CC BY
110
УДК 543.545:547.91
ПРИМЕНЕНИЕ ЗОННОГО КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ САПОНИНОВ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ
© А.В. Калач1’2 , А.И. Ситников1, Н.Ю. Страшилина3, В.Ф. Селеменев2
1 Институт МВД России, радиотехнический факультет, пр. Патриотов, 53, Воронеж, 394065 (Россия) E-mail: a_kalach@mail.ru 2Воронежский государственный университет, химический факультет, Университетская пл., 1, Воронеж, 394017 (Россия)
3ОАО Всероссийский НИИ комбикормовой промышленности, пр. Труда, 91,
Воронеж, 394026 (Россия)
Предложено определять сапонины в водных растворах методом капиллярного электрофореза. На примере экстракта из сахарной свеклы оптимизированы условия анализа сапонинов. Предложена эффективная методика их определения с использованием системы капиллярного электрофореза «Капель-105» .
Введение
Сапонины представляют собой растительные гликозиды, характерным свойством которых является способность создавать легкопенящиеся коллоидные растворы, которые при кислотном или ферментативном гидролизе расщепляются на монозы и неуглеводную безазотистую часть - сапогинин [1].
В последние годы интерес к лекарственному сырью, содержащему сапонины, изучению химического состава, фармакологических свойств, глубокой переработки этого сырья все более возрастает. Известно, что наибольшее количество сапонинов содержится в растениях, приведенных в таблице.
Получение сапонинов - достаточно длительный процесс, заключающийся в ряде последовательных стадий экстракций с различными растворителями [2, 3].
Сапонины применяют как ингредиенты жидких мыл, шампуней, кремов; в пищевой промышленности -при производстве шипучих напитков, пива, некоторых кондитерских изделий. Сапонины содержатся во многих лекарственных препаратах растительного происхождения, являются сырьем при производстве гормонов.
Поскольку одна из наиболее важных задач фармацевтической химии -разработка и совершенствование методов оценки качества лекарственных средств [4], то целью настоящего исследования являлась разработка способа определения сапонинов в водном растворе на примере концентрата, полученного из сахарной свеклы.
Содержание сапонинов в некоторых растениях
Наименование растения Часть растения Содержание от сухой массы, %
Мыльная трава (Lychinis Chalcedonica) листья 23
Мыльное дерево (Sapindus Saponaria) плоды 38
Конский каштан скорлупа 11
(Aesculus Hippocastanum) мякоть плодов 6
Мыльный корень (Acahtophyllum Glandulosum) корень 32
Альпийская фиалка (Cyclamen ) клубни 25
Мыльнянка (Saponaria Officinalis) корень 36
Горицвет (Melansrium Album) корень 28
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Экстракт из сахарной свеклы получали методом водной ультразвуковой экстракции при комнатной температуре.
Исследование химического состава экстракта. Схема разделения входящих в состав экстракта соединений основана на их физических и химических свойствах. Для разделения несахаров и полисахаридов использовали осаждение последних 80%-ным этанолом. В осадке присутствуют также пектиновые вещества [5]. Гликозиды выделяли из экстракта этилацетатом.
Исследование сапонинов. Схема выделения сапонинов из сухого экстракта представлена на рисунке 1 [2].
Предложенная в [2] схема основана на химических и физических свойствах веществ, содержащихся в экстракте. Для разделения суммы сапонинов на отдельные группы использовали их разное отношение к растворителям и охлаждению [6]. Схема разделения представлена на рисунке 2.
Рис. 1. Схема выделения сапонинов
Охлаждение
Раствор по каплям в ацетон
Этанопьный рас твор сапонинов
......1...... ........ ........ і
Бода
Б осадке сапонины с Б осадке
малым числом тритерпеновые
углеродных атомов сапонины
Б осадке полярные сапонины
Рис. 2. Схема разделения сапонинов
Методика выполнения определения сапонинов капиллярным электрофорезом. Анализ сапонинов проводили на приборе «Капель-105» (Люмекс, Санкт-Петербург) с кварцевым капилляром следующей геометрии: эффективная длина 70 мм, диаметр 50 мкм. В качестве ведущего электролита применяли боратный буферный раствор с добавлением р-циклодекстрина (рН = 9,98). Пики регистрировали при рабочей длине волны X = 195 нм. Между анализами капилляр кондиционировали в течение 5 мин боратным буфером того же состава, что и ведущий электролит.
Результаты и их обсуждение
В настоящее время для определения сапонинов применяют следующие методы [7, 8].
Физический метод. Проба на пенообразование основана на высокой поверхностной активности сапонинов. Если в растворе присутствуют сапонины, то такая жидкость пенится при встряхивании и образуется обильная пена даже в очень больших разведениях.
Кроме того, практикуют следующий способ. Берут две пробирки и наливают в одну из них 5 мл НС1, в другую - 5 мл №ОН. Добавляют в обе пробирки 2-3 капли извлечения или раствора сапонина. Сильно встряхивают. При наличии стероидных сапонинов в пробирке со щелочью образуется более обильная и стойкая пена, чем в пробирке с кислотой. Такой же результат можно получить, используя и тритерпеновые сапонины, которые имеют нейтральную реакцию. В этом случае следует провести еще реакцию на стероидное ядро. При наличии тритерпеновых сапонинов в обеих пробирках образуется пена, равная по объему и стойкости.
Химические методы можно разделить на две группы:
а) реакции осаждения. В пробирки с экстрактами добавляют раствор Ва(ОН)2 или ацетата свинца. При действии указанных реактивов сапонины выпадают в осадок;
б) проба Лафона. К 2 мл водного экстракта приливают 1 мл концентрированной серной кислоты, 1 мл этанола, 1 каплю раствора с массовой долей сульфата железа 10%. Если при нагревании появляется синезеленое окрашивание, то делается вывод о наличии сапонинов в растворе.
Биологические методы. Определяют гемолитический индекс - наименьшую концентрацию извлечения из сырья, которая вызывает полный гемолиз эритроцитов. Для этого к настою сырья на изотоническом растворе добавляют 2%-ную взвесь бараньих эритроцитов. В результате гемолиза кровь становится прозрачной, ярко-красной, лакированной (эритроциты переходят в плазму). Расчет проводят на 1 г испытуемого вещества. Кроме того, определяют силу действия сапонинового сырья на рыбах, т.е. рыбный индекс: это наименьшая концентрация извлечения, при которой гибнут рыбы массой до 0,5 г, длиной 3-4 см в течение 1 ч.
В последнее время для обнаружения сапонинов в сырье также стали использовать хроматографию на бумаге и в тонком слое сорбента и капиллярный электрофорез [9].
Рассмотренные методы характеризуются недостаточной точностью и значительной продолжительностью анализа. Разработка эффективного способа определения сапонинов является актуальной. Кроме того, сапонины в лекарственных растениях изучены мало, тем не менее биологическая активность этих соединений достаточна велика.
Так, например, известно, что сапонины встречаются как в растительном, так и в животном мире. Сапонины обнаружены у растений различных климатических зон, в подземных (синюха, солодка, первоцвет, диоскорея, растения семейства аралиевых, патриния) и надземных (листья наперстянки, цветки коровяка) органах, в растворенном состоянии, в клеточном соке. Среди животных сапонины встречаются у пчел, змей очковых, пиявок.
Лечебные свойства растений обусловлены содержанием в них активно действующих веществ, способных оказывать определенное влияние на организм в целом, на его органы и системы. Количество активных веществ не постоянное, оно меняется в зависимости от фазы развития растения, от почвы, на которой оно растет, правил заготовки, обработки и хранения.
В ходе проведенных нами исследований варьировались температура анализа и давление при вводе пробы.
На рисунке 3 приведена электрофореграмма экстракта, содержащего сапонины при 25 °С и давлении при вводе пробы 200мБар-с. Как видно на рисунке 3, достичь желаемого хорошего разделения сапонинов не удалось.
Повышение температуры анализа до 40 оС позволяет разделить пики 1 и 2 между собой (рис. 4), однако при этом пик 3 сглаживается, кроме того, на электрофореграмме появляются два дополнительных пика.
Повышение температуры анализа и снижение давления при вводе пробы в капилляр позволили улучшить разделение сапонинов в экстракте. На рисунке 5 приведена электрофореграмма экстракта, содержащего сапонины при температуре 40 °С и давлении при вводе пробы 175мБар-с.
■■■.ГТ-„Л7
Я
Рис. 3. Анализ водного раствора смеси сапонинов. Условия анализа: 25 °С, давление ввода пробы 200мБар-с (пики 1-4 - отдельные фракции сапонинов)
Рис. 4. Анализ водного раствора смеси сапонинов. Условия анализа: 40 °С, давление ввода пробы 200мБар-с (пики 1-6 - отдельные фракции сапонинов)
Рис. 5. Анализ спиртового раствора смеси сапонинов. Условия анализа: 40 °С, давление ввода пробы 175мБар-с (пики 1-4 - отдельные фракции сапонинов)
Как видно из рисунка 5, выбранные условия позволяют удовлетворительно проводить определение сапонинов, а также разделять их между собой.
Выводы
Изучены возможности капиллярного электрофореза для определения фракционного состава сапонинов, содержащихся в сахарной свекле. Изменение температуры приводит к сокращению продолжительности анализа на 4-5 мин, давления - на 7 мин. При этом следует отметить, что улучшаются разделение пиков и их геометрия, что позволяет проводить более качественную обработку электрофореграмм. Таким образом, можно добиться сокращения времени анализа сапонина в водных растворах до 12 мин.
Список литературы
1. Каухова И.Е., Минина С.А. Химия и технология фитопрепаратов. М., 2004.
2. Матасова С.А., Митина Н.А., Рыжов Г.Л. и др. Получение сухого экстракта из корней девясила высокого и изучение его химического состава // Химия растительного сырья. 1999. №2. С. 119-123.
3. Абдюшева Л.Р., Кондратенко Р.М., Балтина Л.А. Разработка способа выделения суммы сапонинов и соясапо-генола В из соевых бобов: Тезисы докл. II Всерос. конф. «Химия и технология растительных веществ». Казань, 2002. С. 62.
4. Глущенко Н.Н., Плетенева Т.В., Попков В.А. Фармацевтическая химия: Учебник для студ. сред. проф. учеб. заведений / Под ред. Т.В. Плетеневой. М., 2004.
5. Георгиевский В.П., Комиссаренко Н.Ф. Биологически активные вещества лекарственных растений. Новосибирск, 1990.
6. Деканосидзе Г.Е., Чирва В.Я., Стригина Т.В., Уварова Н.И. Исследование тритерпеновых гликозидов. Тбилиси, 1982.
7. Ладыгина Е.Я., Сафронович Л.Н., Баландина И.А., Отряшникова В.Э. Химический анализ лекарственных растений. М., 1983.
8. Цитович И.К. Аналитическая химия. М., 1994.
9. Emera S., Mohamed Kh.M., Masujima T., Yamasaki K. Separation of naturally occuring triterpenoidal saponins by capillary zone electophoresis // Biomed. Chromatogr. 2001. V. 15. P. 252-256.
Поступило в редакцию 28 октября 2006 г.
После переработки 26 декабря 2006 г.
