CC BY
15
HOBI ТЕХНОЛОГИ 31СТАВЛЕННЯ ТКАНИН, ШОВН1 МАТЕР1АЛИ, 1МПЛАНТАТИ
УДК 616.71-001.5-089.843:615.464.03:669.9
ПРИМЕНЕНИЯ ЗПР ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПРОЦЕССОВ АССИМИЛЯЦИИ ИМПЛАНТАТОВ ЖИВОЙ КОСТНОЙ ТКАНЬЮ*
Брик A.B., Дубок В.А., Розенфельд Л.Г., Клименко А.П., Калиниченко A.M.
Институт геохимии, минералогии и рудообразования HAH Украины, Институт проблем материаловедения HAH Украины, Научный центр радиационной медицины АМН Украины, Киевский национальный университет технологий и дизайна, г. Киев
Изучены процессы ассимиляции минеральной материи имплантатов (изготовленных на основе синтетического гидроксилапатита) костной тканью экспериментальных животных. Исследования выполнены методом электронного парамагнитного резонанса. Показано, что информация о процессах ассимиляции имплантатов костной тканью может быть получена с помощью на-тивных радикалов Rn , локализованных в органических молекулах, а также радикалов С02-, локализованных на поверхности частиц гидроксилапатита. Проанализированы возможности изучения процессов ассимиляции имплантатов костной тканью с помощью специальных парамагнитных маркеров, которые могут быть введены в структуру гидроксилапатита в позиции кальция или фосфора.
Ключевыеслова: кость, имплантаты, процессы ассимиляции, гидроксилапатит, электронный парамагнитный резонанс.
Во время пребывания имплантата в костной ткани с гидроксилапатитом имплантата происходят существенные изменения. В конечном счете, в месте расположения имплантата появляется минерализованная биологическая ткань. Изучение имплантатов, извлеченных из костей экспериментальных животных через различные интервалы времени, позволяет судить о механизмах взаимодействия неживой минеральной материи имплантата с органическими веществами костной ткани.
Целью настоящей работы является разработка новых подходов для получения информации о процессах ассимиляции имплантатов, помещенных в кости экспериментальных животных. На основании данных, полученных методом электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), сделаны выводы о процессах ассимиляции минеральной материи имплантата живой костной тканью.
Введение
Изучению свойств костной ткани, а также процессов ассимиляции имплантатов, помещенных в живую кость, посвящено большое количество работ [1-6,11,13,14]. Однако, несмотря на большой объем полученной информации, эта сложная и многоплановая проблема изучена недостаточно. Описанные в литературе исследования процессов ассимиляции имплантатов костной тканью выполнены в основном на уровне клеток и биологически активных веществ [2,11,14]. Для дальнейшего прогресса в этой области требуется разработка новых подходов, основанных на новых идеях и принципах. При этом особенно важно разработать методы получения информации о процессах в органической и минеральной материи высокоминерализованных тканей, которые протекают на уровне свободных радикалов и наноразмерных подсистем.
Известно, что минеральная компонента костной ткани представлена в основном гидроксилапатитом, который является составной частью живой костной ткани. Однако гидроксилапатит в имплантате, помещенном в костную ткань экспериментального животного, представляет собой вначале минеральную (неживую) материю.
Материалы и методы
Исследованные имплантаты представляли собой гранулы синтетического гидроксилапатита (размер гранул 0.8 * 1.2 мм, пористость « 80% ) и керамические блоки (пористость 52% ). Синтетический гидроксилапатит, был получен с по-
* Робота выполнена в рамках темы 16.01.04 ДБ (номер госрегистрации 010би000892), которая финансируется Министерством образования и науки Украины.
мощью технологии так называемого "мокрого синтеза" [13]. В качестве подопытных животных использовались кролики. Имплантаты были введены в берцовые кости животных и находились там на протяжении от нескольких дней до нескольких месяцев.
Исходные материалы, а также имплантаты, извлеченные из костей животных, были исследованы методом ЭПР. Для регистрации спектров ЭПР был использован спектрометр БРЭ-231 (Германия), который работает в трехсантиметровом диапазоне длин волн. Запись спектров была проведена при комнатной температуре. Для регистрации спектров ЭПР от радикалов С02- образцы были подвергнуты гамма облучению от источника 60Со дозой 1.5 105 Грей.
Результаты и их обсуждение
В имплантатах, извлеченных из костей экспериментальных животных, нами зарегистрированы сигналы ЭПР от так называемых нативных радикалов Интенсивности этих сигналов мы будем обозначать как !п . Известно, что радикалы Г^п образуются в процессе жизнедеятельности биологического объекта [12] и локализованы в органическом веществе, проникшем в имплан-тат или содержащемся в органической матрице костной ткани [2].
В исходных материалах имплантатов сигналы ЭПР нативных радикалов заведомо отсутствуют, поскольку исходные материалы имплантатов не содержат органических веществ. Зависимости интенсивности сигнала 1п от времени пребывания имплантата в организме животного t для разных типов имплантатов приведены на рис. 1. При времени t, равном 15 -20 дням, интенсивность 1п максимальна. При дальнейшем увеличении t количество радикалов Нп в материале имплантата уменьшается. В костной ткани интенсивность сигналов 1п равна примерно 0,3 относительных единицы. Соответственно (рис. 1) интенсивность сигналов 1п в материале имплантата намного превышает интенсивность соответствующего сигнала в костной ткани. Вместе с тем, количество органического вещества в имплантате меньше, чем в костной ткани. Таким образом, концентрация нативных радикалов в органическом веществе, проникшем в материал имплантата, намного превышает концентрацию нативных радикалов в костной ткани.
Согласно рис. 1, интенсивность сигнала ЭПР нативных радикалов зависит не только от характеристик материала имплантата. В имплантате из гранул величина 1п намного больше чем в керамических блоках. Фактор спектроскопического расщепления (д-фактор) для нативных радикалов в материале имплантатов равен примерно 2.0045 ± 0.0025, а ширина сигнала ЭПР находится в интервале 0,8-0,12 мТл.
Во всех образцах костей после их облучения рентгеновскими или гамма лучами удается зарегистрировать сигналы ЭПР, обусловленные
радикалами С02-. Радикалы С02" образуются при облучении из С02 молекул, локализованных на поверхности нанокристаллов биоапатита, а также из карбоксильных групп аминокислот, ассоциированных с минеральной материей биоминералов [7-11]. В исходных материалах имплантатов облучение не продуцирует С02- радикалы. Вместе с тем, после пребывания имплантатов в костях животного облучение образцов продуцирует в них С02- радикалы. Соответственно во всех имплантатах, извлеченных из костей животных, после их облучения удается зарегистрировать сигналы ЭПР от радикалов С02-. По мере увеличения времени пребывания имплантата в организме животного интенсивность сигналов ЭПР !сагЬ , которые обусловлены радикалами С02-, возрастает (рис. 2). Зависимости интенсивностей !сагЬ от времени t являются нелинейными. На кривых, представленных на рис. 2, можно выделить два участка. На первом участке (примерно до 20 дней) скорость увеличения количества радикалов С02- является относительно большой, а на втором участке (более 20 дней) эта скорость замедляется. Как видно на рис. 2, количество С02- радикалов в материале имплантата зависит не только от времени t , но и от характеристик материала имплантата. Сигналы ЭПР в имплантатах из гранул более интенсивны чем имплататах из керамических блоков (рис.2). , а наиболее слабые — в плотной керамике. Зависимости, представленные на рис.2, показывают, что для использованных нами временных интервалов выдержки имплантатов в кости процессы формирования радикалов С02- еще далеки от насыщения. Этот вывод подтверждается также тем фактом, что сигналы ЭПР от радикалов С02- в костной ткани, примерно, в два раза интенсивнее, чем максимальные сигналы ЭПР в материалах имплантатов. Нами установлено, что спектроскопические и динамические характеристики С02- радикалов в материалах имплантатов подобны соответствующим характеристикам С02- радикалов в костной ткани. Перпендикулярная и параллельная компоненты д-тензора для радикалов С02- в имплантатах равны д± = 2.0020 + 0.0005, дц =1.9970+ 0.0005.
Имплантат, помещенный в кость, первоначально представляет собой чисто минеральную (неживую) материю. Однако в результате био-стимулированных процессов на месте имплантата в конечном счете формируется живая костная ткань, т. е. неживая минеральная материя имплантата преобразуется в минерально-органическую биологическую материю. Полученные нами данные позволяют судить о процессах преобразования минеральной материи имплантата в минерализованную биологическую ткань.
Из экспериментальных данных, представленных на рис. 1, следует, что органические вещества, проникающие в материал имплантата, со-
Том 7, Выпуск 1-2
263
держат аномально высокие концентрации на-тивных радикалов. В работах [8,12] описаны три механизма образования свободных радикалов в органической матрице костной ткани: клеточный, биоокислительный и радиационно стимулированный. Если предположить, что исследованные нами радикалы Нп образованы благодаря клеточному механизму, то экспериментальные результаты, представленные на рис. 1, можно проинтерпретировать следующим образом. Клетки, которые появляются на поверхности и внутри имплантата, продуцируют в материале имплантата органические вещества с большим количеством неспаренных электронов. Такие органические вещества с большим количеством радикалов Нп мы будем называть "активным коллагеном". На основании экспериментальных данных (рис. 1) можно предположить, что наиболее «активный коллаген» клетки продуцируют в первый период (15-20 дней) пребы-
Рис. 1. Зависимости интенсивностей сигналов ЭПР 1п, обусловленных нативными радикалами, от количества дней пребывания имплантата в кости животного. Кривые 1 и 2 соответствуют гранулам и керамическим блокам.
20 40 60 80 100 120
Рис. 2. Зависимости интенсивностей сигналов ЭПР 1сагъ, обусловленных СОг радикалами, от количества дней пребывания имплантата в кости животного. Кривые 1 и 2 соответствуют гранулам и керамическим блокам.
«Активный коллаген» проникает в поры имплантата и его количество в материале имплан-
тата вначале быстро увеличивается (рис. 1). "Активный коллаген" вступает в химическую связь с поверхностью гидроксилапатита, что ведет к уменьшению количества свободных радикалов в органическом веществе, которое находится внутри имплантата. Конкуренция двух процессов - увеличение количества коллагена в материале имплантата и уменьшение его активности (за счет связывания свободных радикалов с поверхностью гидроксилапатита) обуславливает наличие экстремума на кривых, представленных на рис. 1. Следует отметить, что по мере уменьшения количества свободных радикалов, образованных с помощью клеточного механизма, в материале имплантата может увеличиваться количество свободных радикалов, образованных в результате биоокислительного механизма. В зрелой нативной костной ткани доминируют свободные радикалы, образованные за счет биоокислительного механизма, а количество свободных радикалов, образованных по клеточному механизму, очевидно, невелико и связано с постоянными процессами ремодели-рования костной ткани.
Эффективность процессов формирования единой органо-минеральной системы (или сродство материала имплантата к костной ткани) существенно зависит от свойств имплантата. Эти свойства можно варьировать в широких пределах в зависимости от особенностей технологии синтеза и последующей обработки материала имплантата. Скорость ассимиляции имплантата костной тканью существенно зависит от адсорбционных характеристик поверхности частиц имплантата и от примесных кристаллических фаз в материале имплантата. Поскольку различные характеристики импланта-тов, а также сродство материала имплантата к костной ткани могут быть изучены с помощью ЭПР, то этот метод может быть использован как для формулирования научно обоснованных требований к материалу имплантатов, так и для контроля технологий изготовления имплантатов.
Кроме нативных радикалов Нп , процессы взаимодействия молекул коллагена с поверхностью гидроксилапатита могут быть исследованы с помощью радикалов С02-. Начальный участок на кривых, представленных на рис. 2 (на котором скорость образования радикалов С02- максимальна) и начальный участок на кривых, представленных на рис. 1 (на котором имеет место рост количества радикалов Яп) соответствуют одним и тем же интервалам времени пребывания имплантата в организме животного (1520 дней). Этот факт указывает, что формирование нативных радикалов Нп и предцентров карбонатных радикалов С02- является отражением взаимосвязанных биостимулированных процессов в материале имплантата. Вместе с тем, на-тивные радикалы Нп и карбонатные радикалы С02- имеют различную природу и локализованы в различных подсистемах костной ткани, поэто-
му с помощью этих двух типов радикалов процессы ассимиляциии имплантатов костной тканью можно изучать независимо.
Наличие нескольких участков, соответствующих разной скорости формирования С02- радикалов (рис. 2), а также наличие экстремума на кривых зависимости количества радикалов Нп от времени t (рис. 1) указывает на то, что процессы ассимиляции материала имплантата костной тканью можно разделить на несколько этапов. На первом этапе (15-20 дней) происходит описанное выше соединение коллагена с поверхностью частиц гидроксилапатита. На втором этапе (более 20 дней) происходит медленная резорбция апатита и формирование минерально-органической материи. Поскольку молекулы коллагена обладают мощным электрическим дипольным моментом, то электрическое поле этого дипольного момента оказывает существенное влияние на процессы резорбции гидроксилапатита. Электрическое поле молекул коллагена стимулирует перераспределение в пространстве слабосвязанных ионов. Перераспределение в пространстве положительных и отрицательных ионов ведет к локальному изменению рН среды, стимулирует локальное растворение гидроксилапатита и способствует проникновению протеинов в материал имплантата.
Использование имплантатов с парамагнитными маркерами, которые могут быть введены в структуру гидроксилапатита при синтезе, открывает возможность для экспериментального изучения различных схем резорбции имплантатов. К таким парамагнитным маркерам, которые могут быть зарегистрированы методом ЭПР, относятся ионы Мп2+, локализованные в позициях ионов Са2+, а также карбонатные ионы С032-, которые локализуются в позициях фосфорных тетраэдров структуры гидроксилапатита. Специфика ионов Мп2+ состоит в том, что они легко входят в структуру синтетического и природного апатита, однако полностью отсутствуют в биогенном гидроксилапатите. Карбонатные ионы С032- могут быть заранее переведены облучением в парамагнитное состояние С033-, что позволяет изучать динамику карбонатного вещества в материале имплантата. Определение с помощью метода ЭПР механизмов резорбции имплантатов и процессов формирования регенерата костной ткани открывает возможности для создания имплантатов с разными свойствами, ориентированными на лечение конкретных заболеваний костной ткани.
Заключение
Представленные в данной статье результаты показывают, что процессы ассимиляции материала имплантата костной тканью могут быть эффективно изучены с помощью метода ЭПР. Данные метода ЭПР описывают процессы в костной ткани на уровне свободных радикалов и наноразмерных подсистем. Для получения пол-
ной картины процессов, обусловленных введением в кость имплантатов, важно иметь информацию на разных уровнях, от уровня свободных радикалов и наноразмерных систем до уровня кости как органа. Поэтому исследования, выполняемые методом ЭПР, следует проводить в комплексе с традиционными методами и подходами.
Важность разработанных в данной статье подходов обусловлена не только тем, что процессы в высокоминерализованных тканях на уровне свободных радикалов и наноразмерных подсистем изучены слабо, но и тем, что разработанные подходы эффективны для выяснения механизмов взаимодействия органической и минеральной материи в высоко минерализованных биологических тканях.
Поскольку наноразмерные подсистемы костной ткани относительно просты, то процессы в высокоминерализованных биологических тканях на уровне наноразмерных подсистем могут быть описаны с помощью строгих физико-химических моделей. При этом влияние биологически активных веществ, клеток и других подсистем можно свести к внешним условиям, в которых находятся наноразмерные частицы. Причем эти внешние условия могут быть выражены в терминах, которые удобны для использования в рамках физико-химических моделей (электрические потенциалы, величины потенциальных барьеров, концентрации и подвижности примесных ионов, локальная величина pH среды и т.д.)
Описанные в данной статье результаты показывают, что исследования методом ЭПР натив-ных радикалов Rn и карбонатных радикалов CO2-, предоставляют уникальные возможности для изучения механизмов взаимодействия органической и минеральной материи в высокоминерализованных тканях, а также процессов ассимиляции материала имплантатов костной тканью.
Литература
1. БрикА.Б., Подрушняк Е.П.. Иванченко Л.А., Калиниченко A.M., Багмут H.H. О механизмах ассимиляции резорби-руемых имплантатов костной иканью по данным электронного парамагнитного резонанса// Ортопедия, травматология и протезирование. - 2001. - № 2. - С. 23 - 27.
2. Механизмы регенерации костной ткани. /Сборник статей. Составители A.M.Белоус, Е.Я.Панков. - M.: Медицина, 1972.
3. Прохончуков A.A., Жижина H.A., Тигранян P.A. Гомеостаз костной ткани в норме и при экстремальном воздействии. — М.: Наука, 1984. — 201 с.
4. Розенфельд Л.Г., Брик А.Б. Минералы биологического происхождения: формирование структуры и свойств // Врачебноедело. - 1992. - № 8. - С. 3 -9.
5. Розенфельд Л.Г., Брик О.Б.. Атаманенко O.M. ДемЫера-л1зац1я KicTOK при косм1чних польотах: HOBi пщходи до ви-вчення проблеми // Журнал АМН Украши. -1999. - Т.5, № 2. - С.220-233.
6. Brik A.B., Brik V.B. Mechanisms of diffusion in biominerals and bone demineralization during space flights // Mineralogi-cal Journal. - 1998. - V. 20, No 5. - P. 46-61.
7. Brik A., Brik V. Biominerals as mineral-organic nano-associated systems. //Proceedings of International
Tom 7, Выпуск 1-2
265
10.
Conferenbce " Mineralogy and Life", Syktyvkar (Russia): Geoprint, 2000. - P.203-205
Brik A.B., Kenner G.H. Atamanenko O.N., et al. Formation 11. mechanisms and dynamic characteristics of free radicals of biominerals as deduced from EPR spectroscopy. //Mineralogical Journal. - 2001. V.23, № 4. - P.44 - 55. 12.
Brik A., Kenner G., Brik V., EPR of impurity crystal phases in biominerals and their synthetic analogues. //Mineralogical 13 Journal (Ukraine). - V.23, №1. - P.23- 37, 2001. Brik A.B., Rosenfeld L.G., Haskell E.H., Kenner G.H., Brik 14. V.B. Formation mechanisms and localization places of CO2-
radicals in tooth enamel // Mineralogical Journal. - 2000. -V. 22, №5/6. - P. 57-67.
Glimcher M.J. A basic architectural principle in the organization of mineralized tissue// Clinical Ortopaedics and Related research. - 1968. - №61. - P.16-36.
Knight J.A. Free Radicals, Antioxidants, Aging and Disease. - Washington, DC: AACC Press, 1999. Kanazava T. Inorganic phosphate materials. - Elsevier, Amsterdam, 1989.
Neuman W.F., Neuman M.W. The chemical dynamics of bone mineral. - The University of Chicago Press, 1958.
Реферат
ВИКОРОИСТАННЯ ЕПРДЛЯ ВИВЧЕННЯ ПРОЦЕС1В АСИМ1ЛЯЦ11 1МПЛАНТАТ1В ЖИВОЮ К1СТКОВОЮ ТКАНИНОЮ БркА.Б., Дубок В.А., РозенфельдЛ.Г., Кл1менкоА.П., Кал1н1ченкоА.М.
Ключов1 слова: : кютка, ¡мплантати, процеси асимтяцп, гщроксилапатит, електроний парамагнггний резонанс.
Вивчеы процеси асимтяцп мЫеральноТ матери ¡мпланталв (виготовлених на основ! синтетичного гщроксилапатита) кютковою тканиною експериментальних тварин. Дослщження виконаы методом електронного парамап-лтного резонансу. Показано, що ¡нформац1я про процеси асимтяцм ¡мплантат1в кютковою тканиною може бути отримана за допомогою нативних рад1кал1в Rn, локал1зованих в орган1чних молекулах, а також радикал1в С02-, локал1зованих на поверхн1 частинок г1дроксилапатиту. Проаналн зован1 можливосл вивчення процес1в асимтяцп ¡мплантат1в кютковою тканиною за допомогою спец1альних парамап-лтних мар-кер1в, як1 можуть бути введен! у структуру гщроксилапатиту в позицп кальц1ю або фосфору.
9
УДК 616-006.6-089.85
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ СВАРКИ ТКАНЕЙ ПРИ ОБРАБОТКЕ КУЛЬТИ ЧЕРВЕОБРАЗНОГО ОТРОСТКА
Гринцов А. Г., Совпель О.В., Христуленко A.A., Касаев C.B., Шаповалова Ю.А.
Донецкий государственный медицинский университет им. М.Горького Центральная городская клиническая больница №1, г. Донецк
Целью работы было изучение эффективности клинического применения генератора автоматической сварки мягких тканей при аппендэктомии. В исследование включены 29 больных. Изучены непосредственные и отдаленные результаты лечения. Установлено, что выполнение аппендэктомии с применением биологической сварки тканей сопровождается надежным перекрытием просвета основания червеобразного отростка в асептических условия, не увеличивая удельный вес послеоперационных осложнений и летальности, позволяет улучшить качество жизни больного после операции, морфологические исследования демонстрируют эффективность, надежность и безопасность накладываемого электротермического шва.
Ключевые слова: аппендэктомия, послеоперационные осложнения, биологическая сварка тканей.
ческих вмешательств в большинстве кпиниче-
Актуальность проблемы Несмотря на пристальное внимание к проблеме острого аппендицита, осложнения после аппендэктомии наблюдаются в 2-3% случаев [3]. Общепринятая методика аппендэктомии, которая заключается в лапаротомии, выведении червеобразного отростка с брыжейкой в операционную рану, перевязке брыжейки червеобразного отростка шелковой лигатурой, перевязку основания отростка кетгутовой лигатурой, отсечении отростка, погружении культи отростка в стенку слепой кишки кисетным и 2-образным швами за последние десятилетия не претерпела изменений, однако она однозначно не гарантирует отсутствие возможных осложнений [1]. Казалось бы, несмотря на незначительность осложнений по отношению к общему количеству аппендэктомий, усовершенствовать методику не имеет смысла, но использование биологической сварки мягких тканей сводит процент осложнений к минимуму [2].
Высокочастотная электрохирургия принадлежит к тем медицинским технологиям, без которых сегодня не возможно выполнение хирурги-
ских специальностей, таких как общая хирургия, проктология, онкология, гастроэнтерология, гинекология и многие другие. Благодаря разработкам коллектива сотрудников Института электросварки им. Е.О.Патона НАН Украины по инициативе академика Б.Е.Патона появилась возможность применения высокочастотного электротока для соединения мягких тканей [4]. Разработанный высокочастотный генератор ЭК-300М1 и набор специализированного инструментария позволяет производить сварку тканей на основе дозированной подачи модулированного тока, автоматически генерируемого в зависимости от конкретного тканевого импеданса.
Цель работы. Изучение эффективности клинического применения генератора автоматической сварки мягких тканей при выполнении аппендэктомии.
Материалы и методы исследования
В исследование включены 64 больных, которым в клинике хирургических болезней стоматологического факультета на базе хирургического отделения ЦГКБ № 1 г. Донецка выполнены
