CC BY
40
Известия ТИНРО
2009 Том 159
ТЕХНОЛОГИЯ ОБРАБОТКИ ГИДРОБИОНТОВ
УДК 577.115:593.96
В.Г. Рыбин1, К.Г. Павель1, Г.Н. Тимчишина1, А.Е. Карлина2*
1 Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр, 690091, г. Владивосток, пер. Шевченко, 4;
2 ООО "Биополимеры", 692856, Приморский край, г. Партизанск, ул. Кутузова, 60
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИПИДОВ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ ГОЛОТУРИЙ CUCUMARIA JAPONICA И C. OKHOTENSIS
Представлены результаты исследования состава липидов дальневосточных видов голотурий Cucumaria japónica и C. okhotensis, включая жирные кислоты, 1-О-алкилглицериловые эфиры и каротиноиды. В липидах обоих видов обнаружено высокое содержание 12-метилтетрадекановой кислоты и эйкозапентаеновой кислоты (соответственно до 18,5 и 30,0 % от суммы жирных кислот). Установлены межвидовые различия в составе и содержании 1-О-алкилглицериловых эфи-ров. Показано, что некоторые алкильные радикалы этих липидов содержат разветвленные углеводородные фрагменты и отношение содержания 1-О-алкилглице-риловых эфиров с линейными насыщенными углеводородными радикалами к содержанию 1-О-алкилглицериловых эфиров с разветвленными насыщенными углеводородными радикалами может служить признаком вида (1,53 для C. okhotensis и 0,55 для C. japonica). Состав каротиноидов C. okhotensis отличается от такового C. japonica отсутствием кукумариаксантина С и наличием группы полярных полигидроксилированных каротиноидов.
Ключевые слова: кукумария, жирные кислоты, каротиноиды, 1-О-алкил-глицериловые эфиры.
Rybin V.G., Pavel K.G., Timchishina G.N., Karlina A.E. Comparative characteristic of lipids from the Far-Eastern holothurians Cucumaria japonica and C. okhotensis // Izv. TINRO. — 2009. — Vol. 159. — P. 312-324.
Composition of lipids in tissues from two holothurian species (Cucumaria japonica and C. okhotensis) is investigated, including the content of fatty acids, 1-O-alkylglyc-erol ether lipids, and carotenoids. The high content of 12-methyltetradecanoic acid and eicosapentaenoic acid (up to 18.5 % and 30.0 % of total fatty acids, respectively) is revealed in the lipids from both species. Species specific difference is determined for the content of 1-O-alkylglycerols ether lipids. Some alkyl radicals of the 1-O-alkylglyc-
* Рыбин Вячеслав Григорьевич, кандидат биологических наук, доцент, заведующий аналитическим научно-испытательным центром, e-mail: [email protected]; Павель Константин Геннадьевич, кандидат химических наук, старший научный сотрудник, e-mail: [email protected]; Тимчишина Галина Николаевна, кандидат технических наук, доцент, старший научный сотрудник, e-mail: timchishgalnikol@ rambler.ru; Карлина Анастасия Евгеньевна, заведующая производством, e-mail: [email protected].
erol ether lipids molecules contain branched hydrocarbon chains. The ratio between the content of linear and branched saturated 1-O-alkylglycerols ether lipids is 1.53 for C. okhotensis and 0.55 for C. japónica. Composition of the carotenoids from C. okhotensis differs from that from C. japónica by absence of cucumariaxanthin C and presence of the group of polar polyhydroxylated carotenoids.
Key words: cucumaria, fatty acid, carotenoid, 1-O-alkylglycerol ether lipids.
Введение
Важной задачей рыбообрабатывающей отрасли России являются освоение новых объектов промысла и рациональное использование водных биоресурсов за счет комплексной переработки сырья.
Один из перспективных видов гидробионтов — кукумария, запасы которой находятся на достаточно высоком уровне.
До недавнего времени в северной части Тихого океана были известны три вида голотурий рода Cucumaria — C. japonica, C. diakonovi и C. savelijeva (Баранова, 1980). В последние годы появились описания новых видов этого рода — C. lamberti, C. conicospermium, C. anivaensis, C. okhotensis (Левин, Гудимова, 1998; Левин, Степанов, 2002; Левин, 2003, 2004).
C. japonica, как основной промысловый вид, изучена достаточно подробно (Тимчишина, 1999), предложен ряд технологических решений, позволяющих получить из этого сырья пищевую продукцию, а также биологически активные добавки к пище (Тимчишина, Павель, 2002). Известно, что мышечная ткань и внутренние органы голотурий рода Cucumaria содержат биологически активные аминосахара, аминокислоты, минеральные вещества; отличительной особенностью является наличие в тканях кукумарии тритерпеновых гликозидов, проявляющих различное биологическое действие (Калинин, 1994; Avilov et al., 2000; Тимчишина, 2003). Однако обобщенных данных по липидному составу тканей и органов представителей данного рода в литературе нами не обнаружено. Проводились отдельные частные исследования, например определение состава жирных кислот (Svetashev et al., 1991) общих липидов, однако использовались единичные особи этих гидробионтов, что не позволяет дать полную характеристику даже по отмечаемому показателю. Также исследовался состав каротиноидов (Matsuno, Tsushima, 1995; Tsushima et al., 1996), однако результаты этих работ тоже не позволяют выявить общую картину, характеризующую этот показатель состава липидов. Литературные данные о липидной составляющей C. okhotensis, имеющей промысловое значение для Дальневосточного региона, в настоящее время не имеют системного характера.
Исходя из этого целью исследования было сравнительное изучение состава липидов тканей двух видов кукумарии.
Материалы и методы
Голотурии были собраны в летний период, C. japonica — в зал. Петра Великого, C. okhotensis — в бухте Левачева Охотского моря.
Для анализа жирных кислот общие липиды экстрагировали из внутренностей и тушки обоих видов кукумарии по отдельности. Экстракцию проводили методом Блайя и Дайера (Bligh, Dyer, 1959). Липиды конвертировали в метиловые эфиры жирных кислот по известной методике (Carreau, Dubacq, 1978) и очищали препаративной тонкослойной хроматографией (ТСХ) на стеклянных пластинках с силикагелем (Merck Co., Ltd, Германия, 5 мкм) с использованием бензола в качестве элюента.
Для анализа 1-0-алкилглицериловЫ1Х эфиров общие липиды экстрагировали из суммарных тканей тушки с внутренностями (далее по тексту — суммарных тканей) обоих видов кукумарии. Экстракцию проводили методом Блайя и Дайера (Bligh, Dyer, 1959). Липиды анализировали ТСХ на хромародах Chromarod-
SIII (Yanaco, Япония) с использованием в качестве элюента системы растворителей н-гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (50,0 : 50,0 : 0,1). Количественный анализ выполняли на пламенно-ионизационном детекторе Iatroscan TH-10 (Yanaco, Япония). Гидролиз липидов проводили при рН 12 в системе растворителей этанол-вода (1 : 1) при температуре кипения с обратным холодильником в течение 1 ч. Неомыляемые компоненты экстрагировали системой растворителей н-гексан-диэтиловый эфир (1 : 1) три раза. Фракция 1-О-алкилглицериловых эфиров была выделена препаративной ТСХ на стеклянных пластинках с силика-гелем (Merck Co., Ltd, Германия, 5 мкм) с использованием в качестве элюента системы растворителей н-гексан-диэтиловый эфир (1 : 1) и конвертирована в триметилсилиловые эфиры реакцией с ^,0-ди(триметилсилил)-трифторацетами-дом (BSTFA, Sigma, США) в пиридине при температуре 25 оС в течение 1 ч. Триметилсилиловые производные 1-О-алкилглицериловых эфиров очищали препаративной ТСХ на стеклянных пластинках с силикагелем (Merck Co., Ltd, Германия, 5 мкм) с использованием бензола в качестве элюента.
Для анализа каротиноидов экстракцию липидов проводили из суммарных тканей обоих видов кукумарии методом Блайя и Дайера (Bligh, Dyer, 1959). Полученные экстракты сушили над безводным сульфатом натрия и упаривали в вакууме до постоянной массы при температуре 30-35 оС. Сухие липиды разделяли колоночной хроматографией на силикагеле L Chemapol (Чехия) (40-100 мкм). На колонку, заполненную суспензией 15 г сорбента в 60 мл н-гексана, наносили 0,5 г сухой смеси липидов. Элюировали системой растворителей н-гексан-диэти-ловый эфир (1 : 1). Фракции собирали и анализировали ТСХ. Фракции, содержащие близкие по значениям Rf компоненты, сушили над безводным сульфатом натрия, упаривали до постоянной массы в вакууме при температуре 35 оС и растворяли в этаноле. Полученные растворы запаивали в ампулы и хранили до момента исследования при температуре минус 18 оС. ТСХ каротиноидов проводили на пластинках с закрепленным слоем силикагеля Silufol UV254 (Kavalier, Чехия). Элюировали системой растворителей н-гексан-диэтиловый эфир (1 : 1). Для обнаружения неокрашенных соединений пластинки обрабатывали опрыскиванием 10 %-ным раствором фосфорно-молибденовой кислоты в этаноле с последующим подогревом пластинок до 100 оС.
Хромато-масс-спектрометрический анализ триметилсилиловых производных 1-О-алкилглицериловых эфиров проводили на газовом хроматографе CP-3800 с масс-детектором 1200L (Varian, США), оснащенным пламенно-ионизационным детектором (для количественного анализа) и колонкой VF-5MS (30,0 м х 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм, Varian, США). Для регистрации масс-спектрометрического сигнала использовали квадрупольный масс-анализатор. В качестве газа-носителя использовали гелий со скоростью потока 1 мл/ мин и делителем потока 1 / 50. Все спектры были получены при энергии ионизации 70 эВ и температуре ионного источника 200 оС. Температура инжектора и пламенно-ионизационного детектора составляла 250 оС. Анализ проводили в режиме температурного градиента: 50 oC (20 мин) — 10 oC/ мин — 200 oC (20 мин) — 10 °С/мин — 250 oC (180 мин).
Газо-жидкостную хроматографию метиловых эфиров жирных кислот проводили на хроматографе GC-16A (Shimadzu, Япония) с использованием колонки Supelcowax™ 10 (30,0 м х 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм, Supelco, США) и пламенно-ионизационного детектора при температуре колонки 190 оС и температуре инжектора и детектора 220 оС. В качестве газа-носителя использовали гелий со скоростью потока 1 мл/мин и делителем потока 1/60. Идентификацию проводили с использованием ECL (Christie, 1988). Количественный анализ проводили по значениям площадей пиков на базе обработки данных Chromatopac C-R4AX (Shimadzu, Япония).
Газо-хроматографический анализ метиловых эфиров жирных кислот с масс-спектрометрическим детектированием проводили на хроматографе HP6890
GC/MSD 5973 (Hewlett-Packard, США), оснащенным квадрупольным масс-ана-лизатором и колонкой HP-5MS (30,0 м х 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм, Hewlett-Packard, США). В качестве газа-носителя использовали гелий со скоростью потока 1 мл/мин и делителем потока 1/60. Все спектры были получены при энергии ионизации 70 эВ и температуре ионного источника 245 оС. Температура инжектора составляла 230 оС. Анализ проводили в режиме температурного градиента: 125 oC (1 мин) — 5 0С/мин — 230 oC (20 мин).
Высокоэффективную жидкостную хроматографию каротиноидов с УФ- и масс-селективным детектированием проводили на хроматографе ProStar 210 c масс-спектрометрическим детектором 1200L (Varian, США) и детектором на диодной матрице SPD-M6A (Shimadzu, Япония). Разделение осуществляли на колонке Shim-Pack FLC-ODS (50,0 мм х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм) при 55 оС. В качестве элюента использовали ацетонитрил со скоростью элюирования 0,5 мл/мин. Диапазон детектируемых масс составил 200-1000 Да. Использовалась химическая ионизация при атмосферном давлении, режим регистрации отрицательных ионов. Напряжение ионного источника 4 кВ. Поток газа-осушителя (азот) — 6 л/мин, давление газа-распылителя (воздух) — 22 кПа. Хроматографический сигнал регистрировался УФ- и масс-спектрометрическим детекторами одновременно. Все УФ-спектры записывались с использованием детектора на диодной матрице.
Результаты количественного анализа обрабатывали с помощью программы Statistica 5.5 (Statsoft, США).
Результаты и их обсуждение
Технохимическая характеристика
Известно, что массовый состав исследуемых видов кукумарии составляет: мускульная оболочка (тушка) — 21,5-39,1 %; внутренности — 30,9-43,9; щупальца — 3,7-8,0; внутриполостная жидкость — 21,0-31,5 % (Акулин и др., 2005).
Известно также (Тимчишина, Афанасьева, 2003а), что выход тушки C. japonica выше, чем C. okhotensis, а выход внутренностей выше у последней (табл. 1).
Таблица 1
Массовый состав C. okhotensis и C. japonicа, среднее ± g, %
Table 1
Fractional composition of C. okhotensis and C. japonicа tissues, average ± g, %
Вид Тушка Внутренности Щупальца Внутриполостная жидкость
C. okhotensis 25,3 ± 3,8 40,8 ± 3,1 4,7 ± 4,0 29,2 ± 2,3
C. japonica 34,8 ± 4,3 34,3 ± 3,4 6,8 ± 4,2 24,1 ± 3,1
Тушка C. japonica содержит 87,6-88,8 % воды, 8,0-9,1 белка, 0,3-0,4 ли-пидов и 2,6-3,0 % минеральных веществ, C. okhotensis менее обводнена и содержит 87,0-87,6 % воды, 7,7-8,3 белковых веществ, минеральных веществ — 3,5-4,1, содержание липидов превышает вдвое содержание таковых в тканях C. japonica и составляет 0,7-0,9 %.
По сравнению с тушкой во внутренностях обоих видов кукумарии больше липидов (табл. 2) (Тимчишина, Афанасьева, 2003б).
Таблица 2
Химический состав внутренностей кукумарии, среднее ± о, %
Table 2
Chemical composition of internal organs for cucumaria, average ± g, %
Вид Вода Липиды Белок Минеральные вещества
C. okhotensis 87,1 ± 0,3 2,2 ± 0,2 4,4 ± 0,7 6,3 ± 0,4
C. japonica 88,9 ± 0,4 2,6 ± 0,1 4,0 ± 0,9 3,4 ± 0,2
Соотношение классов липидов целой кукумарии по данным литературы (Сав-ватеева, 1983) представлено в табл. 3.
Таблица 3
Соотношение классов липидов кукумарии, %
Table 3
Ratio of lipid classes for cucumaria, %
Класс липидов C. japonica
Фосфолипиды 20,1
Нейтральные липиды 79,9
В том числе
Моноглицериды 9,1
Холестерин 4,4
Диглицериды 1,9
Свободные жирные кислоты 7,3
Триглицериды 44,9
Эфиры стеринов 12,3
Состав жирных кислот
Биологическая активность липидов зависит от ряда факторов, в том числе и от состава жирных кислот липидов, представленных в омыляемой фракции. Для получения полной картины был исследован состав жирных кислот липидов обоих видов кукумарии.
Установлено, что состав жирных кислот общих липидов тканей исследованных видов кукумарии характерен для морских гидробионтов, а именно: характеризуется высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот n-3 семейства, в частности эйкозапентаеновой кислоты 20:5n-3 (до 30 %, табл. 4), обладающей широко известными диетологическими показателями и противовоспалительными свойствами. Кроме того, было обнаружено высокое содержание 12-метилтетрадекановой кислоты (до 18,5 %, табл. 4), обладающей уникальной биологической активностью, в частности выраженным противовоспалительным действием за счет ингибирования 5-липоксигеназы (Yang et al., 2003), усилением действия пенициллиновых антибиотиков за счет ингибирования ß-лактамазы (Song et al., 1981). В связи с этим возникла необходимость проведения дополнительной структурной идентификации данного соединения, которую осуществляли с использованием масс-спектрометрии.
Таблица 4
Состав жирных кислот липидов различных тканей двух видов Cucumaria, % от общего содержания жирных кислот
Table 4
Fatty acids composition for certain tissues from two Cucumaria species, % of total fatty acids content
Жирные C. japonica C. okhotensis
кислоты Тушка Внутренности Тушка Внутренности
14:0 1,1 ± 0,1 3,9 ± 0,3 2,8 ± 0,4 4,5 ± 0,8
TMTD < 0,1 0,1 ± 0,0 < 0,1 0,2 ± 0,0
i-15:0 0,2 ± 0,0 0,7 ± 0,1 0,1 ± 0,0 0,9 ± 0,1
ai-15:0 3,3 ± 0,3 17,7 ± 0,8 3,8 ± 0,4 11,9 ± 1,0
15:0 1,2 ± 0,2 2,4 ± 0,3 1,0 ± 0,1 1,6 ± 0,6
i-16:0 0,9 ± 0,1 1,7 ± 0,3 1,0 ± 0,1 2,2 ± 0,6
ai-16:0 0,8 ± 0,2 1,0 ± 0,0 0,5 ± 0,0 0,5 ± 0,0
16:0 2,9 ± 0,2 3,3 ± 0,2 4,2 ± 0,8 2,3 ± 0,4
ai-17:0 0,8 ± 0,1 0,6 ± 0,1 1,1 ± 0,4 1,0 ± 0,1
17:0 0,4 ± 0,1 1,1 ± 0,2 0,4 ± 0,0 0,2 ± 0,0
ai-18:0 6,0 ± 0,4 1,6 ± 0,2 3,8 ± 0,8 1,7 ± 0,3
Окончание табл. 4
Table 4 finished
Жирные C. japónica C. okhotensis
кислоты Тушка Внутренности Тушка Внутренности
18:0 2,4 ± 0,3 3,2 ± 0,4 3,4 ± 0,8 3,3 ± 0,6
19:0 0,3 ± 0,1 0,1 ± 0,0 0,4 ± 0,0 0,2 ± 0,0
20:0 6,0 ± 0,3 0,4 ± 0,0 4,1 ± 1,1 0,8 ± 0,1
22:0 0,4 ± 0,1 0,2 ± 0,0 0,6 ± 0,0 0,8 ± 0,1
Разветвленные
насыщенные 12,0 ± 1,2 23,4 ± 1,7 10,3 ± 1,8 18,4 ± 2,2
Насыщенные 26,7 ± 2,6 38,0 ± 3,2 27,2 ± 4,0 32,1 ± 3,8
15 1 < 0,1 0,1 ± 0,0 < 0,1 0,2 ± 0,0
16 1n-7 3,8 ± 0,5 12,5 ± 1,0 6,2 ± 0,6 12,7 ± 0,9
16 1n-5 < 0,1 0,3 ± 0,0 0,1 ± 0,0 0,3 ± 0,0
17 1 0,4 ± 0,1 1,0 ± 0,1 0,5 ± 0,0 0,8 ± 0,0
18 1 n-9 1,1 ± 0,3 4,4 ± 0,4 1,6 ± 0,3 2,8 ± 0,5
18 1 n-7 1,9 ± 0,3 2,2 ± 0,2 2,4 ± 0,5 2,8 ± 0,4
19 1 n-9 < 0,1 0,2 ± 0,0 0,2 ± 0,0 0,2 ± 0,0
20 1n-11 < 0,1 0,7 ± 0,0 < 0,1 0,5 ± 0,0
20 1 n-9 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0,0 0,3 ± 0,0 0,3 ± 0,0
20 1 n-7 < 0,1 0,1 ± 0,0 < 0,1 0,1 ± 0,0
22 1n-11 2,4 ± 0,2 < 0,1 1,4 ± 0,4 < 0,1
23 1 n-9 13,1 ± 0,4 1,0 ± 0,1 7,7 ± 0,9 2,2 ± 0,5
Мононенасыщенные 23,2 ± 2,1 23,0 ± 1,9 20,4 ± 2,8 22,9 ± 2,4
16:2n-4 0,8 ± 0,1 1,0 ± 0,1 < 0,1 1,1 ± 0,2
17:2 < 0,1 1,6 ± 0,1 0,2 ± 0,0 1,7 ± 0,3
18:2n-6 6,4 ± 0,1 2,8 ± 0,5 1,4 ± 0,4 1,5 ± 0,3
20:2n-6 3,4 ± 0,1 0,5 ± 0,0 1,9 ± 0,5 0,4 ± 0,0
22:2 < 0,1 0,5 ± 0,0 < 0,1 < 0,1
18:3n-6 < 0,1 0,4 ± 0,0 < 0,1 < 0,1
18:3n-3 0,3 ± 0,0 8,8 ± 0,8 0,2 ± 0,0 3,7 ± 0,6
18:4n-3 0,7 ± 0,1 2,2 ± 0,3 0,7 ± 0,0 1,2 ± 0,3
20:3n-9 1,1 ± 0,2 0,1 ± 0,0 2,0 ± 0,4 0,3 ± 0,0
20:3n-6 1,0 ± 0,1 0,1 ± 0,0 0,5 ± 0,0 < 0,1
20:4n-6 7,6 ± 0,4 0,3 ± 0,0 5,6 ± 0,8 0,8 ± 0,1
20:4n-3 0,3 ± 0,0 0,3 ± 0,0 0,5 ± 0,0 0,2 ± 0,0
20:5n-3 21,7 ± 1,5 15,4 ± 1,1 28,4 ± 1,6 22,3 ± 1,2
22:5n-3 < 0,1 0,6 ± 0,0 0,2 ± 0,0 0,3 ± 0,0
22:6n-3 1,4 ± 0,1 1,8 ± 0,5 1,8 ± 0,8 2,5 ± 0,5
Полиненасыщенные 44,7 ± 2,0 36,4 ± 2,6 43,4 ± 4,6 36,0 ± 3,6
Примечание. TMTD — 4,8,12-триметилтридекановая кислота; i — изо; ai — анте-изо.
На масс-спектре (рис. 1) отчетливо виден пик молекулярного иона с величиной m/z 256, соответствующий метиловому эфиру насыщенной жирной кислоты с 15 атомами углерода в цепи. Анализ фрагментации этого иона показал, что сигнал иона с m/z 199 (25 % интенсивности) более интенсивный, чем сигнал иона с m/z 227 (5 % интенсивности). Данное обстоятельство свидетельствует в пользу элиминирования из молекулярного иона структурного фрагмента состава [CH3-CH2-CH-CH3]+ и, следовательно, наличия в его структуре анте-изо-разветвления (положение метильной группы при 12-м атоме углерода). Масс-спектр данного компонента отличался от масс-спектра метилового эфира пента-декановой кислоты, являющегося его изомером, что согласуется с литературными данными (Christie, 2003). Кроме того, в состав жирных кислот липидов тканей C. japónica и C. okhotensis входила 92-трикозеновая кислота, являющаяся маркерной для всех голотуриевых (Kaneniwa et al., 1986). Ранее нами были установлены межвидовые различия C. okhotensis и C. japonica по составу жирных кислот липидов внутренних органов и тушки (Rybin et al., 2007).
Рис. 1. Масс-спектр метилового эфира 12-метилтетрадекановой кислоты
Fig. 1. Mass-spectrum of 12-methyltetradecanoic acid
Состав моноалкилдиацилглицеридов
Известно, что 1-О-алкилглицериловые эфиры, а также их этерифицирован-ные производные характеризуются высокой биологической активностью, связанной с уникальными структурными особенностями этого класса липидов, например, они являются важными кофакторами клеточного роста (Hallgren, Larsson, 1962), вовлекаются в транспорт ионов (Driedzic et al., 1976), обладают антимикробным действием и влияют на биосинтез глицеролипидов (Smith, Djerassi, 1987). Анализ состава липидов суммарных тканей до проведения гидролиза показал высокое содержание моноалкилдиацилглицеридов (25-27 % от общих липидов для обоих видов). После проведения гидролиза сложноэфирных связей и дальнейшего силилирования свободных гидроксильных групп в образовавшихся молекулах О-алкиловых эфиров глицерина был проведен анализ полученных смесей методом газо-жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГЖХ-МС). Результаты анализа показали наличие в смесях силили-рованных эфиров глицерина. Сравнение полученных спектральных данных с данными для триметилсилиловых эфиров батилового и селехилового спиртов, а также с данными для 1-О-алкил-2,3-ди-О-TMS-глицериловых эфиров (Christie, 2003), 2-O-алкил-1,3-ди-O-TMS-глицеринов и ди- и три-O-алкил-TMS-глицериловых эфиров (Egge, 1983) показало, что анализируемая смесь содержит только 1-О-алкил-2,3-ди-О-TMS-глицериловые эфиры. Хроматограммы и отнесения углеводородных радикалов О-алкилглицериловых эфиров показаны соответственно на рис. 2 и в табл. 5.
Отнесение сигналов пиков 1, 3, 6-8, 10 и 15 со структурами разветвленных насыщенных радикалов в молекулах 1-О-алкил-2,3-ди-О-TMS-глицериловых эфиров было проведено на основании сигналов ионов составов [M-103]+, [M-117]+ и [M-133]+, соответствующих элиминированию фрагмента OTMS и алкильного радикала при третичном атоме углерода. Высокие интенсивности ионов [M-103]+ и [M-117]+ соответствовали структурам изо- и анте-изо-радикалов. Высокая интенсивность иона состава [M-133]+ наблюдалась только в спектре 1-О-алкил-2,3-ди-О-TMS-глицерилового эфира с 13-метилгексадециловым радикалом. В спектрах структур с линейными насыщенными радикалами (пики 2, 5, 9, 14, 17, 19)
318
Рис. 2. Фрагмент хроматограммы ГЖХ-МС анализа 1-0-алкил-2,3-ди-0-TMS-глицериловых эфиров липидов суммарных тканей C. japónica (а) и C. okhotensis (б). Отнесение сигналов отмеченных пиков показано в табл. 5. Минорные и неидентифицированные компоненты не отмечены
Fig. 2. Fragment of GC-MS chro-matogram for the 1-O-alkyl-2,3-di-O-TMS-glycerol ethers from lipids of C. japonica (a) and C. okhotensis (б). Assignments of marked peaks are shown in Table 5. Minor and unknown peaks are not marked
Таблица 5
1-О-алкилглицериловые эфиры липидов суммарных тканей C. okhotensis и C. japonica, % от общего содержания 1-О-алкилглицериловых эфиров и отнесения сигналов
Table 5
1-O-alkylglycerol ether lipids from C. okhotensis and C. japonica, % of total ether lipid content and signal assignments
Углеводородный C. japonica C. okhotensis Отношение содержания радикал_№ пика %_№ пика %_(C. japónica/C. okhotensis)
ai-15:0 1 7,1 1 3,1 2,30
15:0 2 1,9 2 6,3 0,30
i-16:0 3 34,4 3 22,2 1,55
16:1 4 4,2 4 2,2 1,90
16:0 5 16,1 5 28,7 0,60
17:0-br 6 2,0 6 0,6 3,30
ai-17:0 7 2,5 7 1,3 1,90
i-17:0 8 5,3 8 6,5 0,80
17:0 9 1,6 9 3,3 0,50
i-18:0 10 1,0 10 0,8 1,25
18:1 11 5,8 11 3,1 1,90
18:1 12 5,2 12 2,4 2,20
18:1 13 0,6 13 1,0 0,60
18:0 14 8,9 14 14,4 0,60
i-19:0 15 0,3 15 0,6 0,50
19:1 16 < 0,1 16 0,3 < 0,30
19:0 17 0,3 17 0,5 0,60
20:1 18 1,6 18 0,7 2,30
20:0 19 < 0,1 19 0,6 < 0,20
Линейные
насыщенные 28,9 53,8 0,50
Разветвленные
насыщенные 52,6 35,1 1,50
Ненасыщенные 17,5 9,7 1,80
Примечание. Нумерация пиков показана на рис. 2; ai — анте-изо; i — изо; 17:0-br — 13-метилгексадецил.
также присутствовал фрагментный ион состава [M-103]+, однако во всех случаях ион [M-90]+ (M-OTMS) имел низкую интенсивность по сравнению со структурами с разветвленными радикалами (рис. 3).
Рис. 3. Характеристическая область масс-спектров 1-О-алкил-2,3-ди-О-TMS-глице-риловых эфиров с углеводородными радикалами: 13-метилгексадецил (а), 14-метилгек-садецил (б), 15-метилгексадецил (в) и н-гептадецил (г)
Fig. 3. Characteristic range of mass spectra for the 1-O-alkyl-2,3-di-O-TMS-glycerol ethers with 13-methyl-hexadecyl radical (a), 14-methyl-hexadecyl radical (б), 15-methyl-hexadecyl radical (в), and n-heptadecyl radical (г)
В спектре силилированного батилового спирта (Christie, 2003) и спектрах пиков 1-3, 5-10, 14, 15, 17, 19 наблюдался основной пик с m/z 205, характеризующий общее сходство распада этих соединений. Спектры ненасыщенных соединений характеризовались сходными сигналами алкильных ионов с m/z 41, 55, 69 и 83. Кроме того, наблюдался основной ион с m/z 205, так же как и в спектре силилированного селехилового спирта, однако молекулярные ионы в спектрах ненасыщенных соединений не обнаруживались, что соответствует литературным данным (Bordier et al., 1996). Процентные соотношения 1-О-алкил-2,3-ди-0-TMS-глицериловых эфиров были определены в результате их ГЖХ-ана-лиза с использованием пламенно-ионизационного детектора. Данные, представленные в табл. 5, показывают высокое содержание 1-О-алкилглицериловых эфиров с линейными насыщенными и разветвленными насыщенными углеводородными радикалами.
Можно отметить, что соотношение содержания 1-О-алкилглицериловых эфиров с линейными и разветвленными углеводородными радикалами составляет 1,53 для C. okhotensis, в то время как для C. japonica эта величина имеет обратное значение и составляет 0,55. Таким образом, этот показатель может являться видовым признаком. Некоторые другие различия показаны в табл. 5.
Состав каротиноидов
Каротиноиды морских гидробионтов, в том числе кукумарии, обладают высокой биологической активностью (Matsuno, 1991; Matsuno, Tsushima, 1995; Tsushima et al., 1996), в связи с чем также являлись объектом нашего исследования.
Особенностью состава каротиноидов липидов голотурий рода Cucumaria является наличие специфических представителей данного класса липидов — это метаболиты кукумариаксантина. Ранее (Рыбин и др., 2003) было показано, что в состав каротиноидов C. japónica входят все три метаболита кантаксантина. C. okhotensis является более северным видом и обитает в водах, имеющих состав микрофлоры, отличный от среды обитания C. japónica. Поэтому следовало ожидать заметных различий в составах каротиноидов липидов этих видов голотурий. В результате проведенных исследований был установлен состав главных каротиноидов липидов из тканей внутренних органов C. okhotensis (рис. 4).
Рис. 4. Структуры суммарных каротиноидов тканей C. okhotensis, обнаруженных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым (УФ) и масс-селективным (МС) детектированием
Fig. 4. Structures of total carotenoids for lipids from C. okhotensis found by HPLC-UV-MS method
Предварительное исследование состава суммарных тканей липидов C. okhotensis показало достаточно сложную композицию каротиноидов (рис. 5). На пластинке отчетливо видны 5 групп окрашенных (три желтых и две красно-оранжевых) пятен. С целью идентификации компонентов каротиноидной природы, обусловливающих окрашивание пятен, суммарный экстракт тканей C. okhotensis был разделен колоночной хроматографией на силикагеле на группы окрашенных компонентов, различающихся по полярности. Результаты ВЭЖХ-анализа полученных фракций позволили установить наличие в суммарных липидах внутренних органов C. okhotensis не менее пятнадцати компонентов каротиноидной природы (табл. 6).
Рис. 5. ТСХ-анализ суммарных каротиноидов липидно-го экстракта из C. okhotensis (слева) и C. japonica (справа). Элюент н-гексан-диэтиловый эфир (1 : 1), пятна на хромато-грамме желтого (а, в, г) и красно-оранжевого (б, д) цвета
Fig. 5. TLC-analysis of total carotenoids for lipid extract from C. okhotensis (left) and C. japonica (right). The n-hex-ane-diethyl ether (1 : 1) is used as developed solvents system. Spots on plate have yellow (а, в, г) and red-orange (б, д) coloring
Таблица 6
Спектральные характеристики каротиноидов, идентифицированных методом ВЭЖХ-УФ-МС в тканях C. okhotensis
Table 6
Spectral data of carotenoids from C. okhotensis tissues identified _by HPLC-UV-MS method_
Соединение Фракция ТСХ на рис. 5 [M-H]-, m/z к , max нм
Кукумариаксантин А (ди-цис-) а 567 432
Кантаксантин б 563 472
Кукумариаксантин В (ди-цис-) в 569 434
Производные ß-каротина д 557 457
д 605 453
д 649 457
Производные ß-эхиненона д 597 469
Производные кукумариаксантинов д 623 410
557 432
Было установлено, что верхнее пятно ("а") на пластинке (рис. 5) обусловлено наличием кукумариаксантина А (ди-цис-) (табл. 6, рис. 4), на что указывает состав фракции, отвечающей этому пятну, определенный методом ВЭЖХ-УФ-МС, депротонированный молекулярный ион имел значение m/z, равное 567.
Пятно, отмеченное на хроматограмме как "б" (см. рис. 5), соответствует полностью транс-кантаксантину (табл. 6, рис. 4). Депротонированный молекулярный ион имел значение m/z, равное 563.
Пятно "в" (см. рис. 5) соответствует ди-цис- кукумариаксантину В (табл. 6, рис. 4), значение m/z депротонированного молекулярного иона составило 569.
Результаты исследования состава каротиноидов C. okhotensis показали некоторое отличие от состава каротиноидов C. japonica (Рыбин и др., 2003), заключающееся прежде всего в отсутствии среди каротиноидов C. okhotensis кукумариаксантина С (пятно "г" на хроматограмме, рис. 5). Наличие других идентифицированных каротиноидов — изомеров кукумариаксантина А, кукумариаксантина В и кантак-сантина — характерно для обоих видов. Кроме того, была обнаружена группа поли-гидроксилированных каротиноидов, производных кукумариаксантинов, ß-каротина и ß-эхиненона (рис. 5, д, табл. 6, рис. 6). Данный вывод был сделан на основании величины максимума поглощения (длина цепи сопряжений хромофора), формы электронного спектра (наличие либо отсутствие сопряженной карбонильной группы, наличие либо отсутствие "цис-плеча" — цис-/транс-изомеры), а также характера масс-спектров и значения установленных молекулярных масс (наличие определенного числа свободных гидро-ксильных групп, наличие карбонильных групп).
Рис. 6. ВЭЖХ-анализ фракции пигментов липидов С. okhotensis, отмеченной на рис. 5 (д)
Fig. 6. HPLC-analysis of the pigment fraction of lipids from C. okhotensis shown at Fig. 5 (д)
На представленной хроматограмме (рис. 6) видно, что в составе анализируемой фракции присутствуют по меньшей мере 9 компонентов, интенсивно поглощающих при 430 нм (выбранная для детектирования длина волны). Формы и
т---1---1---1---1---1-■-1---1---1---1---1
О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Время, МИН
характеры полученных электронных спектров позволили сделать заключение о различиях общей структуры хромофоров, входящих в состав молекул анализируемых каротиноидов.
Заключение
Представлены результаты определения сравнительного состава некоторых липидов дальневосточных видов голотурий C. japonica и C. okhotensis, включая жирные кислоты, 1-О-алкилглицериловые эфиры и каротиноиды.
Охарактеризован качественный и количественный состав жирных кислот липидов тканей дальневосточных голотурий. По качественному составу исследованные виды и ткани кукумарий сходны. Мышечная ткань (тушка) кукумарии, содержащая меньшее по сравнению с внутренностями количество липидов, характеризуется большим содержанием полиненасыщенных жирных кислот и меньшим насыщенных и разветвленных насыщенных.
Состав жирных кислот обоих видов кукумарии характеризуется высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот n-3 семейства, в частности эйкозапентаеновой кислоты (до 30,0 %), а также разветвленной насыщенной 12-метилтетрадекановой кислоты (до 18,5 %).
Некоторые алкильные радикалы 1-О-алкилглицериловых эфиров липидов содержат разветвленные углеводородные фрагменты, а отношение содержания 1-О-алкилглицериловых эфиров с разветвленными насыщенными углеводородными радикалами к содержанию 1-О-алкилглицериловых эфиров с линейными насыщенными углеводородными радикалами может служить признаком вида (1,53 для C. okhotensis и 0,55 для C. japonica).
Результаты исследования состава каротиноидов C. okhotensis показали некоторое отличие от состава каротиноидов C. japonica, заключающееся прежде всего в отсутствии среди каротиноидов C. okhotensis кукумариаксантина С. Наличие других идентифицированных каротиноидов — изомеры кукумариаксанти-на А, кукумариаксантина В и кантаксантина — характерно для обоих видов. Кроме того, была обнаружена группа полигидроксилированных каротиноидов, производных кукумариаксантинов, ß-каротина и ß-эхиненона.
Список литературы
Акулин В.Н., Калиниченко Т.П., Карлина А.Е. и др. Рациональное использование кукумарий дальневосточных морей // Вопр. рыб-ва. — 2005. — Т. 6, № 2(22). — С. 389-404.
Баранова З.И. Новые виды голотурий рода Cucumaria // Новое в систематике морских беспозвоночных : Исслед. фауны морей. — Л. : ЗИН АН СССР, 1980. — Т. 25, № 33. — С. 109-120.
Калинин В.И. Химическая морфология: тритерпеновые гликозиды голотурий : монография / В.И. Калинин, В.С. Левин, В.А. Стоник. — Владивосток : Дальнаука, 1994. — 284 с.
Левин В.С. Cucumaria anivaensis (Holothurioidea: Dendrochirotida) — новый вид голотурий из присахалинских вод // Биол. моря. — 2004. — Т. 30, № 1. — С. 76-78.
Левин В.С. Cucumaria okhotensis (Echinodermata: Holothurioidea) — новый вид голотурий из Охотского моря // Биол. моря. — 2003. — Т. 29, № 3. — С. 202-205.
Левин В.С., Гудимова Е.Н. Cucumaria lamberti sp.n. (Dendrochirotida, Cucumariidae) из залива Аляска // Зоол. журн. — 1998. — Т. 77, № 7. — С. 873-877.
Левин В.С., Степанов В.Г. Cucumaria conicospermium sp.n (Dendrochirotida, Cucumariidae) — новая голотурия из Японского моря // Биол. моря. — 2002. — Т. 28, № 1. — С. 66-69.
Рыбин В.Г., Павель К.Г., Болтенков Е.В., Вербицкий Г.А. Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии с комбинированным УФ- и масс-селектив-ным детектированием для определения каротиноидов в гонадах промысловых видов морских иглокожих Cucumaria japonica и Strongylocentrotus nudus // Изв. ТИНРО. — 2003. — Т. 135. — С. 299-306.
Савватеева Л.Ю. Дальневосточные голотурии и асцидии как ценное пищевое сырье : монография / Л.Ю. Савватеева, М.Г. Маслова, В.Л. Володарский. — Владивосток : ДВГУ, 1983. — 184 с.
Тимчишина Г.Н. Обоснование технологий получения пищевых добавок из куку-марии (Cucumaria japonica) на основе комплексного использования сырья : автореф. дис. ... канд. техн. наук. — Владивосток, 1999. — 24 с.
Тимчишина Г.Н. Перспективы использования биомодифицированных продуктов из голотурии в молочной промышленности // Хранение и переработка сельхозсырья. — 2003. — № 8. — С. 125-129.
Тимчишина Г.Н., Афанасьева А.Е. Перспективы использования нового вида кукумарии Cucumaria okhotensis при производстве пищевой продукции // Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты : сб. науч. тр. — М., 2003а. — Вып. 8. — С. 167-173.
Тимчишина Г.Н., Афанасьева А.Е. Обоснование использования внутренностей куку-марии как функционального продукта для животных // Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты : сб. науч. тр. — М., 2003б. — Вып. 8. — С. 78-85.
Тимчишина Г.Н., Павель К.Г. Комплексная переработка дальневосточной кукумарии // Мат-лы науч.-практ. конф. "Приморье — край рыбацкий". — Владивосток, 2002. — С. 130-135.
Avilov S.A., Antonov A.S., Drozdova O.A. et al. Triterpene Glicosides from the Far-eastern Sea-Cucumber Pentamera-Calcigera 2 — Disulfated Glycosides // J. Nat. Prod. — 2000. — Vol. 63, № 10. — P. 1349-1355.
Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. Physiol. — 1959. — Vol. 37, № 8. — P. 911-917.
Bordier C.G., Sellier N., Foucault A.P., Le Goffic F. Purification and characterization of deep sea shark Centrophorus squamosus liver oil 1-O-alkylglycerol ether lipids // Lipids. — 1996. — Vol. 31, № 5. — P. 521-528.
Carreau J.P., Dubacq J.P. Adaptation of macro-scale method to micro-scale for fatty acid methyl transesterification of biological lipid extracts // J. Chromatogr. A. — 1978. — Vol. 151, № 3. — P. 384-390.
Christie W.W. Equivalent chain-lengths of methyl ester derivatives of fatty acids on gas-chromatography — a reappraisal // J. Chromatogr. A. — 1988. — Vol. 447, № 2. — P. 305-314.
Christie W.W. Lipid analysis. Isolation, separation, identification and structural analysis of lipids. — Bridgwater, UK : The Oily Press, 2003. — 416 p.
Driedzic W., Selivonchick D.P., Roots B.I. Alk-1-enyl ether-containing lipids of goldfish (Carassius auratus L.). Brain and temperature acclimation // Comp. Biochem. Physiol. B. — 1976. — Vol. 53, № 3. — P. 311-314.
Egge H. Mass spectrometry of ether lipids // Ether lipids. — N.Y., US : Academic Press, 1983. — P. 17-47.
Hallgren B., Larsson S. The glyceryl ethers in the liver oils of elasmobranch fish // J. Lip. Res. — 1962. — Vol. 3, № 1. — P. 31-38.
Kaneniwa M., Itabashi Y., Endo S., Takagi T. Fatty acids in Holothuroidea: occurrence of cis-14-tricosenoic acid // Comp. Biochem. Physiol. B. — 1986. — Vol. 84, № 4. — P. 451-455.
Matsuno T. Xanthophylls as precursors of retinoids // Pure Appl. Chem. — 1991. — Vol. 63, № 1. — P. 81-88.
Matsuno T., Tsushima M. Comparative biochemical studies of carotenoids in sea cucumbers // Comp. Biochem. Physiol. B. — 1995. — Vol. 111, № 4. — P. 597-605.
Rybin V., Pavel K., Boltenkov E. et al. Fatty acids composition of two Holothuroidea species — Cucumaria japonica and C. okhotensis // Nat. Prod. Comm. — 2007. — Vol. 2, № 8. — P. 849-852.
Smith G.M., Djerassi C. Phospholipid studies of marine organisms: 14. Ether lipids of the sponge Tethya aurantia // Lipids. — 1987. — Vol. 22, № 4. — P. 236-240.
Song Y., Sawa T., Tsuchiya M. et al. The screening of beta-lactamase inhibitors: inhibition by fatty acids produced by bacteria // J. Antibiot. (Tokyo). — 1981. — Vol. 34, № 8. — P. 980-983.
Svetashev V.I., Levin V.S., Cham Ngok Lam, Do Tuet Nga. Lipid and fatty acid composition of holothurians from tropical and temperate waters // Comp. Biochem. Physiol. B. — 1991. — Vol. 98, № 4. — P. 489-494.
Tsushima M., Fujiwara Y., Matsuno T. Novel marine di-Z-carotenoids: cucumari-axanthins A, B, and C from the sea cucumber Cucumaria japonica // J. Nat. Prod. — 1996. — Vol. 59, № 1. — P. 30-34.
Yang P., Collin P., Madden T. et al. Inhibition of proliferation of PC3 cells by branched-chain fatty acid, 12-methyltetradecanoic acid, is associated with inhibition of 5-lipoxygenase // Prostate. — 2003. — Vol. 55. — P. 281-291.
