Определение аллиина в надземной части лука медвежьего (Allium ursinum L. ) методом капиллярного электрофореза Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 615.322:582.573.16:547.466.06:543.545.2

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЛЛИИНА В НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ ЛУКА МЕДВЕЖЬЕГО (ALLIUM URSINUM L.) МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

© 2013 К.А. Манукян, С.П. Сенченко, Е.В. Компанцева

Пятигорский медико-фармацевтический институт -филиал Волгоградского государственного медицинского университета, г. Пятигорск

Поступила в редакцию 29.04.2013

Разработана методика идентификации и количественного определения аллиина (основного компонента серосодержащих соединений) в надземной части лука медвежьего (черемши) (Allium ursinum L.) методом капиллярного электрофореза. Проведена валидационная оценка методики. Изучены условия оптимальной экстракции аллиина (S-Allyl-L-cysteinesulfoxide) из высушенного сырья: влияние температуры, экстрагента, времени экстракции, степени измельчения сырья, вида экстракции, соотношение сырья и экстрагента. Содержание аллиина в 5 образцах различного географического происхождения составило от 0,87% до 1,50%.

Ключевые слова: лук медвежий (черемша), аллиин, капиллярный электрофорез, идентификация, количественное определение

В последнее время все больше проявляется направленный характер химических исследований как дикорастущих, так и культурных растений с целью создания высокоэффективных лекарственных препаратов. Лук медвежий (черемша, или дикий чеснок, или калба (Allium ursinum L.) - многолетнее травянистое растение рода Allium семейства луковые Alliaceae) — ценное пищевое, медоносное, декоративное, лекарственное растение с выраженными бактерицидными и фунгицидными свойствами. Применение черемши препятствует накоплению холестерина в крови, стимулирует сердечную деятельность, снижает кровяное давление и способствует нормализации обмена веществ. Все эти незаменимые качества сырья, а также его популярность как традиционного пищевого продукта населения страны ведут к массовому сбору лука медвежьего, что приводит к истощению природных ресурсов. Страдает черемша при рубке и осветлении древесного полога, осушении земель, вытаптывании при пастьбе скота. Поэтому лук медвежий, являясь редким видом, во всех известных местах произрастания нуждается в действенной охране, а вопрос широкого введения

Манукян Карина Артуровна, аспирантка. E-mail: asgoodasitgets@mail. ru

Сенченко Сергей Петрович, кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармацевтической химии. E-mail: [email protected]

Компанцева Евгения Владимировна, доктор фармацевтических наук, профессор кафедры фармацевтической химии. E-mail: [email protected]

его в культуру и использовании исключительно надземной части растения является актуальным для многих регионов России.

Известно, что сырье лука медвежьего содержит фитонциды, эфирное масло, инулин, флавоноиды, аскорбиновую кислоту, микроэлементы, среди которых йод, германий и селен. По данным зарубежных исследователей, особое внимание уделяется изучению серосодержащих соединений, отвечающих за большинство лечебных эффектов растений рода Allium, основным среди которых является аллиин (более 1,0%), вызывающий регрессии опухолей до полного исчезновения или торможения их роста при инъекциях крысам [5]. Аллиин -(S-Allyl-L-cysteinesulfoxide);3-((S)- Allylsulfiniyl)-L-alanine; (R)-2 fmino-3 -(prop-2-tnt-1 sulfinyl)-propionicacid) - серосодержащая аминокислота, способная под влиянием фермента аллииназы расщепляться до аллицина, обуславливающего чесночный запах черемши. Однако в литературе нет данных о количественном содержании ни суммы серосодержащих соединений, ни аллиина в надземной части лука медвежьего, произрастающего на территории Северного Кавказа и Краснодарского края.

Цель работы: разработка методики качественного и количественного содержания ал-лиина в надземной части лука медвежьего методом капиллярного электрофореза [1, 3].

Материалы и методы. Исследовали образцы высушенной надземной части лука медвежьего с применением метода капиллярного

Известия Самарского научного центра Российской академии наук, том 15, №3(2), 2013

электрофореза. Образцы сырья были собраны на Северном Кавказе и в Краснодарском крае в 2011-2012 гг. С целью получения оптимальных условий экстракции аллиина из исследуемого сырья, определяли его влажность, изучали влияние температуры, экстрагента, времени экстракции, степени измельчения сырья, вида экстракции, соотношение сырья и экстрагента. Измельченное сырье заливали экстрагентом, настаивали, затем экстрагировали на аппарате для встряхивания. Качественное и количественное определение аллиина в извлечениях проводили методом капиллярного электрофореза, используя систему капиллярного электрофореза Капель 105 (группа компаний «Люмэкс», Россия). В работе использовались кварцевый термостатируемый капилляр с диаметром 50 мкм, общей длиной 75 см и рабочей длиной 65 см. Электролит: раствор натрия тетраборатадекагидрата (0,02 М) с добавкой Р-циклодекстрина (0,0044 М) [2]. Для подготовки капилляра и восстановления его поверхности проводили его последовательную промывку водой, 0,5 М раствором хлористоводородной кислотой, водой, 0,5 М раствором натрия гидро-ксида, водой и затем ведущим электролитом. Аллиин не имеет селективного поглощения в УФ-области спектра, поэтому его определение проводили при 200 нм в катодной области капилляра. Анализ проводили при 20 кВ и температуре 500С. Ввод пробы осуществляли гидродинамически в режиме 150 мБархс. Все растворы перед вводом центрифугировались при 7000 мин-1 в течение 5 мин. Валидационную оценку разработанной методики проводили по показателям специфичность, линейность, прецизионность и правильность [4]. В качестве стандартного образца использовали аллиина фирмы SigmaAldrich (с чистотой не менее 99%). Раствор стандартного образцаготовили в спирте этиловом 40%.

Результаты и их обсуждение. Результаты анализа раствора стандартного образца аллиина и извлечения из исследуемого сырья представлены на рис. 1 и 2. Из полученных данных следует, что пик аллиина полностью разделен с сопутствующими компонентами сырья (разрешение с ближайшим пиком составляет 1,4), что позволяет использовать выбранные условия для дальнейших исследований.

Следующим этапом работы стало определение основных валидационных характеристик разработанной методики. Ввиду невозможности воспроизведения точного качественного и количественного состава изучаемого объекта, параметр «Специфичность» определяли путем сопоставления времен миграции пика аллиина на электрофореграмме раствора стандартного и испытуемого образца. Кроме того, использовалась

добавка стандартного образца к испытуемому объекту. В результате было установлено, что пик аллиина увеличивается пропорционально количеству добавленного стандарта, при этом асимметрия (0,80) и эффективность (порядка 170 000 т.т.) остаются без изменений. Также следует отметить, что разрешение пика аллиина с ближайшим сопутствующим пиком на электрофоре-грамме составило 1,2, что свидетельствует о приемлемом разделении компонентов пробы. Полученные данные позволяют считать разработанную методику качественного и количественного анализа аллиина специфичной.

mAU 10-

Capel

Рис. 1. Электрофореграмма раствора стандартного образца аллиина

Рис. 2. Электрофореграмма водного извлечения из лука медвежьего

Параметр «Линейность» определяли путем построения градуировочного графика и расчета коэффициента корреляции (г); «Прецизионность» - путем расчета стандартного (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD); для оценки показателя «Правильность» использовали расчет открываемости (Я). Результаты исследования данных валидационных характеристик приведены в таблице 1. Полученные данные свидетельствуют о приемлемых значениях основных валидационных характеристик разработанной методики, что позволяет использовать ее для оценки количественного содержания ал-лиина в сырье.

8

6

4

2

0

8

9

10

Таблица 1. Параметры валидационной оценки методики количественного определения аллиина

Характеристика Параметры

линейность y = 2033x - 0,236, r=0,9997

прецизионность SD = 0,030,RSD = 2,78 %

правильность R = 99,81%

Далее следовало оптимизировать условия экстракции аллиина, используя разработанную методику. В результате установлено, что максимальное количество аллиина извлекается при использовании в качестве экстрагента воды. При этом достаточно было проводить двукратную экстракцию при комнатной температуре (200С) в течение 30 минут при использовании соотношения сырье - экстрагент 1:20. Размер частиц сырья 2 ммпозволял добиться максимального выхода анализируемого вещества.

Следующим этапом явилось определение аллиина в образца лука медвежьего различных мест сбора. Полученные результаты представлены в таблице 2. Содержание аллиина в испытуемых образах составило от 0,86% до 1,50%

Выводы: разработана методика идентификации и количественного определения аллиина в высушенной надземной части лука медвежьего методом капиллярного электрофореза. Установлены оптимальные параметры его экстракции из сырья. Установлено содержание аллиина в образцах черемши различного географического происхождения о 0,87% до 1,50% в пересчете на массу сухого сырья.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Беленький, Б.Г. Высокоэффективный капиллярный электрофорез. - СПб.: Наука, 2009. 320 с.

2. Гаврилин, М.В. Совершенствование способов оценки качества корней и сиропа солодки / М.В. Гаврилин, С.П. Сенченко, А.М. Тамирян, А.В. Печенова // Химия растительного сырья. 2009. № 4. С. 147-150.

3. Комарова, Н.В. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза «КАПЕЛЬ» / Н.В. Комарова, Я.С. Каменцев. - СПб.: ООО «Веда», 2006. 212 с.

4. Руководство для предприятий фармацевтической промышленности. Методические рекомендации. - М.: Издательство «Спорт и Куль-тура-2000», 2007. 192 с.

5. Horie, H. Non-derivatized analysis of methiin and alliin in vegetables by capillary electrophoresis / H. Horie, H. Hideki, K. Yamashita // J. of Chromatography. 2006. Vol. 62, № 12. Р. 337-339.

Таблица 2. Содержание аллиина в различных образцах лука медвежьего

Место и год сбора образца Содержание аллиина, %

Чеченская Республика, 2011 0,865

Краснодарский край, 2011 1,205

г. Пятигорск (культивируемый вид), 2012 0,743

Республика Дагестан, 2012 1,012

Чеченская Республика, 2012 1,503

ALLIIN'S DEFENITION IN ELEVATED PART OF THE ONION BEAR (ALLIUM URSINUM L.) BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS

METHOD

© 2013 K.A. Manukyan, S.P. Senchenko, E.V. Kompantseva Pyatigorsk Medical-pharmaceutical Institute -Branch of Volgograd State Medical University, Pyatigorsk

The technique of identification and quantitative definition of alliin (the main component of sulfur-containing composition) in the elevated part of onion bear (ramson) (Allium ursinum L.) by capillary electrophoresis method is developed. The validation estimation of a technique is carried out. Conditions of optimum alliin extraction (S-Allyl-L-cysteinesulfoxide) from the dried-up raw materials are studied: temperature effect, extragent, time of extraction, reduction ratio of raw materials, type of extraction, ratio of raw materials and extragent. The alliin contents in 5 species from various geographical provenance made from 0,87% to 1,50%.

Key words: onion bear (ramson), alliin, capillary electrophoresis, identification, quantitative definition

Karina Manukyan, Post-graduate Student. E-mail: [email protected];_Sergey Senchenko, Candidate of Pharmacy, Associate Professor at the Department of Pharmaceutical Chemistry. E-mail: [email protected]; Evgeniya Kompantseva, Doctor of Pharmacy, Professor at the Department of Pharmaceutical Chemistry. E-mail: [email protected]