CC BY
107
ХИМИЯ
Вестн. Ом. ун-та. 2010. № 2. С. 106-112.
УДК 549.02, 543.621
С.А. Лемешева, О.А. Голованова
Омский государственный университет им. Ф. М. Достоевского
И.В. Муромцев
Институт проблем переработки углеводородов СО РАН
С. В. Туренков
ЗГГУЗОО Клинический медико-хирургический центр Министерства здравоохранения
СОСТАВ И СТРУКТУРА КОСТНЫХ ТКАНЕЙ ЧЕЛОВЕКА КАК ОТРАЖЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ПАТОГЕННОЙ МИНЕРАЛИЗАЦИИ ПРИ КОКСАРТРОЗЕ
Приведены результаты исследования костной ткани человека методами рентгенофазового анализа, ИК-спектроскопии, термического анализа, электронного парамагнитного резонанса. Показано, что процессы, протекающие в костной ткани при кок-сартрозе, характеризуются уменьшением кристалличности и упорядоченности структуры гидроксилапатита, деформацией и уплотнением волокон коллагена.
Ключевые слова: костная ткань человека, биоминерал, гидроксилапатит, коллаген, структура, кристалличность, коксартроз.
Введение. Костная ткань является важнейшим органо-мине-ральным образованием, обеспечивающим «нормальное» течение процессов жизнедеятельности в организме человека [1, 2]. Их нарушение проявляется в виде различных костно-суставных заболеваний, в том числе коксартроза [3, 4]. Несмотря на высокий уровень современных медицинских технологий, при лечении данной патологии отсутствуют методы полного восстановления тканей суставов, а также недостаточно изучены причины их поражения [3-5]. Для решения этой проблемы необходимо, в частности, использовать инструментальные методы анализа для изучения патогенных изменений костных тканей.
Цель работы - исследование структуры и химического состава костных тканей при коксартрозе. Полученные результаты могут быть использованы для создания различных биосовместимых материалов (протезов, ауто- и аллотрансплантатов, керамик, композитов).
Объекты и методы исследования. Была собрана коллекция головок бедренных костей мужчин и женщин Омского региона в возрасте от 30 до 79 лет. Она включала 4 «нормальных» (контрольных) образца и 108 образцов, удаленных вследствие коксартроза. База данных по образцам включала полные сведения о пациенте (возраст, пол, вид деятельности, сопутствующие заболевания и т. д.). Для изучения динамики заболевания из бедренных головок получали по три горизонтальных среза: верхний, средний и в направлении гиалиновый хрящ - бед-
нижний (порядок чередования приведен ренная кость), которые в дальнейшем
© С.А. Лемешева, О.А. Голованова, И.В. Муромцев, С.В. Туренков, 2010
анализировали в виде сухих порошкообразных проб. Усредненный состав разных пораженных пластинок сравнивали между собой и с контрольными образцами.
Рентгенофазовый анализ (РФА) порошков костной ткани проводили на дифрактометре XRD-7000 (Shimadzu) с оптической поликапиллярной системой. Рабочий режим: CuKa-излучение, U=40 кВ, 1=30 мА, скорость сканирования - 1 0/мин, юстиро-вочные щели - 1 мм; 0,3 мм. Поликапил-лярная система обеспечивает параллельный рентгеновский пучок и принципиально улучшает соотношение пик/фон.
ИК-спектры исследуемых проб регистрировали на спектрофотометре Spectrum One FT-IR (Perkin Elmer). Образцы для анализа готовили прессованием костного порошка в таблетки с бромидом калия. Математическую обработку полученных спектрограмм проводили с помощью программного пакета PeakFit_v 4.1 по методике, предложенной J. Shi (распределение по Лоренцу, Р=0,99) [6]. Её применение позволяло охарактеризовать степень кристалличности костного апатита. С этой целью по результатам разложения пика антисимметричного деформационного колебания V4 связи О-Р-О фосфат-ионов на три элементарные полосы поглощения в спектральной области 400650 см-1 рассчитывали параметр его инфракрасного расщепления IRSF как отношение интенсивностей двух пиков к интенсивности «впадины» между ними: IRSF=I(564 см-1)+1(604 см-1)/1(584 см-1).
Считается, что с увеличением величины данного параметра возрастает кристалличность минерала. Кроме того, для оценки изменения содержания карбонат-ионов и определения механизма замещения ими ионов ОН- (А-тип) и РО43- (В-тип) в структуре апатита костных тканей при коксартрозе проводили разложение полосы суммарного поглощения антисимметричных колебаний v3 связи С-О карбонат-ионов на шесть элементарных компонент. По результатам разложения в интервале частот 1350-1700 см-1 вычисляли A/B-коэффициент, т. е. отношение суммы интегральных интенсивностей пиков А-(1452-1456, 1495-1501, 1547-1451) к
сумме В- замещений (1412-1414, 14691472).
Термический анализ костных порошков выполняли на дериватографе SII
Diamond-TG-DTA (Perkin Elmer) в температурном интервале 25-1000 °C. По термогравиметрической кривой (ТГ) и её производной - дифференциально-гравиметрической кривой (ДТГ) определяли потери массы при отжиге. По виду дифференциально-термической кривой (ДТА) исследовали энергетику термического преобразования костных составляющих
[7, 8].
ЭПР-спектры костных порошков получали на радиоспектрометре ESR70-03 DX/2 (Беларусь). Для активации парамагнитных центров в порошковых пробах проводили поэтапный отжиг в температурном диапазоне 23-600 оС в электропечи SNOL 6,7/1300. С помощью программного обеспечения Origin 7.0 вычисляли фактор спектроскопического расщепления (g-фактор), ширину линии ЭПР-сигнала (AH, Гс) и концентрацию парамагнитных центров (Спмц, спин • г-1). Последние две величины рассчитывали с использованием эталонного образца MgO:Mn2+ с концентрацией парамагнитных центров (1,07±0,1)х 1015 с/г и шириной линии сигнала в ЭПР-спектрах 0,64±0,03 Гс.
Содержание кальция в исследуемых образцах определяли с помощью метода атомно-абсорбционной спектроскопии на спектрометре AAS 1N по ГОСТ 26570-95
[9]. Определение общего фосфора проводили спектрофотометрическим методом на автоматизированной линии «Contiflo» (ГОСТ 26657-97) [10]. Пределы обнаруже-
-6
ния данных элементов составляли 10 %
Рассчитывали их содержание по градуировочным кривым, построенным по стандартным растворам карбоната кальция и фосфата калия.
Статистическую обработку полученных данных проводили методом Стью-дента для доверительной вероятности Р = 0,95, исходя из предположения об их распределении по нормальному закону (программный пакет Statistic Soft 2006).
Результаты и их обсуждение. Известно, что кристаллическую основу минеральной компоненты костных тканей составляет плохо окристаллизованный карбонатсодержащий гидроксилапатит [11, 12]. Низкая кристалличность биоминерала обусловлена присутствием коллагена (от 20 до 60 %), других органических
веществ, а также аморфных фосфатов кальция. На дифрактограммах пораженных проб, в отличие от контрольных, наблюдаются менее разрешенные и уширенные рефлексы (рис. 1). Повышен уро-
Ар
вень фона в 20-области рентгеноаморфной компоненты (10-200). Эти изменения дифрактограмм вероятно указывают на уменьшение окристаллизованности гид-роксилапатита при патологии.
Рис. 1. Рентгенограммы порошков контрольного (1) и пораженного верхнего срезов (2) костной ткани
Методом РФА в одном из поврежденных образцов была идентифицирована примесь фатерита (модификация карбоната кальция), часто встречающего в патогенных органо-минеральных агрегатах. Возможно, образование примесных фаз является одной из причин повышенной твердости кости при коксартрозе [13].
Результаты ИК-спектроскопии согласуются с результатами рентгенофазового анализа костных порошков. Во всех ИК-спектрах порошков костных тканей присутствуют полосы поглощения, характерные для колебаний связей в неорганических ионах. Это связи О-Р-О в Р043--ионах; связи С-О и О-С-О в С032- ионах. Наблюдаются также полосы молекулярной воды и разных групп, характерных для органических молекул (-Ы-Н; - С=0; -С-Н). Типичные ИК-спектры показаны на рис. 2.
Наличие полос поглощения карбонат-ионов в ИК-спектрах исследуемых проб при 1460-1420 см-1 и 1550 см-1 указывает на возможность замещения данными ионами ионов в структуре апатита. Замещение может идти как по А-, так и по В-механизму. Диффузность пиков свидетельствует о низкой кристалличности и недостаточной упорядоченности апатита.
Судя по значениям А/В-коэффици-ента и параметра ШЭЕ для порошков разных костных срезов (табл. 1), состав нижних поврежденных пластинок близок к контрольным. Это свидетельствует о развитии поражения от верхнего костного среза к нижнему. Широкий разброс значений для пораженных тканей связан с использованием большего числа исследуемых проб.
ШО-Р-О
см 1
Рис. 2. ИК-спектры порошков контрольного (1) и пораженного верхнего срезов (2) костной ткани
Т а б л и ц а 1
Значения А/В-коэффициента и параметра ^вР для пораженных при коксартрозекостных
тканей и для контрольных образцов
Костные срезы А/В /ЯБГ
Пораженные Контрольные Пораженные Контрольные
Верхние 1,29±0,01 0,67±0,12 1,17±0,02 3,16±0,65
Средние 0,92±0,02 0,73±0,10 1,12±0,10 3,16±0,65
Нижние 0,79±0,05 0,79±0,08 4,10±0,01 4,16±0,21
Приведенные данные указывают, что в кристаллической решетке апатита из «нормальных» костных образцов карбонат-ионы преимущественно замещают фосфатные тетраэдры. Доминирующим механизмом анионного замещения в данном случае, очевидно, является В-тип [11,
14]. Напротив, в патогенных пробах преобладающим типом замещения выступает замена СОз2- гидроксил-ионами (А-тип
замещения). Такое предположение подтверждается отсутствием полос поглощения ОН- групп и увеличением интенсивности полос поглощения карбонат-ионов при 1550 см-1 в ИК-спектрах поврежденных верхних срезов костных тканей. Для верхних костных пластинок пораженных
проб характерно также меньшее значение параметра ШЭЕ, что указывает на снижение кристалличности костного апатита при коксартрозе.
Атомное соотношение кальция и фосфора (Са/Р) в порошках костных тканей определяли методом атомно-абсорбционной спектроскопии. В патогенных образцах наблюдается увеличение значений Са/Р от нижнего костного среза к верхнему (табл. 2). Такая закономерность может являться следствием как рассмотренных ранее изоморфных структурных замещений в костном апатите, так и результатом отложения примесных минеральных фаз при коксартрозе.
Т а б л и ц а 2
Значение Са/Р для контрольных и пораженных костных тканей женщин (1) и мужчин (2)
на примере возрастного интервала 50-59 лет)
Костные срезы (1) (2) Контрольные пробы
Верхний 1,19±0,001 1,81±0,01 0,89±0,04
Средний 1,23±0,02 1,24±0,02 0,95±0,05
Нижний 0,91±0,01 1,08±0,02 0,83±0,09
С помощью термического анализа получены дополнительные данные по закономерностям изменения химического состава костных тканей при коксартрозе. Выделены потери массы образцов в четырех температурных интервалах (табл. 3). В интервале I (25-200 0С) теряется адсорбированная вода. В интервале II (200-430 0С) происходит удаление структурной воды, а также низко- и высокомолекулярных ор-
ганических веществ, в частности неколлагеновых белков с меньшей молекулярной массой, чем коллаген. В интервале III (430-600 0С) разрушается коллаген. В интервале IV (700-900 0С) идет выделение углекислого газа из минеральной костной компоненты за счет перехода нестехио-метричного карбонатгидроксилапатита в стехиометричный гидроксилапатит [14,
15].
Т а б л и ц а 3
Убыль массы костной ткани (% масс.) в разных температурных интервалах
Тип костной ткани Костные Пол I II III IV
срезы пациента
Пораженные Верхний М 6,83±0,01 26,19±1,40 16,11±1,04 2,06±0,39
Ж 7,25±0,01 19,84±1,93 15,97±3,45 2,56±0,09
Средний М 7,43±0,001 21,38±0,01 13,95±0,001 2,52±0,001
Ж 6,90±0,26 20,15±2,54 18,10±3,64 2,27±0,01
Нижний М 7,12±0,26 20,81±1,40 17,56±1,55 1,91±0,19
Ж 6,96±0,06 20,21±0,48 21,11±3,53 2,10±0,08
Контрольные пробы М 4,52±0,36 20,14±1,63 20,39±2,31 2,33±0,23
Отжиг пораженных проб приводит к большим (по сравнению с контрольными пробами) потерям адсорбционной воды, углекислого газа, а также участвующей в костном метаболизме неколлагеновой компоненты. Это хорошо согласуется с данными РФА и ИК-спектроскопии о понижении кристалличности и меньшей упорядоченности структуры костного апатита при патологии.
Меньшие потери коллагена при отжиге тканей, поражённых коксартрозом, вероятно обусловлены не меньшим содержанием коллагена (наоборот, при коксартрозе содержание органических веществ в костной ткани повышается), а другими факторами. Можно предположить, что меньшая убыль массы коллагена обусловлена более плотной упаковкой коллагеновых волокон вследствие повышенной механической нагрузки на кость, что может являться одной из причин высокой ее твердости при патологии. В пользу этого заключения свидетельствуют увеличение температур разложения коллагеновой компоненты на кривых ДТА пораженных образцов (в отличие от контрольных).
Применение дискриминантного анализа позволило доказать достоверное от-
личие наиболее пораженных проб костных тканей верхних срезов от контрольных и менее поврежденных нижних пластинок по содержанию адсорбционной воды, органических веществ и значению Са/Р коэффициента (рис. 3).
Представления о структурных изменениях в костных тканях при их поражении получены с помощью электронного парамагнитного резонанса. В процессе термического отжига порошковых проб костных тканей при температурах выше 200 0С в ЭПР-спектрах регистрируется широкий единичный сигнал «К-центров» их органической составляющей ^ =
2,0047 ± 0,0005, ДИ= 5,81 ± 1,06 Гс) [17]. На основании данных термического анализа и гауссовой формы, полученных ЭПР-сигналов термохимических ион-радикалов выделены два температурных диапазона разложения органических веществ (рис. 4, табл. 3): (II) 200-430 (470) 0С соответствует термическому разложению низко- и высокомолекулярных органических веществ с меньшей молекулярной массой, чем у коллагена и (III) 430 (470)-600 0С - термопреобразованию высокомолекулярной составляющей - коллагена (рис. 4).
Рис. 3. Диаграмма разделения проб костной ткани человека на группы по содержанию адсорбционной воды, органических веществ и значению коэффициента Са/Р: верхние (1), нижние (2) пораженные и
контрольные (3) срезы
Рис. 4. Зависимости значений ширины линии сигнала на ЭПР-спектрах (а) и концентрации ион-радикалов «Р-центров» (б) нормальных (1) и пораженных (2) костных тканей
Выявлено, что при термическом разложении веществ, имеющих неупорядоченный по сравнению с коллагеном состав (II), образуется большее число парамагнитных радикалов, между которыми существуют более сильные спин-спино-вые, диполь-дипольные и др. взаимодействия, чем в случае коллагеновой компоненты (III). Для данных температур, как в контрольных, так и поврежденных порошковых пробах характерно большее содержание «К-центров» и более широкая линии сигнала в их ЭПР-спектрах. Установлено, что в пораженных образцах преобладают органические вещества малой
молекулярной массы (I), возможно вследствие деградации коллагеновых волокон при патологии. При этом между ион-радикалами измененных коллагеновых фибрилл микровзаимодействия выражены в меньшей степени, что можно объяснить их плотной упаковкой вследствие перераспределения нагрузки на кость. В ЭПР-спектрах таких проб наименьшая ширина линии сигнала соответствует начальным температурам разложения коллагена (390-500 0С, рис. 4б).
Таким образом, в работе показано, что при протекании коксартроза в костных тканях наблюдается увеличение зна-
чения Са/Р, содержания карбонат-ионов, органических веществ, адсорбированной воды. Это приводит к уменьшению кристалличности и упорядоченности структуры костного апатита. Высокая твердость «артрозных» костей, возможно, обусловлена отложением примесных минеральных фаз и плотной упаковкой деформированных коллагеновых волокон.
Полученные данные могут быть использованы при лечении и проведении профилактических мер костных патологий.
Авторы благодарны зав. лабораторией ФХМИ минерального вещества Института геологии и геохимии им. академика А.Н. Заварицкого УрО РАН г. Екатеринбурга член-корр. РАН, д.г.-м. н. С.Л. Вотякову за предоставление экспериментальной базы для исследований.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Sahai N., Schoonen M. A. Medical mineralogy and
geochemistry // Reviews in Mineralogy and Geochemistry / N. Sahai, M.A. Schoonen, 2006. V. 64. 332 p.
[2] Зацепин С. Г. Костная патология взрослых. М.,
2001. 640 с.
[3] Коваленко В. Н., Борткевич О. П. Остеоартроз.
М., 2003. 240 с.
[4] Лунева С. Н. Биохимические изменения в тка-
нях суставов при дегенеративно-дистрофи-чеких заболеваниях и способы их направленной биологической коррекции: дис. ... д-ра биол. наук / С. Н. Лунева. Тюмень, 2003. 297 с.
[5] Епифанов В. А. Артроз суставов кисти и стопы.
М., 2005. 128 с.
[6] Shi J., Klocke A, Zhang M., Bismayer U. Ther-
mally-induced structural modification of dental enamel apatite: Decomposition and transforma-
tion of carbonate groups // European Journal of Mineralogy. 2005. V. 17. P. 769-775.
[7] Шестак Я. Теория термического анализа: Фи-
зико-химические свойства твердых неорганических веществ / Я. Шестак. М., 1987. 456 с.
[8] Егунов В. П. Введение в термический анализ.
Самара, 1996. 270 с.
[9] ГОСТ 26570-95. Корма, комбикорма, комбикор-
мовое сырье. Методы определения кальция. М., 2000. С. 6-8.
[10] ГОСТ 26657-97. Корма, комбикорма, комбикормовое сырьё. Метод определения содержания фосфора. М., 2000. С. 10-13.
[11] Кораго А. А. Введение в биоминералогию. СПб., 1992. 280 с.
[12] Dorozhkin S. V. Calcium orthophosphates // Journal of Materials Science. 2007. V. 42. № 4. Р. 1061-1095.
[13] Минералогическая энциклопедия / А. Г. Булах,
B. Г. Кривовичев. Ленинград, 1985. 512 с.
[14] Озаровская О. В. Выявление изменчивости минерального состава костных ткани при археологических раскопках / О. В. Озаровская // Материалы III Международного Симпозиума «Биокосные взаимодействия: жизнь и камень». Спб., 2007. С. 134-137.
[15] Гилинская Л. Г., Гоигорьева Т. Н., Окунева Г. Н., Власов Ю. А. Исследование минеральных образований на сердечных клапанах человека // Журнал структурной химии. Т. 44. № 4. 2003.
C. 678-689.
[16] Ерош Е. Б., Дмитревский Б. А., Нарыжный В. П., Цветков С. К. Некоторые характеристики синтезированных образцов гидроксилапатита // Журнал прикладной спектроскопии. Т. 74. Вып. 6. 2001. С. 1029-131.
[17] Брик А. Б., Дубок В. А., Розенфельд Л. Г., Клименко А. П., Калиниченко А. М. Применение ЭПР для изучения процессов ассимиляции имплантатов живой костной тканью // Вестник Украинской медицинской стоматологической академии. Т. 7. Вып. 1. 2008. С. 262-265.
