СОЗДАНИЕ ПОЛНЫХ ГИБРИДНЫХ ДНК-КОНСТРУКЦИЙ С ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА HLA-A*02:01:01:01 Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

https://doi.org/10.33647/2074-5982-17-1-10-23

Ccc)

BY 4.0

СОЗДАНИЕ ПОЛНЫХ ГИБРИДНЫХ ДНК-КОНСТРУКЦИЙ С ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА HLA-A*02:01:01:01

В.Н. Каркищенко1, Н.В. Петрова1, *, Е.С. Савченко1, Н.С. Огнева1, Е.М. Колоскова2, С.В. Максименко1, В.А. Манувера3, П.А. Бобровский3, В.Н. Лазарев3

1 ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России» 143442, Российская Федерация, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, влд. 1

2 Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных — филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства —

ВИЖ им. акад. Л.К. Эрнста» 249013, Российская Федерация, Калужская обл., Боровск, п. Институт

3 ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины ФМБА России» 119435, Российская Федерация, Москва, Малая Пироговская ул., 1а

Борьба с фатальными острыми поражениями легких, острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС), «цитокиновым штормом», возникающими при тяжелой интерстициальной патологии, в т. ч. COVID-19, требует быстрого получения и внедрения новых препаратов, биомедицинских технологий лечения. Это, в свою очередь, ставит исследователей перед задачей разработки адекватных биомоделей для доклинических исследований. Существующие генетические отличия у представителей разных этнических групп населения оказывают влияние на механизм и эффективность лекарственных препаратов. Биомодели, учитывающие особенности генетического полиморфизма конкретных популяций, позволяют полнее исследовать молекулярно-генетические механизмы действия фармакологических средств, включая иммунобиологические. Созданная генно-инженерная конструкция кодирует гибридную молекулу класса I MHC и содержит В2-микроглобулин человека, фрагменты (а1-и а2-домены) гена HLA-A*02:01:01:01, который характерен для русского человека, и а3 домен Н2-К комплекса мыши. Линейный фрагмент из ДНК-конструкции будет в дальнейшем использован для получения линии гуманизированных трансгенных мышей.

Ключевые слова: генно-инженерная конструкция, HLA-A*02:01:01:01 русского человека, трансге-ноз, гуманизированные трансгенные мыши

Конфликт интересов: авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности: авторы выражают искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории трансплантационной иммунологии ФГБУ «НМИЦ гематологии» и её заведующему Ефимову Григорию Александровичу за помощь в отборе доноров и предоставлении образцов плазмы крови. Для цитирования: Каркищенко В.Н., Петрова Н.В., Савченко Е.С., Огнева Н.С., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Манувера В.А., Бобровский П.А., Лазарев В.Н. Создание полных гибридных ДНК-конструкций с геном человека HLA-A*02:01:01:01. Биомедицина. 2021;17(1):10-23. https://doi. org/10.33647/2074-5982-17-1-10-23

Поступила 02.11.2020

Принята после доработки 22.01.2021

Опубликована 10.03.2021

CHIMERIC CONSTRUCT ENGINEERING WITH HUMAN VARIANT

HLA-A*02:01:01:01

Vladislav N. Karkischenko1, Nataliya V. Petrova1, *, Elena S. Savchenko1, Nastasya S. Ogneva1, Elena M. Koloskova2, Sergey V. Maksimenko1, Valentin A. Manuvera3, Pavel A. Bobrovsky3, Vassili N. Lazarev3

1 Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia 143442, Russian Federation, Moscow Region, Krasnogorskiy District, Svetlye Gory Village, building 1

2 All-Russian Research Institute of Physiology, Biochemistry and Animal Nutrition — branch of the Federal Scientific Centre of Animal Husbandry — All-Russian Institute of Animal Husbandry

named after acad. L.K. Ernst 249013, Russian Federation, Kaluga Region, Borovsk, Institut Settlement

3 Federal Research and Clinical Centre of Physical-Chemical Medicine of the Federal Medical

and Biological Agency of Russia 119435, Russian Federation, Moscow, Malaya Pirogovskaya Street, 1a

The containment of lethal acute lung injuries, acute respiratory distress syndrome (ARDS) and cytokine storm arising from severe interstitial pathology, including COVID-19, requires an efficient design and therapeutic implementation of new drugs and biomedical technologies. This demand calls for adequate biomodels in preclinical research and trial. Genetic variations between ethnic groups condition the specific mechanisms of drug efficiency. Modelling this population-specific genetic polymorphism allows a comprehensive research into the molecular bases of pharmacological action, also in immune biology. The engineered chimeric molecule encodes a MHC class I product that combines human B2-microglobulin, the a1 and a2 domains of Russian ethnic allelic variant HLA-A*02:01:01:01 and murine H2-K complex a3 domain. The linear chimeric gene fragment will be used to obtain humanised lineages of transgenic mice.

Keywords: genetically engineered construct, Russian ethnic variant HLA-A*02:01:01:01, transgenosis, humanised transgenic mice

Conflict of interest: the authors declare no conflict of interest.

Acknowledgements: the authors are sincerely grateful to staff of the Laboratory of Transplant Immunology at the National Medical Research Centre of Haematology and head of laboratory Efimov Grigory Alexandrovich for assistance in donor selection and provision of blood plasma samples. For citation: Karkischenko V.N., Petrova N.V., Savchenko E.S., Ogneva N.S., Koloskova E.M., Maksimenko S.V., Manuvera V.A., Bobrovsky P.A., Lazarev V.N. Chimeric Construct Engineering with Human Variant HLA-A*02:01:01:01. JournalBiomed. 2021;17(1):10-23. https://doi.org/10.33647/2074-5982-17-1-10-23

Submitted 02.ii.2020 Revised 22.0i.202i Published i0.03.202i

Введение людей, сформировавшиеся в результате

Современные биомедицинские тенден- длительной эволюции при взаимодействии

ции требуют оценки не только химико- генотипа с условиями окружающей среды

и фармакодинамики, а также соответствую- и являющиеся результатом адаптации ор-

щих кинетических параметров и констант, ганизма к образу жизни, рациону питания,

но и фармакогенетических и геномных климатическим особенностям территории

показателей. Несмотря на общность проис- и другим факторам внешней среды. Это

хождения, существуют генетические отли- предопределено исключительным поли-

чия между разными этническими группами морфизмом генов в человеческих популя-

циях по всему многообразию ферментативных и метаболических систем, что создаёт существенные проблемы в возможностях применения одних и тех же препаратов и стратегий для лечения разных групп населения. В США и других странах мира начато создание этнических лекарств, а в большинстве государств принимаются законодательные ограничения изготовления и реализации препаратов по их побочному действию на основные этнические группы населения [6]. Отличия в воздействии лекарственных препаратов свидетельствуют о наличии внутренних механизмов, определяющих этот феномен. Накопление научных данных о предрасположенности разных этнических групп к развитию определённых заболеваний и стремительное развитие этнической фармакологии показывают необходимость введения новых норм по разработке и тестированию лекарственных препаратов, учитывающих генетические особенности потребителей, что, в свою очередь, предполагает целенаправленное создание биомоделей [1-9, 13, 19] для фармакологической оценки этих препаратов. Огромным прорывом в биомоделировании стала возможность создания гуманизированных мышей, в геном которых искусственно встроен один или несколько генов человека. Использование в исследованиях подобных мышей позволяет получить наиболее полные результаты, т. к. данная модель максимально точно воспроизводит генетические особенности и позволяет более достоверно экстраполировать полученные результаты на человека. В России этим вопросам пока уделяется минимальное внимание, хотя русские являются самым многочисленным народом не только нашей страны, но и всей Европы, с крупными диаспорами в ближнем и дальнем зарубежье. Русские достаточно однородны в антропологическом отношении, с крайне редко встречаемым эпикантусом, близким по аутосомным маркерам с европейскими

народами, особенно северными. По результатам исследования маркёров митохондри-альной ДНК они имеют значительные, если не кардинальные, отличия от соседних, тюркских, монголоидных, северо-кавказских и финно-угорских, популяций [22, 24]. Создание трансгенных гуманизированных животных-моделей, несущих ген русского человека, является важнейшим этапом для выяснения особенностей генетических и эпигенетических механизмов патологических процессов и эффектов лекарств.

Сильнейшие вспышки инфекционных заболеваний преследовали человечество на протяжении всей истории. Примерно каждые 100 лет масштабная эпидемия инфекционных заболеваний (чума, «испанка» и пр.) уносила жизни миллионов людей. Не стал исключением и XXI век. Пандемия СОУГО-19, вируса, преодолевшего кросс-видовой барьер и молниеносно охватившего весь земной шар [10, 23], нанесла серьёзный урон мировой экономике, здравоохранению и социально-экономическим устоям общества. Различия в степени тяжести, симптомах и их выраженности [16], а также накопление данных об этнических особенностях протекания болезни у разных групп населения (появление «британского штамма» и пр.) позволяют предположить наличие внутренних механизмов, оказывающих влияние как на чувствительность организма к вирусу, так и на эффективность применения той или иной терапии.

В конце декабря 2020 г. главный врач Англии Крис Уитти заявил об обнаружении новой разновидности коронавируса 8ЛЯ8-СоУ-2, мутация которого привела к большей вирулентности, скорости распространения с чертами популяционного полиморфизма. Клинические наблюдения за течением процессов при поражении коронавирусом презентировали (по данным отчетов московских госпиталей и собственным наблюдениям) документально подтвержденные этнические и популяционные различия у от-

дельных пациентов, что определяло выбор терапевтической и, в целом, врачебной тактики в отношении как русских, так и представителей других этнических групп.

Опыт показывает, что не все препараты, разрешенные к медицинскому применению и хорошо себя зарекомендовавшие в странах Американского континента, Юго-Восточной Азии и Ближнего Востока, были столь же оптимальны в отношении русской популяции. Это особенно относится к медицинским им-муно-биологическим средствам, белковым, пептидным, антибиотическим средствам и противовирусным препаратам.

Группа учёных из США обобщила данные Института биомедицинских исследований и Массачусетского технологического института (США) и отметила позитивность ПЦР-тестов у переболевших COVID-19 даже после выздоровления, о чём сообщили в журнале «Science» [12, 26]. Фрагменты SARS-CoV-2 в принципе способны интегрироваться в геном человека, и это иллюстрируется механизмом обратной транскрипции. Тому подтверждение, что человеческий геном содержит около 98-ми тыс. эндогенных ретровирусных элементов последовательностей ДНК архивирусов, внедрившихся туда более 150-ти тыс. лет назад. Дэвид Балтимор, профессор Массачусетского технологического института, Нобелевский лауреат по физиологии и медицине, «отец генной инженерии», в комментариях к статье отметил, что подтверждена лишь сама возможность интеграции, соответственно, возникают вопросы: остается ли инфицированный SARS-CoV-2 геном человека таковым навсегда? Как тогда это скажется на стратегии лечения? Каковы пути поиска таргетных препаратов? Возможны ли реальные биомодели на основе гуманизированных трансгенных животных, несущих ген человека? Эти и другие вопросы важны для всего научного сообщества. На данном этапе перед мировым сообществом стоит задача разработки оптимальных и адекват-

ных стратегий лечения и профилактики, которые в свою очередь требуют создания надёжных биомоделей.

В НЦБМТ ФМБА России ведётся разработка новой биомодели, а также поддерживаются уже созданные различные модели социально значимых заболеваний. В настоящее время нами описана токсическая модель острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), которая воспроизводит повреждения организма, аналогичные вирусной пневмонии при СОУГО-19 [3, 9].

Данная работа посвящена лишь небольшому, но важному фрагменту процесса создания новой биомодели: разработке генно-инженерной конструкции (ГИК) для получения гуманизированных мышей, несущих ген ИЬЛ-А*02:01:01:01. Выбор мишени для трансгенеза обусловлен динамикой распределения аллелей генов иммунного ответа среди населения нашей страны. Анализ литературных данных показал, что аллелью, имеющей наибольшую частоту встречаемости у русских людей, является ИЬЛ-А*02:01:01:01. На основе этой ГИК в дальнейшем будет создана линия гуманизированных трансгенных мышей, которая может быть использована для решения широкого круга задач, включая исследования инфекционных заболеваний, разработку и тестирование вакцин, тестирование безопасности и иммуногенности, а также для исследований, направленных на изучение онкологических и аутоиммунных заболеваний.

Материалы и методы

Получение первичного биоматериала

Первичный материал (плазма крови) был любезно предоставлен лабораторией трансплантационной иммунологии ФГБУ «НМИЦ гематологии» (зав. лаб. Ефимов Григорий Александрович). В процессе отбора доноров плазмы учитывались как фе-нотипические характеристики (отсутствие эпикантуса и пр.), так и генотипические маркёры, а также генеалогия человека.

Таблица 1. Олигонуклеотиды, использованные в работе Table 1. Oligonucleotides used in research

Праймер 5'-3'-последовательность Введенный сайт

XbaI

b2mR ACCTCATGCTGTGAGAGCATCCACCACCAGAGCCTCCA

07F TGGAGGCTCTGGTGGTGGATGCTCTCACAGCATGAGGT

07R CACATGAGCCTTTGGGGAATCGGCTCTCTGCAGTGTCTC

H2F GAGACACTGCAGAGAGCCGATTCCCCAAAGGCTCATGTG

H2R ACCAAGCTTCACGCTAGAGAATGAGGGT HindIII

cbhF TTGACTAGTCCGTTACATAACTTACGGTAAATGG SpeI XbaI

cbhR GCTCTAGAACCTGAAAAAAAGTGATTTCAGGCAGGTG

Бактериальные штаммы и клеточные линии

В работе использовали:

• штамм E. coli TOPIO («Invitrogen», США), генотип F- mcrA A (mrr-hsdRMS-mcrBC) 980lacZAM15 AlacX74 nupG recAl araD139 A (ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL (StrR) endAl X-;

• клеточные линии HEK-293FT («Thermo Fisher Scientific», США), C2C12 ("ATCC", США).

Плазмидные векторы

В разработке ГИК применяли плазмидные векторы pcDNA3.4 ("ThermoFisher Scientific", США). pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (Addgene #42230). Список и последовательности праймеров, использованных в работе, приведены в табл. 1.

Результаты и их обсуждение

Дизайн химерных ДНК-конструкций, включающих нуклеотидные последовательности ß-микроглобулина человека, а1- и а2-доменов MHC человека (HLA) и а3-домена MHC мыши для интеграции в геном мыши с целью получения новой гуманизированной трансгенной линии

Для получения структурной части химерного гена было амплифицирова-но три ДНК-фрагмента: фрагмент гена ß2-микроглобулина человека с использованием пары праймеров b2mF/b2mR-02

и кДНК библиотеки в качестве матрицы, полученной из клеток линии HEK293 с использованием гексамерных праймеров; фрагмент структурной части гена HLA А, соответствующий доменам а1 и а2, с использованием пары праймеров 02F/02R и синтетической конструкцией гена HLA-A*02:01:01:01 («Евроген», Россия); фрагмент гена MHC, соответствующий домену а3 мышиного комплекса гистосо-вместимости, с использованием пары прай-меров H2F-02/H2R и кДНК библиотеки, полученной из клеток линии С2 С12, с использованием гексамерных праймеров.

Для сборки фрагмента из трех частей 5 нг каждого из выделенных фрагментов с первого этапа смешивали, добавляли ПЦР-смесь для полимеразы Phusion High-Fidelity DNA Polymerase («Thermo-Fisher Scientific», США) за исключением прай-меров.

Программа амплификации

Программа амплификации была следующей: первичная денатурация 2 мин при 95°C, 10 циклов в режиме: 98°C — 10 с, 60°C — 10 с, 72°C — 60 с. Далее были добавлены праймеры b2mF/H2R, после чего было проведено еще 20 циклов в режиме: 98°C — 10 с, 60°C — 10 с, 72°C — 60 с. В результате был получен ПЦР-фрагмент, соответствующий структурной части гена р-микроглобулина человека, соединенной через глицин-сериновый линкер с а1-, а2-доменами

HLA A*02:01:01:01 и а3-доменом мышиного комплекса H-2K. Полученный ДНК-фрагмент клонировали в плазми-ду pсDNA3.4 после предварительной обработки эндонуклеазами рестрикции XbaI и HindIII. Далее был амплифи-цирован ДНК-фрагмент с использованием пары праймеров cbhF/cbhR и плазмиды pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 в качестве матрицы. ДНК-фрагмент и плаз-мида, полученная на предыдущем этапе, были обработаны эндонуклеазами рестрикции SpeI и XbaI. После лигирования был получен вектор, содержащий промотор Р-актина цыплят CBH и кодирующий химерный комплекс гистосовместимости первого класса, содержащий кодирующую часть гена p-микроглобулина человека, соединенную через глицин-сери-новый линкер с а1-, а2-доменами HLA A*02:01:01:01 и а3-доменом мышиного комплекса H-2K. Полученную плазмиду назвали pCBH-b2m-A0201-h2k (рис. 1).

С целью получения линейного фрагмента ДНК (генной конструкции), предназначенной для микроинъекций, плазмиду pCBH-b2m-A0201-h2k расщепляли эндо-нуклеазами рестрикции BglII и Sail (имеют более одного сайта рестрикции в исходной плазмиде-векторе). Продукты реакции разделяли с помощью электрофореза в ага-розном геле. Полосу, соответствующую по подвижности ДНК-фрагменту размером 3181 п. н., вырезали и выделяли из геля с помощью набора GeneJET Gel Extraction Kit («Thermo-Fisher Scientific», США). Концентрацию ДНК в конечном растворе определяли с помощью флуориметра Qubit («Thermo-Fisher Scientific», США). Схема полученной генной конструкции приведена на рис. 2, размеры и описание ее фрагментов — в табл. 2.

Для изучения реакций молекул HLA класса I (HLA CI) с цитотоксическими T-лимфоцитами (Т-киллеры, CTL) во многих лабораториях мира были созданы

животные-модели — гуманизированные трансгенные мыши, экспрессирующие немодифицированные молекулы ИЬЛ С1 [11]. Однако при заражении этих мышей вирусами, презентируемыми молекулами других аллелей ИЬЛ С1, преимущественно развивались СБ8 СТЬ-ответы на И-2-рестрикты [14]. Замена ИЬЛ а3-домена гомологичным доменом И-2 значительно улучшает распознавание и использование молекул ИЬЛ С1: в таких условиях мобилизуется разнообразный Т-клеточный репертуар Ур- и Уа-рецепторов у мышей, что позволяет более эффективно использовать молекулы ИЬЛ С1 [18].

Наиболее удачным для получения ИЬЛ-гуманизированных мышей оказалось создание моноцепочечной химерной конструкции, содержащей последовательности Р2-микроглобулина человека, а1- и а2-доменов ИЬЛ и И-2 мыши, кодирующей аЗ-домен, трансмембранную и ци-топлазматическую части: р2ш-ИЬЛ-И-2 (ИИБ). Такие мыши, созданные на основе животных с двойным нокаутом (И-2БЪ-/-Р2ш-/-), почти лишены молекул И-2 класса I (рис. 3). Фенотипический и функциональный анализ их периферического репертуара СБ8 Т-клеток показал, что химерный белок, продукт ИИБ для аллеля ИЬЛ-Л2.1, поддерживают тимусную положительную селекцию СБ8 СТЬ и активируют СТЬ ИЬЛ-Л2.1 вирус-специфических рестриктов на периферии [20]. Общий размер линейной генной конструкции ИИБ составлял 4 тыс. п. н. Ее человеческая часть содержала в себе промотор и первый экзон (кодирующий лидерную последовательность) ИЬЛ-Л2.1, кДНК Р2-микроглобулина человека и линкерную последовательность, 2-й экзон (а1) и ин-трон, 3-й экзон (а2-домен) и часть 3-го ин-трона ИЬЛ-Л2.1. Мышиная часть содержала часть 3-го интрона, 4-й экзон (аЗ-домен) и 5-8-й экзоны с интронами и 3'нетрансли-руемым регионом Н-2Б. Следует отметить,

Рис. 1. Схема плазмиды pCBH-b2m-A0201-h2k, полученной на основе плазмиды-вектора рсОМЛ3.4. Примечание: ДНК-последовательность CMV-промотора плазмиды рсОМЛ3.4 была заменена последовательностью CBH-промотора, амплифицированного с плазмиды pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9. Красными стрелками указаны сайты рестрикции для вырезания линейного фрагмента CBH-b2m_d0201-h2k.

Fig. 1. Map of pCBH-b2m-A0201-h2kplasmid derived from plasmid vectorpcDNA3.4.

Note: CMV promoter in plasmid pcDNA3.4 is replaced with promoter CBH from plasmidpX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9. Red arrows denote restriction sites flanking linear fragment CBH-b2m_A0201-h2k.

что в трансфецированной клеточной культуре ЯМА-лимфомы мыши уровень экспрессии химерного белка был выше, если в генной конструкции использовали Р2ш человека, а не мыши [20]. Этот эффект объясняется более эффективной ассоциацией цепи ЫЬА с Р2ш человека, чем с мышиным, что позволяет более быстро переносить молекулы ЫЬА из эндоплазматическо-

16

го ретикулума в аппарат Гольджи в клетках мышей, ко-трансфецированных ДНК HLA CI и ß2m человека или мыши [21].

ß2-микроглобулин в комплексе с антигенами MHC CI находится на мембранах всех ядросодержащих клеток организма, присутствует во всех его биологических жидкостях. В большом количестве белок представлен на лимфоцитах. Присутствие

СВН promoter ORF{b2m-A020l-h2k) ^ ТК PA terminator

Рис. 2. Схема линейного фрагмента frag CBH-b2m_A0201-h2k ДНК, предназначенной для микроинъекций. Примечание: линейный фрагмент содержит CBH-промотор, структурную часть гена b2m человека, соединенные глицин-сериновым линкером с а1-, а2-доменами молекулы HLA- А*02:01:01:01 и а3-доменом молекулы H-2K, посттрансляционный регуляторный элемент WPRE и сигнал полиаденилирования TK PA. Fig. 2. Map of linear fragment CBH-b2m_A0201-h2k used in microinjection.

Note: linear fragment contains CBH promoter, human b2m coding region tied by glycine-serine linker with HLA-A*02:01:01:01 a and a2 domains and H-2K a3 domain, posttranslational regulatory element WPRE and Poly (A) signal TK PA.

Таблица 2. Структура генной конструкции frag_CBH-b2m-A-0201-h2k (3181 п. н.) Table 2. Structure of frag_CBH-b2m-A-0201-h2k construct (3181 bp)

Фрагмент Размер, п. н. Описание

CBH-b2m-A0201-h2k 3181 генная конструкция

CBH 796 промотор

p2m человека 402

Экзон 1 67 в2-микроглобулин человека

Экзон 2 279

Экзон 3 (до ТАА) 11

Линкер (Гли4 Сер1) х3 45 линкер

Фрагмент HLA — А0201 540 фрагмент МНС I класса человека (домены а1, а2)

Фрагмент h2k 501 фрагмент МНС I класса мыши

mEx4 276 домен а3 Н-2К

mEx5 120 трансмембранный фрагмент белка

mEx6 33 цитозольный фрагмент белка

mEx7 39

mEx8 32 некодирующий экзон, нетраслируемая область

WPRE 676 посттрансляционный регуляторный элемент

TK-PA-terminator 271 сигнал полиаденилирования

Р2ш в сыворотке крови обусловлено процессами деградации и репарации клеток. Он необходим для экспрессии на клеточной поверхности белков МНС класса I и стабильности канавки связывания пептидов. В отсутствие р2-микроглобулина на поверхности клеток могут быть обнаружены очень ограниченные количества молекул МНС С1. В их отсутствие СБ8-Т-клетки, участвующие в форми-

ровании приобретенного иммунитета, не развиваются.

Полученная линия ННЭ-мышей в дальнейшем успешно использовалась в различных целях. Например, гибридную конструкцию ННБ использовали для оценки возможности молекул НЬЛ-Л2.1 опосредовать участие автореактивного ответа СБ8+ Т-клеток в развитии диабета типа 1 (ТШ): носители ряда генов МНС С1, вклю-

17

Рис. 3. Взаимодействие H LA CI (продукт гибридного типа) с распознающими рецепторами цито-токсичного Т-лимфоцита (CTL). При трансгенозе al- и а2-домены мышиного гена замещены соответствующими фрагментами гена HLA человека, а3 — замещен соответствующими фрагментами гена H-2K мыши, fî2m замещен соответствующим фрагментом микроглобулина человека, соединенным через линкер с HLA человека.

Примечание: АГ-РР — антиген, распознающий рецептор; fî2m — в ---микроглобулин; клетка-мишень — антиген-презентирующая клетка; Ly2,3 — мышиный эквивалент рецептора CD8 человека. Fig. 3. Interaction of HLA CI (chimeric) with cytotoxic T lymphocyte (CTL) specific receptors. In transgenosis, murine a and a2 domains are substituted by corresponding fragments of human HLA gene, a3 — by corresponding fragments of murine H-2K and fi2m — by corresponding human microglobulin sequence linker-tied with human HLA.

Note: АГ-РР — receptor-specific antigen; в2m — ftj-mi-croglobulin; клетка-мишень — antigen-presenting cell; Ly2,3,— murine homologue of human CD8 receptor.

чая HLA-A*0201 (HLA-A2.1), в сочетании с некоторыми молекулами МНС C2, имеют склонность к его развитию. T1D ускоряется у NOD-трансгенных мышей, экспресси-рующих тяжелую цепь HLA-A2.1. Линия NOD. mp2mnull hp2m.HLA-A2.1hyb оказалась востребована для изучения T1D [25]. Введение точечной мутации в одноцепо-

чечный тример HLA класса I индуцирует усиление прайминга CTL и противоопухолевого иммунитета.

Результатом использования созданной генной конструкции должны стать трансгенные мыши, экспрессирующие такой же химерный белок МНС CI ß2m-HLA-H-2 на поверхности клеток. Однако генные конструкции, созданные нами, имеют принципиальные отличия от зарубежных разработок [25]. Во-первых, мы использовали CBH-промотор, который обеспечивает устойчивую долгосрочную экспрессию во всех клетках, наблюдаемых при использовании традиционных сильных промоторов, — CMV (цитомегало-вирусный) или CBA (ß-актина цыпленка), включая проводящие нейроны [15]. Кроме того, была использована сигнальная последовательность полиаденилирования тими-динкиназы HSV. Во-вторых, в состав ГИК нами был внесен WPRE фрагмент (посттрансляционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка) — последовательность ДНК, которая при транскрибировании создает третичную структуру, усиливающую экспрессию гена [17]. «Белковая» часть, в отличие от прототипа, построена только из кДНК фрагментов МНС CI человека и мыши. При этом мы не включали в состав конструкции первый экзон, кодирующий последовательность лидерного пептида HLA, оставив последовательность сигнального пептида ß2-микроглобулина человека.

И созданная нами, и HHD генные конструкции предназначены для классического трансгенеза, т. е. все полученные трансгенные мыши будут отличаться как по сайту интеграции трансгена, по количеству его копий, так и по эффективности экспрессии химерного МНС CI. Есть основания предполагать, что структурные элементы, внесенные нами в генетическую конструкцию, позволят получить мышь с устойчивой высокой экспрессией хи-

мерного НЬЛ-Л*02:01. А использование технологии СЫ8РК/Са89 для нокаута гена Р2ш мыши приведет к полной элиминации молекул Н-2 у гуманизированной по НЬЛ С1 линии мышей.

Заключение

Развитие технологий гомологической рекомбинации, дизайна химерных ДНК-конструкций и новых подходов к редактированию генома, включая СЯ18РИ/Са89 и его модификаций, сделало возможным получение гуманизированных животных с точечными генетическими модификациями для решения конкретных биомедицинских проблем. Наряду с бурными успехами зарубежных генетиков и биотехнологов в этом направлении, в России крупнейшими центрами, где проводятся подобные исследования, являются НЦБМТ ФМБА России, Институт биологии гена РАН и Федеральный исследовательский центр Сибирского отделения РАН. Тем не менее число потребителей трансгенных и нокаутных мышей и крыс, закупаемых за рубежом для лабораторий нашей страны, неукоснительно растет. Их использование сдерживается продолжительностью транспортировки и карантинных процедур, зачастую невозможностью их последующего воспроизводства и предельно высокой стоимостью от 350 до 3750 долларов США за особь. Так, основным производителем и коммерческим поставщиком трансгенных и нокаутных мышей является американская фирма «Тасотс», которая имеет несколько производственных площадок как на территории США, так и в Европе. Однако, несмотря на лидерство в производстве трансгенных мышей, применение биомоделей «Тасотс» существенно ограничено по ряду причин, основными из которых являются:

а) цена и неопределённые сроки поставки (карантин и пр.);

б) в большинстве случаев отсутствует возможность заказа на мышей по возрасту

и весу, т. е. полученная когорта мышей будет неоднородной, что может исказить результаты исследований;

в) отличия в гаплотипе мышей.

Проведённые нами исследования показали несоответствие заявленного в литературе гаплотипа базовых мышей действительности: наша линия СБЛ/С57Б1/6У имеет гаплотип Н2-Кк/к. Развитие отечественных лабораторий по производству трансгенных и нокаутных мышей открывает широкие возможности для создания биомоделей, отвечающих задачам конкретного исследования, а отсутствие карантина позволяет получать мышей в существенно более короткий срок и значительно снижает их себестоимость.

На сегодняшний день питомники и виварии предлагают широкий спектр модельных животных. Однако далеко не всегда эти животные удовлетворяют запросам экспериментаторов, которым либо приходится подстраиваться под имеющиеся линии, либо тратить деньги, время на поиск и доставку более подходящих моделей. Основной нашей концепцией является направленный дизайн генетических конструкций на основе химерных ДНК генов человека и мыши для последующей интеграции в геном мыши с целью получения новой гуманизированной трансгенной линии, т. е. мы переходим от случайного выбора или поиска животных к созданию адекватных и оптимальных линий под конкретные эксперименты.

Одним из наиболее востребованных и активно развивающихся направлений исследований являются изыскания в области иммунологии. С каждым годом количество известных болезней увеличивается, что влечёт за собой необходимость дизайна и апробации новых лекарственных препаратов и вакцин, разработку эффективных схем терапии. Создание адекватных моделей, отвечающих задачам конкретного исследования, является ключевым

этапом на пути создания нового препарата или вакцины.

В этой статье рассмотрен процесс создания генно-инженерной конструкции, кодирующей гибридную молекулу МЫС I класса, состоящую из Р2-микроглобулина человека, а1-, а2-доменов ЫЬА человека и а3-домена мышиного комплекса Ы-2К. В данной работе впервые представлен дизайн молекулы, в составе которой находится человеческий Р2-микроглобулин. Полученный вектор включает в себя Р2-микроглобулин человека, а1-, а2-домены ЫЬА человека и а3-домен мышиного комплекса Ы-2К (рис. 3). Для получения линейных фрагментов, пригодных для микроинъекций в пронуклеусы зигот, вектор был подвергнут рестрикции эндо-нуклеазами с последующим разделением полученных фрагментов методом гель-электрофореза. Выделенный из геля готовый линейный фрагмент будет в дальнейшем использован для получения линии гуманизированных трансгенных мышей.

НЦБМТ ФМБА России систематически занимается созданием моделей для оценки социально-значимых болезней человека [1, 7, 9]. Особую значимость данная работа приобретает в связи с пандемией СОУГО-19, когда необходимость в адекватных и современных биомоделях для фармакологической оценки новых лекарств очень велика. Получаемая модель несёт специфический вариант ЫЬА, что позволит подробно изучить молекулярно-генетические механизмы воздействия лекарственных препаратов на русского человека. Использование модели предполагается для решения широкого круга задач, включая исследования

инфекционных заболеваний, разработку и тестирование вакцин, тестирование безопасности и иммуногенности, а также для исследований, направленных на изучение онкологических и аутоиммунных заболеваний. Модель позволяет идентифицировать эпитопы, ограниченные супертипом ЫЬА-А*02:01:01:01.

Возможность редактирования генома открывает перед нами огромные возможности по созданию и изучению модельных животных, отвечающих задачам исследования. Использование гуманизированных трансгенных мышей позволяет моделировать с высокой степенью достоверности различные заболевания и иммунодефи-цитные состояния человека, что является очень ценным при апробации новых подходов в лечении тех или иных заболеваний и экстраполяции результатов исследований на человека. Созданная генно-инженерная конструкция является первым шагом на пути создания первой в своём роде линии гуманизированных трансгенных мышей, отражающей специфические особенности генотипа, характерные для русского населения. Авторы дают себе отчёт, что определение русского человека достаточно условно и выбранная аллель присутствует во многих популяциях. Однако собственные изыскания в области ЫЬА-типирования позволяют утверждать, что аллель ЫЬА*А02:01:01:01 в наибольшей степени соответствует русскому человеку, что определяет актуальность и целесообразность создания линии трансгенных гуманизированых мышей, несущих данную аллель гена человека.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ | REFERENCES

1. Дуля М.С., Каркищенко В.Н., Хвостов Д.В., Агельдинов Р.А., Каркищенко Н.Н. Цитокиновый профиль лабораторных инбредных и трансгенных мышей в оценке иммунологического статуса и поиске новых фармакологических регуляторов. Биомедицина. 2019;15(2):54-62. [Dulya M.S.,

Karkischenko V.N., Khvostov D.V., Ageldinov R.A., Karkischenko N.N. Tsitokinovyy profil' labora-tornykh inbrednykh i transgennykh myshey v otsen-ke immunologicheskogo statusa i poiske novykh farmakologicheskikh regulyatorov [Cytokine Profile of Laboratory Inbred and Transgenic Mice in the

Evaluation of the Immunological Status and Search for New Pharmacological Regulators]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2019; 15(2):54-62. (In Russian)]. DOI: 10.33647/2074-5982-15-2-54-62.

2. Каркищенко В.Н., Болотских Л.А., Капанадзе Г.Д., Каркищенко Н.Н., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Матвеенко Е.Л., Петрова Н.В., Рябых В.П., Ревякин А.О., Станкова Н.В., Семенов Х.Х. Создание линий трансгенных животных-моделей с генами человека NAT1 и NAT2. Биомедицина. 2016;1:74-84. [Karkischenko V.N., Bolotskikh L.A., Kapanadze G.D., Karkischenko N.N., Koloskova E.M., Maksimenko S.V., Matveyenko E.L., Petrova N.V., Ryabykh V.P., Revyakin A.O., Stankova N.V., Seme-nov Kh.Kh. Sozdaniye liniy transgennykh zhivot-nykh-modeley s genami cheloveka NAT1 i NAT2 [Creation of lines of transgenic animal models with human genes NAT1 and NAT2]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2016;1:74-84. (In Russian)].

3. Каркищенко В.Н., Помыткин И.А., Скворцова В.И. Опиоидэргическая система иммунных клеток: новая фармакологическая мишень в терапии «цитоки-нового шторма». Биомедицина. 2020;16(4): 14-23. [Karkischenko V.N., Pomytkin I.A., Skvortsova V.I. Opioidergicheskaya sistema immunnykh kletok: no-vaya farmakologicheskaya mishen' v terapii «tsi-tokinovogo shtorma» [The Opioidergic System of Immune Cells: A New Pharmacological Target in the Therapy of "Cytokine Storm"]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2020;16(4):14-23. (In Russian)]. DOI: 10.33647/2074-5982-16-4-14-23.

4. Каркищенко В.Н., Рябых В.П., Болотских Л.А., Семенов Х.Х., Капанадзе Г.Д., Петрова Н.В., Езерский В.А., Жукова О.Б., Колоскова Е.М., Максименко С.В., Столярова В.Н., Трубицына Т.П. Физиолого-эмбриологические аспекты создания трансгенных мышей с интегрированными генами NAT1 и NAT2 человека. Биомедицина. 2016;1:52-65. [Karkischenko V.N., Ryabykh V.P., Bolotskikh L.A., Semenov Kh.Kh., Kapanadze G.D., Petrova N.V., Ezerskiy V.A., Zhukova O.B., Koloskova E.M., Maksimenko S.V., Stolyarova V.N., Trubitsyna T.P. Fiziologo-embriologicheskiye aspekty sozdaniya transgennykh myshey s integrirovannymi genami NAT1 i NAT2 cheloveka [Physiological and embryo-logical aspects of creating transgenic mice with integrated human NAT1 and NAT2 genes]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2016;1:52-65. (In Russian)].

5. Каркищенко В.Н., Рябых В.П., Каркищен-ко Н.Н., Дуля М.С., Езерский В. А., Колоскова Е.М., Лазарев В.Н., Максименко С.В., Петрова Н.В., Столярова В.Н., Трубицына Т.П. Молекулярно-генетические аспекты технологии получения трансгенных мышей с интегрированными генами N-ацетилтрансферазы (NAT1 и NAT2) человека. Биомедицина. 2016;1:4-17. [Karkischenko V.N., Ryabykh V.P., Karkischenko N.N., Dulya M.S.,

Ezerskiy V.A., Koloskova E.M., Lazarev V.N., Maksimenko S.V., Petrova N.V., Stolyarova V.N., Trubitsyna T.P. Molekulyarno-geneticheskie aspekty tekhnologii polucheniya transgennykh myshej s in-tegrirovannymi genami N-atsetiltransferazy (NAT1 i NAT2) cheloveka [Molecular and genetic aspects of the technology for producing transgenic mice with integrated genes of human N-acetyltransferase (NAT1 and NAT2)]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2016;1:4-17. (In Russian)].

6. Каркищенко Н.Н. Альтернативы биомедицины. Т. 2. Классика и альтернативы фармакотоксиколо-гии. М.: Изд-во ВПК, 2007:448. [Karkischenko N.N. Al'ternativy biomeditsiny. T. 2. Klassika i al'terna-tivy farmakotoksikologii [Biomedicine alternatives. Vol. 2. Classics and alternatives ofpharmacotoxicology]. Moscow: Izdatel'stvo VPK, 2007:448. (In Russian)].

7. Каркищенко Н.Н., Петрова Н.В., Слободенюк В.В. Высокоспецифичные видовые праймеры к генам Nat1 и Nat2 для сравнительных исследований у человека и лабораторных животных. Биомедицина. 2014;1(2):4-24. [Karkischenko N.N., Petrova N.V., Slobodenyuk V.V. Vysokospetsifichnye vidovye prajmery k genam Nat1 i Nat2 dlya sravnitel'nykh issledovanij u cheloveka i laboratornykh zhivotnykh [Highly specific species primers for the Nat1 and Nat2 genes for comparative studies in humans and laboratory animals]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2014;1(2):4-24. (In Russian)].

8. Каркищенко Н.Н., Рябых В.П., Каркищенко В.Н., Колоскова Е.М. Создание гуманизированных мышей для фармакотоксикологических исследований (успехи, неудачи и перспективы). Биомедицина. 2014;1(3):4-22. [Karkischenko N.N., Ryabykh V.P., Karkischenko V.N., Koloskova E.M. Sozdanie guman-izirovannykh myshey dlya farmakotoksikologicheskikh issledovaniy (uspekhi, neudachi i perspektivy) [Creation of humanized mice for pharmacotoxicological research (successes, failures and prospects)]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2014;1(3):4-22. (In Russian)].

9. Помыткин И.А., Каркищенко В.Н., Фокин Ю.В., Нестеров М.С., Петрова Н.В. Модель фатального острого поражения легких и острого респираторного дистресс-синдрома. Биомедицина. 2020;16(4):24-33. [Pomytkin I.A., Karkischenko V.N., Fokin Yu.V., Nesterov M.S., Petrova N.V. Model' fa-tal'nogo ostrogo porazheniya legkikh i ostrogo respi-ratornogo distress-sindroma [A Model of Fatal Acute Lung Injury and Acute Respiratory Distress Syndrome]. Biomeditsina [Journal Biomed]. 2020;16(4):24-33. (In Russian)]. DOI: 10.33647/2074-5982-16-4-24-33.

10. Ali M.K., Shah D.J., del Rio C. Preparing Primary Care for COVID-20. J. Gen Intern. Med. 2020. DOI: 10.1007/s11606-020-05945-5.

11. Arnold B., Hammerling G.J. MHC class-I transgenic mice. Annu. Rev. Immunol. 1991;9:297-322. DOI: 10.1146/annurev.iy. 09.040191.001501.

12. Cohen J. The Coronavirus may sometimes slip its genetic material into human chromosomes — but what does that mean? Science. 2020. D01:10.1126/science. abg2000.

13. de Abreu M.S., Giacomini A.C.V., Genario R., Dos Santos B.E., da Rosa L.G., Demin K.A., et al. Neuropharmacology, pharmacogenetics and phar-macogenomics of aggression: The zebrafish model. Pharmacol. Res. 2019;141:602-608. DOI: 10.1016/j. phrs.2019.01.044.

14. Engelhard V.H., Lacy E., Ridge J.P. Influenza A-specific, HLA-A2.1 restricted cytotoxic T lymphocytes from HLA-A2.1 transgenic mice recognize fragments of the M1 protein. J. Immunol. 1991;146:1226-1232.

15. Gray S.J., Foti S.B., Schwartz J.W., Bachaboina L., Taylor-Blake B., Coleman J., et al. Optimizing promoters for recombinant adeno-associated virus-mediated gene expression in the peripheral and central nervous system using self-complementary vectors. Hum. Gene Ther. 2011;22(9): 1143-1153. DOI: 10.1089/ hum.2010.245.

16. Kuri-Cervantes L., Pampena M.B., Meng W., Rosenfeld A.M., Ittner C.A.G., Weisman A.R., et al. Comprehensive mapping of immune perturbations associated with severe COVID-19. Sci. Immunol. 2020;5(49):eabd7114. DOI: 10.1126/sciimmunol.abd7114.

17. Lee Y.B., Glover C.P., Cosgrave A.S., Bienemann A., Uney J.B. Optimizing regulatable gene expression using adenoviral vectors. Exp. Physiol. 2005;90(1):33-37. DOI: 10.1113/expphysiol.2004.028209.

18. Man S., Ridge J.P., Engelhard V.H. Diversity and dominance among TCR recognizing HLA-A2.1+ influenza matrix peptide in human MHC class I transgenic mice. J. Immunol. 1994;153(10):4458-4467.

19. Marshall S., Madabushi R., Manolis E., Krudys K., Staab A., Dykstra K., et al. Model-Informed Drug

Discovery and Development: Current Industry Good Practice and Regulatory Expectations and Future Perspectives. CPTPharmacometrics Syst. Pharmacol. 2019;8(2):87-96. DOI: 10.1002/psp4.12372.

20. Pascolo S., Bervas N., Ure J.M., Smith A.G., Lemonnier F.A., Perarnau B. HLA-A2.1-restricted education and cytolytic activity of CD8(+) T lymphocytes from beta2 microglobulin (beta2m) HLA-A2.1 monochain transgenic H-2Db beta2m double knockout mice. J. Exp. Med. 1997;185(12):2043-2051. DOI: 10.1084/jem.185.12.2043.

21. Perarnau B., Gillet A., Hakem R., Barad M., Lemonnier F.A. Human _2-microglobulin specifically enhances cell surface expression of HLA class I molecules in transfected murine cells. J. Immunol. 1988;141:1383-1389.

22. Phan V.H., Moore M.M., McLachlan A. J., Piquette-Miller M., Xu H., Clarke S.J. Ethnic differences in drug metabolism and toxicity from chemotherapy. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 2009;5(3):243-257. DOI: 10.1517/17425250902800153.

23. Pooladanda V., Thatikonda S., Godugu C. The current understanding and potential therapeutic options to combat COVID-19. Life Sci. 2020;254:117765.

24. Sontoredjo T.A., de Boer A., Maitland-van der Zee A.H. Etnische farmacogenetica [Ethnicity in pharmacogenetics]. Ned Tijdschr Geneeskd. 2013;157(17):A6118.

25. Takaki T., Marron M.P., Mathews C.E., Guttmann S.T., Bottino R., Trucco M., et al. HLA-A*0201-Restricted T Cells from Humanized NOD Mice Recognize Autoantigens of Potential Clinical Relevance to Type 1 Diabetes. J. Immunol. 2006;176:3257-3265.

26. Zhang L., Richards A., Khalil A., Wogram E., Ma H., Young R.A., et al. SARS-CoV-2 RNA reverse-transcribed and integrated into the human genome. bioRxiv. The preprint server for biology. 2020. DOI: 10.1101/2020.12.12.422516.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ | INFORMATION ABOUT THE AUTHORS

Каркищенко Владислав Николаевич, д.м.н., проф., ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: scbmt@yandex.ru

Петрова Наталья Владимировна*, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: m-sklad@yandex.ru

Савченко Елена Сергеевна, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»;

e-mail: savelaine@gmail.com

Vladislav N. Karkischenko, Dr. Sci. (Med.), Prof., Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: scbmt@yandex.ru

Nataliya V. Petrova*, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: m-sklad@yandex.ru

Elena S. Savchenko, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: savelaine@gmail.com

Огнева Настасья Сергеевна, ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: ognevanastya@mail.ru

Колоскова Елена Михайловна, к.б.н., Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных — филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ им. акад. Л.К. Эрнста»;

e-mail: heleko3@yandex.ru

Максименко Сергей Васильевич, к.б.н., ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России»; e-mail: vx136@rambler. ru

Манувера Валентин Александрович, к.б.н., ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины ФМБА России»;

e-mail: vmanuvera@yandex.ru

Бобровский Павел Александрович, ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины ФМБА России»; e-mail: pbobrovskiy@gmail.com

Лазарев Василий Николаевич, д.б.н., доц., ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины ФМБА России»;

e-mail: lazar0@mail.ru

Nastasya S. Ogneva, Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: ognevanastya@mail.ru

Elena M. Koloskova, Cand. Sci. (Biol.), All-Russian Research Institute of Physiology, Biochemistry and Animal Nutrition — branch of the Federal Scientific Centre of Animal Husbandry — All-Russian Institute of Animal Husbandry named after acad. L.K. Ernst; e-mail: heleko3@yandex.ru

Sergey V. Maksimenko, Cand. Sci. (Biol.), Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: vx136@rambler. ru

Valentin A. Manuvera, Cand. Sci. (Biol.), Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: vmanuvera@yandex.ru

Pavel A. Bobrovsky, Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: pbobrovskiy@gmail.com

Vassili N. Lazarev, Dr. Sci. (Biol.), Assoc. Prof., Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: lazar0@mail.ru

* Автор, ответственный за переписку / Corresponding author