Научная статья на тему 'Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии с комбинированным УФ- и масс-селективным детектированием для определения каротиноидов в гонадах промысловых видов морских иглокожих Cucumaria japonica и Strongylocentrotus nudus'

Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии с комбинированным УФ- и масс-селективным детектированием для определения каротиноидов в гонадах промысловых видов морских иглокожих Cucumaria japonica и Strongylocentrotus nudus Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
218
48
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Рыбин В. Г., Павель К. Г., Болтенков Е. В., Вербицкий Г. А.

Показана возможность применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с комбинированным масс-селективным и УФ-детектированием для проведения структурного исследования каротиноидов. Используя данный метод, исследовали состав главных каротиноидов гонад двух видов иглокожих Cucu-maria japonica и Strongylocentrotus nudus. Сравнение спектральных данных позволило установить присутствие в гонадах Cucumaria japonica 9,9'-ди-цис-кукумариаксантина А, 9-цис-кукумариаксантина А, 9,9'-ди-цис-кукумариаксантина В, 9,9'-ди-цис-кукумариаксантина С, 9-цис-кукумариаксантина С, кантаксантина и моно-цис-кантаксантина с неустановленным положением цис-двойной связи. Определены условия предварительного фракционирования и препаративного выделения каротиноидов из гонад Cucumaria japonica методом колоночной хроматографии на силикагеле с целью повышения точности последующей их идентификации. В гонадах Strongylocentrotus nudus идентифицированы b-эхиненон и b-каротин. Показана универсальность метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с комбинированным масс-селективным и УФ-детектированием для идентификации каротиноидов.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Рыбин В. Г., Павель К. Г., Болтенков Е. В., Вербицкий Г. А.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Application of high performance liquid chromatography coupled to UV and mass-selective detection to determination of carotenoids in gonads of two species of marine echinoderms Cucumaria japonica and Strongylocentrotus nudus

A possibility is shown of high performance liquid chromatography application for structural investigation of carotenoids. The composition of major carotenoids of gonads from two species of echinoderms Cucumaria japonica and Strongylocentrotus nudus has been investigated. On the base of chromatographical, UV-spectral and mass-spectral data, the following groups of carotenoids were found in the gonads of Cucumaria japonica: 9-cis-cucumariaxanthin A, 9,9'-di-cis-cucumariaxanthin A, 9,9'-di-cis-cucumariaxanthin B, 9,9'-di-cis-cucumariaxanthin C, 9-cis-cucumariaxanthin C, canthaxanthin, and mono-cis-canthaxantin without established cis-double bond location. The conditions have been determined of pre-fractionating and preparative isolation of carotenoids from gonads of Cucumaria japonica by means of column chromatography on silica gel for more precise identification. In the gonads of Strongylocentrotus nudus, b-echinenone and b-carotene were identified. The universality of high performance liquid chromatography method coupled with atmospheric pressure chemical ionization mass-spectrometry and UV detection has been shown for carotenoids identification.

Текст научной работы на тему «Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии с комбинированным УФ- и масс-селективным детектированием для определения каротиноидов в гонадах промысловых видов морских иглокожих Cucumaria japonica и Strongylocentrotus nudus»

2003

Известия ТИНРО

Том 135

УДК 577.1:593.9

В.Г.Рыбин, К.Г.Павель, Е.В.Болтенков; Г.А.Вербицкий (ТИНРО-центр; ДВГУ)

ПРИМЕНЕНИЕ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С КОМБИНИРОВАННЫМ УФ-И МАСС-СЕЛЕКТИВНЫМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРОТИНОИДОВ В ГОНАДАХ ПРОМЫСЛОВЫХ ВИДОВ МОРСКИХ ИГЛОКОЖИХ CUCUMARIA JAPONICA И STRONGYLOCENTROTUS NUDUS

Показана возможность применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с комбинированным масс-селективным и УФ-детектированием для проведения структурного исследования каротиноидов. Используя данный метод, исследовали состав главных каротиноидов гонад двух видов иглокожих Cucu-maria japónica и Strongylocentrotus nudus. Сравнение спектральных данных позволило установить присутствие в гонадах Cucumaria japonica 9,9'-ди-цис-кукумариаксантина А, 9-цис-кукумариаксантина А, 9,9'-ди-цис-кукумариаксантина В, 9,9'-ди-цис-кукумариаксантина С, 9-цис-кукумариаксантина С, кантаксантина и моно-цис-кантаксантина с неустановленным положением цис-двойной связи. Определены условия предварительного фракционирования и препаративного выделения каротиноидов из гонад Cucumaria japonica методом колоночной хроматографии на силикагеле с целью повышения точности последующей их идентификации. В гонадах Strongylocentrotus nudus идентифицированы Р-эхиненон и 0-каротин. Показана универсальность метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с комбинированным масс-селективным и УФ-детектированием для идентификации каротиноидов.

Rybin V.G., Pavel K.G., Boltenkov E.V., Verbitskii G.A. Application of high performance liquid chromatography coupled to UV and mass-selective detection to determination of carotenoids in gonads of two species of marine echinoderms Cucumaria japonica and Strongylocentrotus nudus // Izv. TINRO. — 2003. — Vol. 135. — P. 319-326.

A possibility is shown of high performance liquid chromatography application for structural investigation of carotenoids. The composition of major carotenoids of gonads from two species of echinoderms Cucumaria japonica and Strongylocentro-tus nudus has been investigated. On the base of chromatographical, UV-spectral and mass-spectral data, the following groups of carotenoids were found in the gonads of Cucumaria japonica: 9-cis-cucumariaxanthin A, 9,9'-di-cis-cucumariaxanthin A, 9,9 -di-cis-cucumariaxanthin B, 9,9'-di-cis-cucumariaxanthin C, 9-cis-cucumariaxanthin C, canthaxanthin, and mono-cis-canthaxantin without established cis-double bond location. The conditions have been determined of pre-fractionating and preparative isolation of carotenoids from gonads of Cucumaria japonica by means of column chro-matography on silica gel for more precise identification. In the gonads of Strongylo-centrotus nudus, P-echinenone and P-carotene were identified. The universality of high performance liquid chromatography method coupled with atmospheric pressure chemical ionization mass-spectrometry and UV detection has been shown for caro-tenoids identification.

Каротиноиды являются одной из основных групп природных пигментов. Высокое содержание каротиноидов характерно для тканей ряда растений, а также многих морских организмов. В последние годы в мировой научной литературе наблюдается увеличение числа публикаций, связанных с исследованиями этих соединений. Возросший интерес к каротиноидам объясняется их способностью снижать риск опухолевых и сердечно-сосудистых заболеваний человека, выступать в роли биоантиоксидантов, предшественников витамина А и др. (Bendich, Olson, 1989). В этом отношении значительный интерес вызывают каротиноиды морских организмов, в частности беспозвоночных. Для ряда соединений, выделенных из этих объектов, обнаружена высокая биологическая активность (Mat-suno, 1991; Tsushima et al., 1996).

Для анализа каротиноидов традиционно используют различные хромато-графические методы на прямых и обращенных неподвижных фазах (Pfander et al., 1994). В последнее время активно проводятся исследования по применению метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с комбинированным УФ- и масс-селективным (MC) детектированием для анализа низкомолекулярных биорегуляторов. Данный метод позволяет проводить эффективное разделение веществ с одновременным получением информации об их хромато-графических характеристиках, а также их электронных и масс-спектров (Lacker et al., 1999; Высоцкий и др., 2001).

Целью исследования было установление возможности использования системы ВЭЖХ-MC в комплексе с УФ-детекцией для идентификации ряда кароти-ноидов промысловых видов морских беспозвоночных. В частности, исследовались основные пигменты гонад голотурии Cucumaria japónica и черного ежа Strongylocentrotus nudus.

Морские ежи Strongylocentrotus nudus были собраны в период активного промысла в июне—июле 2002 г. в бухте Прогулочной зал. Петра Великого, голотурии Cucumaria japonica были собраны в Уссурийском заливе, в прибрежной зоне о. Русского в октябре 2002 г.

Реактивы, использованные в работе, были квалификации "хч". Растворители очищались по стандартным методикам (Гордон, Форд, 1976).

Экстракцию липидов проводили по методу Блайя и Дайера (Bligh, Dyer, 1959).

Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках с закрепленным слоем силикагеля Silufol UV254 ("Kavalier", Чехия). Элюировали системой растворителей: н-гексан-диэтиловый эфир в объемных соотношениях 1: 1. Для обнаружения неокрашенных соединений пластинки обрабатывали опрыскиванием 10 %-ным раствором фосфорно-молибденовой кислоты в этаноле с последующим подогревом пластинок до 100 оС.

Колоночную хроматографию осуществляли на силикагеле L Chemapol (Чехия) (40-100 мкм). На колонку, заполненную 15 г сорбента, "мокрым" способом наносили 0,5 г сухой смеси липидов. Элюировали системой растворителей н-гексан-диэтиловый эфир в объемном соотношении 1: 1. Фракции собирали по 20 мл и анализировали методом ТСХ. Фракции, содержащие близкие по значениям Rf компоненты, сушили над безводным сульфатом натрия, упаривали до постоянной массы в вакууме при температуре 35 оС и растворяли в этаноле. Полученные растворы запаивали в ампулы и хранили при температуре минус 18 оС.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию — масс-спек-трометрию проводили на хромато-масс-спектрометре Agilent 1100 Series LC/MSD ("Hewlett Packard", США), с использованием колонки HyperSil ODS (4 x 125 мм, 5 мкм) при температуре термостата 55 оС. В качестве элюента использовали ацетонитрил. Скорость элюирования 0,5 мл/мин, детек-

ция (УФ) — полный диапазон 200600 нм, ионизация — химическая ионизация при атмосферном давлении, режим регистрации положительных ионов, напряжение на фрагмен-торе 70 В, напряжение в ионизационной камере 4 кВ, поток газа-осушителя (азот) 6 л/мин и давление газа-распылителя (азот) 50 кгс/ см2. Диапазон регистрируемых масс составил 150-1000 Да.

В результате проведенных исследований установлен состав главных каротиноидов в гонадах двух видов морских иглокожих — Cucuma-ria japónica и Strongylocentrotus nudus (рис. 1).

Предварительное исследование состава липидов гонад C. japónica показало достаточно сложный состав каротиноидов (рис. 2). На пластинке отчетливо видны 4 группы окрашенных пятен (две желтых и две красно-оранжевых). С целью идентификации компонентов каротиноид-ной природы, обусловливающих окрашивание пятен, суммарный экстракт из гонад C. japónica был разделен методом колоночной хроматографии на силикагеле на группы окрашенных компонентов, различающихся по полярности. Результаты анализа полученных методом ВЭЖХ-МС фракций позволили установить наличие в гонадах C. japónica не менее семи каротиноидов (см. таблицу, рис. 3). На рис. 3 показаны наложенные хро-матограммы различных фракций, полученных после разделения исходных липидов C. japónica методом колоночной хроматографии на силикаге-ле. Нетрудно отметить, что наряду с близостью хроматографических параметров (время удерживания), которая обусловливает низкое качество разделения исследуемых соединений, спектральные характеристики, а именно максимумы поглощения разделяемых компонентов фракций и значения m/z их квазимолекулярных ионов, позволяют достоверно провести идентификацию всех исследуемых компонентов.

Кукумариаксантин С (9-цис-)

O

р-каротин

Рис. 1. Структуры каротиноидов C. japónica и S. nudus, идентифицированных методом ВЭЖХ-МС

Fig. 1. Structures of carotenoids identified in gonads of C. japónica and S. nudus by means of HPLC-MS

Рис. 2. ТСХ-анализ суммарных каротиноидов липидного экстракта из C. japonica. Элюент — «-гексан-диэтиловый эфир (1: 1), пятна на хроматограмме имеют желтую (а, в) и красно-оранжевую (б, г) расцветку

Fig. 2. TLC analysis of total carotenoids of lipid extract from C. japonica. n-Hexane-diethyl ether (1: 1) used as eluent. The spots on chro-matogram have yellow (а, в) and red-orange (б, г) colouring

Рис. 3. ВЭЖХ-МС-анализ (отклик масс-селективного детектора) каротиноидсодер-жащих фракций после колоночной хроматографии липидного экстракта из C. japonica (а, б, в, г — как на рис. 2): 1 — кукумариаксантин А (ди-цис-), 2 — кукумариаксантин А (ммоно-цис-), 3 — кукумариаксантин В (ди-цис-), 4 — кукумариаксантин С (ди-цис-), 5 — кукумариаксантин С (моно-цис-), 6 — кантаксантин, 7 — кантаксантин (моно-цис-)

Fig. 3. HPLC-MS analysis (total ion current) of carotenoid containing fractions after column chromatography of lipid extract from C. japonica (а, б, в, г — correspond to marked on Fig. 2): 1 — 9,9'-di-cis-cucumariaxanthin A, 2 — 9-cis-cucumariaxanthin A, 3 — 9,9'-di-cis-cucumariaxanthin B, 4 — 9,9'-di-cis-cucumariaxanthin C, 5 — 9-cis-cucumariaxanthin C, 6 — canthaxanthin, 7 — mono-cis-canthaxantin

Было установлено, что верхнее пятно на пластинке (см. рис. 2) представлено двумя изомерами кукумариаксантина А (ди-цис- и моно-цис-) (см. рис. 1), на что указывает состав отвечающей этому пятну фракции "а", определенный методом ВЭЖХ-МС — два пика на хроматограмме (рис. 3), квазимолекулярные ионы веществ, имеющие одинаковое значение m/z, равное 569 и соответствующее составу ионов [M+H]+ (см. таблицу). Различие в электронных спектрах в данном случае незначительное (см. таблицу, рис. 4), однако соотношение значе-

ний величин оптической плотности при "цас-плече" 326 нм и при длине волны с максимальным значением оптической плотности (432 нм для пика № 1 и 436 нм для пика № 2, рис. 4) для компонента, образующего пик №1, составило большее значение (0,137), чем для компонента, образующего пик № 2 (0,116). Это позволяет обозначить большее число двойных связей с цас-конфигурацией в молекуле компонента пика № 1, чем в молекуле компонента пика № 2, однако незначительное различие в полученных величинах, а также малые абсолютные значения полученных величин для обоих компонентов позволяют определить в их молекулах соответственно две и одну двойную связь в ^ас-конфигурации. Отмеченное обстоятельство для каротиноидов было описано ранее (Carotenoids, 1995; Lacker et al., 1999).

Спектральные характеристики идентифицированных методом ВЭЖХ-МС каротиноидов в гонадах C. japónica и S. nudus Spectral data of carotenoids identified by HPLC-MS method in gonads of C. japónica and S. nudus

Объект № Отнесение сигнала [M+H]+, A,max, нм

исследования пика* m/z

C. japónica 1 Кукумариаксантин А (ди-цис-) 569 326,388,406,432,460

2 Кукумариаксантин А (моно-цас-) 569 326,388,414,436,466

3 Кукумариаксантин В (ди-цис-) 571 328,394,416,438,468

4 Кукумариаксантин С (ди-цис-) 573 328,414,438,466

5 Кукумариаксантин С (моно-цас-) 573 328,412,436,464

6 Кантаксантин 565 472

7 Кантаксантин (моно-цас-) 565 364,464

S. nudus 1 Р-Эхиненон 551 464

2 Р-Каротин 537 425,451,482

* Нумерация пиков как на рис. 3 для C. japónica и рис. 4 для S. nudus.

Пятно, отмеченное на хроматограмме как "б" (см. рис. 2), соответствующее одноименной фракции каротиноидов, образовано двумя изомерами кантаксанти-на — полностью транс- и 9-цис- (см. рис. 1, 3). Пики № 6 и 7 соответствуют компонентам каротиноидной фракции, образующим при проведении ВЭЖХ-МС-анализа в режиме химической ионизации при атмосферном давлении квазимолекулярные ионы состава [М+Н]+ с одинаковым значением т/z, равным 565. Различия в электронных спектрах (рис. 3) указывают на то, что в молекуле компонента, элюирующегося ранее (пик № 6), все двойные связи находятся в транс-конфигурации — отсутствие "цас-плеча" при 364 нм, характерного для спектра 9-цас-кантаксантина е! а1., 1984). В электронном спектре компо-

нента, соответствующего пику № 7 (рис. 4), наблюдалось присутствие отмеченного выше ярко выраженного "цас-плеча", что позволило сделать вывод о наличии в структуре молекулы этого соединения одной цас-двойной связи.

Пятно, отмеченное на хроматограмме как "в" (см. рис. 2), соответствует кукумариаксантину В (ди-цас-) (см. рис. 1), на что указывают как результаты ВЭЖХ-МС-анализа данной фракции (значение т/z протонированного квазимолекулярного иона составило 571), так и электронный спектр исследуемого соединения (см. таблицу, рис. 4).

Пятно, отмеченное на хроматограмме как "г" (см. рис. 2), соответствует двум изомерам кукумариаксантина С (ди-цас- и моно-цас-) (см. рис. 1, 3). Это следует из сравнения результатов ВЭЖХ-МС-анализа данной фракции каротиноидов — значения т/z протонированных квазимолекулярных ионов, образованных искомыми соединениями, составили 573. Кроме того, на различия в конфигурациях двойных связей в молекулах этих соединений указывают различия в соотношениях значений оптической плотности на максимумах поглощения, соответствующих "цас-плечу" и максимальному значению оптической плотности. Эти соотно-

шения равны 0,266 для пика № 4 и 0,464 для пика № 5. Как было отмечено выше, большая величина этого соотношения указывает на большее число двойных связей в ^ас-конфигурации в молекуле каротиноида.

Рис. 4. УФ-спектры компонентов суммарных каротиноидов C. japónica, выделенных последовательно методами колоночной хроматографии на силикагеле и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Нумерация соответствует показанной на рис. 3

Fig. 4. UV-spectra of components of total carotenoids from gonads of C. japónica isolated sequentially by column chromatography on silica gel and reversed-phase HPLC. Numbering is shown on Fig. 3

Результаты исследования состава каротиноидов C. japónica соответствовали полученным ранее сведениям (Matsuno, Tsushima, 1995). Однако методический подход, несомненно, был усовершенствован, что позволило значительно сократить время, отводимое на идентификацию, и особенно на необходимый, в случае использования только УФ-детекторов, структурный анализ неизвестных каротиноидов.

Также была исследована возможность применения ВЭЖХ-МС для разделения и идентификации главных каротиноидов морского ежа 5. nudus. Результаты анализа (см. таблицу, рис. 5) позволили идентифицировать в липидном экстракте из гонад 5. пий^ Р-эхиненон и Р-каротин, на что указывают значения т/ протонированных квазимолекулярных ионов отмеченных каротиноидов — соответственно 551 и 537, а также характеристики электронных спектров, полностью соответствующие полученным ранее (Carotenoids, 1995). Однако ранее было показано, что применение метода химической ионизации при атмосферном давлении не позволяет получать сигналы с высокой интенсивностью полного ионного тока для молекул органических соединений, не имеющих в своих структурах полярных функциональных групп (Высоцкий и др., 2001). Действительно, на представленной на рис. 5 хроматограмме интенсивность сигнала, отвечающего Р~ каротину, оказалась много ниже интенсивности сигнала Р-эхиненона. Тем не менее известно, что содержание этих каротиноидов в гонадах 5. nudus не только оценивается одним порядком, но и является близким по значению (Borisovets et а1., 2002).

0 2 4 6 8 мин

Рис. 5. ВЭЖХ-МС-анализ смеси каротиноидов липидного экстракта из S. nudus (отклик масс-селективного детектора): 1 — ß-эхиненон и его УФ-спектр, 2 — ß-каротин и его УФ-спектр

Fig. 5. HPLC-MS analysis of mixture of carotenoids from S. nudus gonads (total ion current): 1 — ß-echinenone with UV-spectrum, 2 — ß-carotene with UV-spectrum

Из приведенного выше следует, что метод ВЭЖХ-МС может являться универсальным для идентификации каротиноидов, однако не всегда приемлем для их количественного определения. При этом указанный недостаток можно легко устранить, используя при проведении ВЭЖХ-анализа последовательное детектирование элюируемых компонентов смеси УФ- и масс-селективным детекторами.

Таким образом, показана возможность применения ВЭЖХ-МС для точной идентификации низкомолекулярных биорегуляторов каротиноидной природы в морских иглокожих. Определены условия для предварительного фракционирования каротиноидов и последующего их анализа методом ВЭЖХ-МС. Метод, включая фракционирование и последующий анализ, был апробирован для

исследования состава каротиноидов в гонадах двух видов морских иглокожих — Cucumaria japónica и Strongylocentrotus nudus.

Литература

Высоцкий В.И., Рыбин В.Г., Слабко О.Ю. и др. Использование ВЭЖХ-масс-спектрометрии в анализе биологически активных веществ из морских источников // Изв. ТИНРО. — 2001. — Т. 129. — С. 52-61.

Гордон Ф., Форд Р. Спутник химика. — М.: Мир, 1976. — 541 с.

Bendich A., Olson J.A. Biological actions of carotenoids // FASEB J. — 1989. — Vol. 3. — P. 1927-1932.

Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. Physiol. — 1959. — Vol. 37. — P. 911-917.

Borisovets E.E., Zadorozhny P.A., Kalinina M.V. et al. Changes of major carotenoids in gonads of sea urchins (Strongylocentrotus intermedius and S. nudus) at maturation // Comparative Biochem. Physiol. B. — 2002. — Vol. 132. — P. 779-790.

Carotenoids / E ds. G .Britton, S .Liaaen-Jensen, H .Pfander. — Vol. 1B. — B.: Birkhaus-er Verlag, 1995. — 360 p.

Lacker T., Strohschein S., Albert K. Separation and identification of various carotenoids by C30 reversed-phase high-performance liquid chromatography coupled to UV and atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometric detection // J. Chroma-tography. — 1999. — Vol. 854. — P. 37-44.

Matsuno T. Xanthophylls as precursors of retinoids // Pure Appl. Chem. — 1991. — Vol. 63, № 1. — P. 81-88.

Matsuno T., Tsushima M. Comparative biochemical studies of carotenoids in sea cucumbers // Comp. Biochem. Physiol. B. — 1995. — Vol. 111, № 4. — P. 597-605.

Nelis H.J.C.F., Lavens P., Moens L. et al. Cis-canthaxanthins unusual carotenoids in the eggs and the reproductive system of female brine shrimp Arthemia // J. Biol. Chem. — 1984. — Vol. 259, № 10. — P. 6063-6066.

Pfander H., Riesen R., Niggli U. HPLC and SFC of carotenoids — scope and limitations // Pure Appl. Chem. — 1994. — Vol. 66, № 5. — P. 947-954.

Tsushima M., Fujiwara Y., Matsuno T. Novel marine di-Z-carotenoids: cucumar-iaxanthins A, B, and C from the sea cucumber Cucumaria japonica // J. Nat. Prod. — 1996. — Vol. 59, № 1. — P. 30-34.

Поступала в редащаю 31.10.03 г.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.