Experimental Technique. Med. J. Aust. [Internet]. 1960;1(13):500.
19. Schroder A.R.W., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 2002;110:521-529.
20. Thomas R., Shaath H., Naik A., Toor S.M., Elkord E., Decock J. Identification of two HLA-A*0201 immunogenic epitopes of lactate dehydrogenase C (LDHC): potential novel targets for cancer immunotherapy. Cancer Immunol. Immunother. 2020;69(3):449-463.
21. Valkenburg S.A., Josephs T.M., Clemens E.B., Grant E.J., Nguyen T.H., Wang G.C., Price D.A., Miller A., Tong S.Y., Thomas P.G., Doherty P.C., Rossjohn J., Gras S., Kedzierska K. Molecular basis for universal HLA-A*0201-restricted CD8+ T-cell immunity against influenza viruses. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2016;113(16):4440-4445.
22. van Vuuren A.J., van Roon J.A., Walraven V., Stuij I., Harmsen M.C., McLaughlin P.M., van de Winkel J.G., Thepen T. CD64-directed immunotoxin inhibits arthritis in a novel CD64 transgenic rat model. J. Immunol. 2006;176(10):5833-5838.
23. Yang D.S., et al. Expression of Huntington's disease protein results in apoptotic neurons in the brains of cloned transgenic pigs. Hum. Mol. Genet. 2010;19:3983-3994.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ | INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Каркищенко Николай Николаевич, д.м.н., проф., чл.-корр. РАН, акад. РАРАН и Международной академии астронавтики (Париж), ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Nikolay N. Karkischenko, Dr. Sci. (Med.), Prof., Corr. Member of the RAS, Acad. of the Russian Academy of Rocket and Artillery Sciences, Acad. of the International Academy of Astronautics (Paris), Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Глотова Елена Сергеевна*, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»;
e-mail: [email protected]
Elena S. Glotova*, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Петрова Наталья Владимировна, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Nataliya V. Petrova, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Слободенюк Владимир Владимирович, к.б.н., ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Ларюшина Надежда Андреевна, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Vladimir V. Slobodenyuk, Cand. Sci. (Biol ), Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Nadezhda A. Laryushina, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Петров Дмитрий Валерьевич, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Васильева Ирина Андреевна, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: [email protected]
Дерябин Кирилл Егорович, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»;
e-mail: [email protected]
Dmitry V. Petrov, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Irina A. Vasil'eva, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: [email protected]
Kirill E. Deryabin, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia;
e-mail: [email protected]
* Автор, ответственный за переписку / Corresponding author
