CC BY
75BIOLOGICAL SCIENCES
ПРИМЕНЕНИЕ ТЕХНОЛОГИИ CRISPR/Cas9 В УЛУЧШЕНИИ СОРТОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР
Камалова Л.Х.
Центр Геномики и Биоинформатики, младший научный сотрудник
Аюбов М.С.
Центр Геномики и Биоинформатики, старший научный сотрудник
Мирзахмедов М.Х.
Центр Геномики и Биоинформатики, младший научный сотрудник
Юсупов А.Н.
Центр Геномики и Биоинформатики, младший научный сотрудник
Мамажонов Б.О.
Центр Геномики и Биоинформатики, младший научный сотрудник
Обидов Н.С.
Центр Геномики и Биоинформатики, младший научный сотрудник
THE APPLICATION OF CRISPR/Cas9 TECHNOLOGY IN IMPROVING AGRICULTURAL CROPS
Kamalova L.
The Center of Genomics and Bioinformatics, junior scientist
AyubovM.
The Center of Genomics and Bioinformatics, senior scientist
Mirzaxmedov M.
The Center of Genomics and Bioinformatics, junior scientist
Yusupov A.
The Center of Genomics and Bioinformatics, junior scientist
Mamajonov B.
The Center of Genomics and Bioinformatics, junior scientist
Obidov N.
The Center of Genomics and Bioinformatics, junior scientist
DOI: 10.5281/zenodo.7340715
Аннотация
Возможность изучения функции и контроля работы генов была основой селекции на протяжении веков. Развитие технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 обеспечило революционные достижения в генетической инженерии растений. Принимая во внимание рост населения на нашей планете, мы считаем критически важным применение новейших технологий для создания культур, устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам, в связи с чем в данной обзорной статье мы изучили достижения ученых со всего мира в области применения технологии CRISPR/Cas9 для улучшения сельскохозяйственных растений.
Abstract
The ability to study the function and control of genes has been the basis of breeding for centuries. The development of CRISPR/Cas9 genome editing technology has provided revolutionary advances in plant genetic engineering. Taking into account the growth of the population on our planet, we consider it critical to use the latest technologies to create crops that are resistant to biotic and abiotic stresses, and therefore in this review article we studied the achievements of scientists from around the world in the field of applying CRISPR/Cas9 technology for improvement of agricultural plants.
Ключевые слова: CRISPR/Cas9, gRNA, sgRNA, crRNA, tracRNA.
Keywords: CRISPR/Cas9, gRNA, sgRNA, crRNA, tracRNA.
Введение
Издавна ученые и селекционеры стремились контролировать работу гена для изучения их функции, а также для применения этих знаний в повышении урожайности, а также устойчивости к различным биотическим и абиотическим стрессам окружающей среды. Открытие системы CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), естественного инструмента редактирования генов, открыло новую эру в селекции, генетике и генетической инженерии.
CRISPR представляет собой целый класс коротких палиндромных повторов, которые в основном распространены у прокариот (бактерии, археи). У прокариот эти повторы комплементарны последовательностям чужеродных ДНК, например, ДНК вируса. Когда вирусы проникают в бактерии, по-следные, в свою очередь, синтезируют эти которкие повторяющиеся последовательности, которые связываются с вирусными ДНК; с помощью нуклеазы, называемой Cas, эти последовательности разрушают чужеродную ДНК. Таким образом,
CRISPR/Cas представляет собой механизм естественной защиты прокариот от заражения вирусами [55]. Впоследствии эта технология стала применяться в науке как инструмент искусственного редактирования генома различных организмов. В данной обзорной статье мы кратко опишем систему CRISPR/Cas9 и мировой опыт применения ее для улучшения экономически ценных признаков культурных растений.
История открытия технологии CRISPR/Cas
Впервые CRISPR последовательности были случайно клонированы из кишечной палочки (E. Coli) в 1987 г. [13]. Позже эти последовательности были клонированы и из других прокариот, однако ученые не знали точно об их функциях до тех пор, пока не был обнаружен CRISPR-ассоциированный белок (Cas) [14, 31, 32]. Это позволило ученым выяснить, что система CRISPR/Cas является иммунной защитой бактерий от вирусов и открыло новые возможности в области редактирования генома. В
2012 г. две исследовательские группы объявили, что система CRISPR/Cas может быть собрана в условиях лаборатории, и что собранные in vitro системы способны разрезать определенную последовательность ДНК [10, 15]. Также было показано, что для функционирования системы CRISPR/Cas при редактировании генома необходимы: нуклеаза Cas, CRISPR РНК (crRNA) и трансактивирующая crRNA (tracRNA). Jinek с коллегами показали, что последние две молекулы ДНК могут быть собраны в единую синтетическую молекулу РНК, называемую single guide RNA (sgRNA) [15]. Таким образом, эти исследования вывели методы редактирования геномов на новый уровень. Другая группа ученых в
2013 году провели успешный нокаут нескольких генов в клеточных линиях человека и мыши; Mali с коллегами также использовали Cas9 для нокаута функциональных генов в нескольких линиях клеток человека [8, 28]. Таким образом, эти исследования вывели методы редактирования геномов бактерий, животных и растений на новый уровень.
С тез пор как система CRISPR/Cas была признана передовой технологией в генетической инженерии, методы редактирования генома на основе CRISPR/Cas были разработаны для всех основных сельскохозяйственных культур, включая рис, пшеницу, кукурузу и хлопок [22]. На сегодняшний день технология CRISPR/Cas стала незаменимой для создания сельскохозяйственных культур с улучшенными признаками.
Применение CRISPR/Cas9 в селекции сельскохозяйственных культур
Повышение устойчивости растений к биотическим стрессам
Болезни, вызываемые патогенами и насекомыми-вредителями, представляют большую проблему для сельскохозяйственных культур, таких как кукуруза, рис, хлопок, пшеница и др. Биотические факторы влияют на рост и развитие растений, а также снижают урожайность и качество урожая. Развитие технологии CRISPR/Cas9 позволило создание растений, устойчивых к заболеваниям, вы-
зываемым грибами, бактериями и вирусами. Исследование одного из самых распространённых заболеваний - мучнистой росы - показывает, что гены MLO отвечают за заражение ячменя мучнистой росой, а их ингибирование подавляет инфекцию [4, 12]. Так, Wang с коллегами применили систему CRISPR/Cas9 для нокаута гена mlo у пшеницы, что привело к устойчивости пшеницы к мучнистой росе [47]. Ген mlo также был CRISPR/Cas9-нокаутирован у томатов, в результате чего растения томатов показали значительную устойчивость к мучнистой росе [33]. Еще одним распространенным заболеванием многих растений является фуза-риозное увядание (возбудитель - Fusarium oxysporum f.sp. niveum) [29]. Группа ученых во главе с Zhang успешно применили CRISPR/Cas9 для нокаута гена Clpsk1; результаты показали, что нокаутированные растения показали устойчивость к фузариозному увяданию [56]. В растениях риса Wang с коллегами подавили ген ERF (OsERF922) с помощью CRISPR/Cas9; исследование выявило, что отредактированные растения имели повышенную устойчивость к пирикуляриозу [45, 59]. CRISPR/Cas9-опосредованный нокаут определенных генов хлопчатника способствовал проявлению толерантности растений к Verticillium dahliae [58].
В 2016 году Payott с коллегами применили CRISPR/Cas9 успешно нокаутировали ген eIF(iso)4E у Arabidopsis; результаты показали, что мутанты с нокаутом eIF(iso)4E устойчивы к вирусу мозаики турнепса (TuMV), [36]. Ген Os8n3 риса является одним из генов восприимчивости к бактериальному ожогу (возбудитель - Xanthomonas oryzae pv. oryzae) [50]. Kim с коллегами использовали CRISPR/Cas9 для нокаута этого гена в растениях риса, что привело к повышению устойчивости к данной инфекции [17].
Повышение устойчивости растений к абиотическим стрессам
Наиболее распространенными абиотическими стрессами, угрожающими сельскому хозяйству, являются повышенные температуры, засуха, засоление, а также загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами. На сегодняшний день известно много генов вовлеченных в реакцию растений на абиотический стресс; с развитием CRISPR/Cas технологии стало возможным манипулировать многими из них [52]. CRISPR/Cas9-отредактированный ген AGROS8 кукурузы повысил устойчивость растений к засухе [39]. Нокаутирование гена SlAGL6 с помощью CRISPR/Cas9 позволило растениям томата улучшить рост и плодоношение в условиях теплового стресса [18]. Другое исследование показало, что CRISPR/Cas-отредактированные линии Arabidopsis имели повышенную устойчивость к засухе [6]. Нокаут гена ARF4 улучшил эффективность потребления воды у растений томата, в результате чего растения стали более устойчивы к засолению и осмотическому стрессу [3]. CRISPR/Cas редактирование генов gs3 и dep1 риса способствовало повышению устойчивости к засолению почвы [9]. Нокаут гена ppa6 повысил устойчивость риса к щелочному стрессу [46]. Нокдаун OsNramp5 и
OsLCTl с помощью CRISPR/Cas9 позволил снизить накопление кадмия в рисе [40]. Другое исследование показало, что нокаут OsNRAMPl с помощью CRISPR/Cas9 привел к снижению уровня кадмия и свинца в растениях риса [5, 7]. Alam с коллегами использовали систему CRISPR/Cas9 для нокаута гена OsbHLH024 риса и усиления экспрессии генов, отвечающих за перенос ионов для повышения солеустойчивости риса [1].
Улучшение роста и развития растений
Аргиназа (ARG) является ферментом, регулирующим развитие корней; избыточная его экспрессия подавляет образование боковых корней [30]. Ван с коллегами использовали CRISPR/Cas9 для нокаутирования гена ARG у растений хлопка. Линии с нокаутом гена аргиназы показали увеличение количества боковых корней и общей площади поверхности корней [48]; это, в свою очередь, улучшает поглощение растениями воды и питательных веществ из почвы и, наконец, улучшает рост и развитие растений [35]. Редактирование генома на основе CRISPR/Cas9 позволило выявить регулятор-ную функцию генов MADS в развитии эндосперма семян риса [34]. Исследования показывают, что CRISPR/Cas9-мутированный ген гексокиназы риса hxk5 приводит к мужской стерильности растений [20]. Ученые также выявили, что нокаут COPII-компонентов генов sarib и saric способствует изменению развития пыльцы и приводит к мужской стерильности у Arabidopsis [26]. Мутанты Bnspl3, полученные с помощью технологии CRISPR/Cas9, проявляли задержку развития растений аллотетра-плоидного рапса [23]. CRISPR/Cas9-опосредованный нокаут tfll способствовал изменению высоты растений, ветвления, а также времени цветения у Brassica napus [41].
Повышение урожайности сельскохозяйственных культур
Система CRISPR/Cas представляет собой передовой инструмент для нокаута генов, отрицательно влияющих на урожайность растений. Исследование, проведенное Li и его коллегами, показывает, что нокаут негативных регуляторов урожайности улучшает такие признаки, как размер зерна, вес зерна, количество и плотность зерен [24]. В исследовании Xu и его коллег, технология CRISPR/Cas9 была применена для нокаута негативных регуляторов массы зерна у риса (gw2, gw5 и tgw6); мутанты с отредактированным геномом показали повышенную массу и размер зерен [49]. Вес и размер семян риса также контролируются геном vin2; мутанты с CRISPR/Cas9-нокаутом этого гена показали уменьшение размера и массы зерна [15]. В другом исследовании улучшение показателя массы зерна пшеницы было достигнуто с помощью CRISPR/Cas9 редактирования GASR генов [57]. Более крупный размер плода томата был достигнут с помощью CRISPR/Cas редактирования CLV-WUS регулятор-ного элемента [37]. CRISPR/Cas редактирование гена AGROS8 способствовало увеличению урожайности растений кукурузы в условиях засухи [39]. У риса CRISPR/Cas9 редактирование гена OsLOGL5
привело к значительному повышению урожайности в условиях засухи [44]. В другом исследовании, CRISPR/Cas нокаут генов G-белка позволил улучшить такие агрономические признаки риса, как размер зерна и количество зерен в метелке [9]. Все вышеприведенные результаты исследований показывают, что CRISPR/Cas редактирование генома является очень перспективной технологией в селекции направленной на повышение урожайности культур.
Улучшение качества урожая Качество сельскохозяйственных продуктов во многом определяется содержанием белков, жиров, углеводов и других биологически активных соединений. В исследовании Li и его коллег CRISPR/Cas опосредованное редактирование генома растений томата улучшило биосинтез ликопина в плодах растений [25]. Используя технологию CRISPR/Cas9 для редактирования гена а-глиадина, Sanchez-Leon с коллегами получили пшеницу с низким содержанием глютена [38]. В другом исследовании CRISPR/Cas нокаут гена d-гордеина привел к увеличению количества белка в ячмене [51]. Было показано, что CRISPR/Cas9 редактирование гена CRUC изменяет содержание белка в семенах растений Camelina sativa [27]. CRISPR/Cas9 нокаут генов pat2/5 привел к повышенному накоплению крахмала в семенах аллотетраплоидного рапса [54]. Sun с коллегами использовали технологию CRISPR/Cas для нокаута гена SBEIIb; в результате был создан рис с высоким содержанием амилозы [42]. Аналогичные результаты были получены у сладкого картофеля путем CRISPR/Cas9 нокаута гена SBEII [46]. Изменение качества крахмала было достигнуто с помощью CRISPR/Cas9-редактирования гена синтеза крахмала GBSS картофеля [2]. Нокаут гена d-гордеина на основе CRISPR/Cas привел к существенному снижению проламинов и увеличению глютенинов в ячмене [51]. Жиры — еще один важный показатель качества сельскохозяйственных культур. В исследовании Karunarathna и его коллег CRISPR нокаут генов BnSFAR4 и BnSFAR5 привел к повышенному содержанию масел в семенах рапса [16]. У Brassica napus CRISPR/Cas нокаут гена tt8 повысил содержание масел и белков, а также состав жирных кислот в семенах [53].
Заключение Одна из современнейших технологий редактирования генома - CRISPR/Cas9 - позволила значительно ускорить селекцию растений по сравнению с традиционной селекцией или другими методами генетической инженерии, использовавшимся ранее. Благодаря своей эффективности, простоте и универсальности, CRISPR/Cas9 в последнее время становится все более и более популярным. Систему CRISPR-Cas9 можно использовать для нокаута гена, вставки последовательностей или их замен [21]. Возможности, которые открывает технология CRISPR/Cas обширны. На сегодняшний день существует множество растений с отредактированным геномом, которые имеют повышенную устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам, повышенную урожайность и улучшенное качество.
Принимая во внимание вышесказанное, ученые нашего центра активно работают над созданием CRISPR-Cas кассет для улучшения как местных, так и экспортных сортов сельскохозяйственных культур.
Список литературы
1. Alam M. S., Kong J., Tao R., Ahmed T., Ala-min M., Alotaibi S. S., et al. (2022). CRISPR/Cas9 mediated knockout of the OsbHLH024 transcription factor improves salt stress resistance in rice (Oryza sativa L.). Plants (Basel) 11 (9), 1184. 10.3390/plants11091184
2. Andersson, M. et al. (2017) Efficient targeted multiallelic mutagenesis in tetraploid potato (Solanum tuberosum) by transient CRISPR-Cas9 expression in protoplasts. Plant Cell Reports 36 (1), 117- 128.
3. Bouzroud, S. et al. (2020) Down regulation and loss of auxin response factor 4 function using CRISPR/Cas9 alters plant growth, stomatal function and improves tomato tolerance to salinity and osmotic stress. Genes 11, 272.
4. Buschges, R. et al. (1997) The barley Mlo gene: a novel control element of plant pathogen resistance. Cell 88 (5), 695-705.
5. Chang J. D., Huang S., Yamaji N., Zhang W., Ma J. F., Zhao F. J. (2020). OsNRAMP1 transporter contributes to cadmium and manganese uptake in rice. Plant Cell Environ. 43 (10), 2476-2491. 10.1111/pce.13843
6. Chen, S. et al. (2019) Genome editing to integrate seed size and abiotic stress Ttolerance traits in Ar-abidopsis reveals a role for DPA4 and SOD7 in the regulation of inflorescence architecture. Int J Mol Sci 20, 2695.
7. Chu C., Huang R., Liu L., Tang G., Xiao J., Yoo H., et al. (2022). The rice heavy-metal transporter OsNRAMP1 regulates disease resistance by modulating ROS homoeostasis. Plant Cell Environ. 45 (4), 11091126. 10.1111/pce.14263
8. Cong, L. et al. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819823.
9. Cui, Y. et al. (2020) Heterotrimeric G protein are involved in the regulation of multiple agronomic traits and stress tolerance in rice. BMC Plant Biol 20, 90.
10. Gasiunas, G. et al. (2012) Cas9-crRNA ribo-nucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proc Natl Acad Sci USA 109 (39), E2579-86.
11. Hammes, U.Z. (2015) Novel roles for phyto-sulfokine signalling in plant pathogen interactions. Plant, Cell & Environment 39 (7), 1393-1395.
12. Huckelhoven, R. and Panstruga, R. (2011) Cell biology of the plant-powdery mildew interaction. Current Opinion in Plant Biology 14 (6), 738-746.
13. Ishino, Y. et al. (1987) Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase iso-zyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology 169 (12), 5429-5433.
14. Jansen, R. et al. (2002) Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol 43 (6), 1565-1575.
15. Jinek, M. et al. (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial i9mmunity. Science 337 (6096), 816-821.
16. Karunarathna, N.L. et al. (2020) Elevating seed oil content in a polyploid crop by induced mutations in SEED FATTY ACID REDUCER genes. Plant Biotechnology Journal n/a (n/a), In press.
17. Kim, Y.-A. et al. (2019) CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of Os8N3 in rice to confer resistance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Rice 12 (1), 67.
18. Klap, C. et al. (2017) Tomato facultative par-thenocarpy results from SlAGAMOUS-LIKE 6 loss of function. Plant Biotechnol J 15, 634-647.
19. Lee, D.W. et al. (2019) The Role of Rice Vacuolar Invertase2 in Seed Size Control. Mol Cells 42, 711- 720.
20. Lee, S.K. et al. (2020) Deficiency of rice hexokinase HXK5 impairs synthesis and utilization of starch in pollen grains and causes male sterility. J Exp Bot 71, 116-125.
21. Li Y, Wu X, Zhang Y, Zhang Q. CRISPR/Cas genome editing improves abiotic and biotic stress tolerance of crops. Front Genome Ed. 2022 Sep 7;4:987817. doi: 10.3389/fgeed.2022.987817. PMID: 36188128; PMCID: PMC9524261.
22. Li, C. et al. (2017) A high-efficiency CRISPR/Cas9 system for targeted mutagenesis in Cotton (Gossypium hirsutum L.). Sci Rep 7, 43902.
23. Li, C. et al. (2018) An Efficient CRISPR/Cas9 Platform for Rapidly Generating Simultaneous Muta-genesis of Multiple Gene Homoeologs in Allotetraploid Oilseed Rape. Front Plant Sci 9, 442.
24. Li, M. et al. (2016) Reassessment of the four yield-related genes Gn1a, DEP1, GS3, and IPA1 in rice using a CRISPR/Cas9 system. Frontiers in Plant Science 7 (377).
25. Li, X. et al. (2018) Lycopene Is Enriched in Tomato Fruit by CRISPR/Cas9-Mediated Multiplex Genome Editing. Frontiers in Plant Science 9 (559).
26. Liang, X. et al. (2020) COPII components Sar1b and Sar1c play distinct yet interchangeable roles in pollen development. Plant Physiol, in press.
27. Lyzenga, W.J. et al. (2019) CRISPR/Cas9 editing of three CRUCIFERIN C homoeologues alters the seed protein profile in Camelina sativa. BMC Plant Biol 19, 292.
28. Mali, P. et al. (2013) RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science 339 (6121), 823-826.
29. Martyn, R.D. and Netzer, D. (1991) Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341 -FR. 26 (4), 429.
30. Meng, Z. et al. (2015) Expression of the rice arginase gene OsARG in cotton influences the morphology and nitrogen transition of seedlings. PLoS One 10, e0141530.
31. Mojica, F.J.M. and Montoliu, L. (2016) On the rrigin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology 24 (10), 811-820.
32. Mojica, F.J.M. et al. (2005) Intervening Sequences of Regularly Spaced Prokaryotic Repeats Derive from Foreign Genetic Elements. Journal of Molecular Evolution 60 (2), 174-182.
33. Nekrasov, V. et al. (2017) Rapid generation of a transgene-free powdery mildew resistant tomato by genome deletion. Scientific Reports 7 (1), 482.
34. Paul, P. et al. (2020) MADS78 and MADS79 are essential regulators of early seed development in rice. Plant Physiol 182, 933-948.
35. Peng, R.H. et al. (2020) From sequencing to genome editing for cotton improvement. Trends in Biotechnology (10.1016/j.tibtech.2020.09.001).
36. Pyott, D.E. et al. (2016) Engineering of CRISPR/Cas9-mediated potyvirus resistance in transgene-free Arabidopsis plants. Molecular Plant Pathology 17 (8), 1276-1288.
37. Rodriguez-Leal, D. et al. (2017) Engineering quantitative trait variation for crop improvement by genome editing. Cell 171 (2), 470-480.e8.
38. Sanchez-Leon, S. et al. (2018) Low-gluten, nontransgenic wheat engineered with CRISPR/Cas9. Plant Biotechnology Journal 16 (4), 902-910.
39. Shi, J. et al. (2017) ARGOS8 variants generated by CRISPR-Cas9 improve maize grain yield under field drought stress conditions. Plant Biotechnol J 15, 207-216.
40. Songmei L., Jie J., Yang L., Jun M., Shouling X., Yuanyuan T., et al. (2019). Characterization and evaluation of OsLCT1 and OsNramp5 mutants generated through CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis for breeding low Cd rice. Rice Sci. 26, 88-97. 10.1016/j.rsci.2019.01.002
41. Sriboon, S. et al. (2020) Knock-out of TERMINAL FLOWER 1 genes altered flowering time and plant architecture in Brassica napus. BMC Genet 21, 52.
42. Sun, Y. et al. (2017) Generation of High-Am-ylose Rice through CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis of Starch Branching Enzymes. Front Plant Sci 8, 298.
43. Wang, B. et al. (2019) Mutagenesis Reveals That the OsPPa6 Gene Is Required for Enhancing the Alkaline Tolerance in Rice. Front Plant Sci 10, 759.
44. Wang, C. et al. (2020) A cytokinin-activation enzyme-like gene improves grain yield under various field conditions in rice. Plant Molecular Biology 102 (4), 373-388.
45. Wang, F. et al. (2016) Enhanced Rice Blast Resistance by CRISPR/Cas9-Targeted Mutagenesis of the ERF Transcription Factor Gene OsERF922. PLoS One 11 (4), e0154027.
46. Wang, H. et al. (2019) CRISPR/Cas9-Based Mutagenesis of Starch Biosynthetic Genes in Sweet Potato (Ipomoea Batatas) for the Improvement of Starch Quality. Int J Mol Sci 20, 4702.
47. Wang, Y. et al. (2014) Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nature Biotechnology 32 (9), 947-951.
48. Wang, Y. et al. (2017) Increased lateral root formation by CRISPR/Cas9-mediated editing of ar-ginase genes in cotton. Science China Life Sciences 60 (5), 524-527.
49. Xu, R. et al. (2016) Rapid improvement of grain weight via highly efficient CRISPR/Cas9-mediated multiplex genome editing in rice. J Genet Genomics 43, 529-532.
50. Yang, B. et al. (2006) Os8N3 is a host disease-susceptibility gene for bacterial blight of rice. PNAS 103, 10503-10508.
51. Yang, Q. et al. (2020) Mutation of the d-hor-dein gene by RNA-guided Cas9 targeted editing reducing the grain size and changing grain compositions in barley. Food Chem 311, 125892.
52. Zafar, S.A. et al. (2020) Engineering abiotic stress tolerance via CRISPR/ Cas-mediated genome editing. J Exp Bot 71, 470-479.
53. Zhai, Y. et al. (2020) Targeted mutagenesis of BnTT8 homologs controls yellow seed coat development for effective oil production in Brassica napus L. Plant Biotechnol J 18, 1153-1168.
54. Zhang, K. et al. (2019) Effective editing for lysophosphatidic acid acyltransferase 2/5 in allotetra-ploid rapeseed (Brassica napus L.) using CRISPR-Cas9 system. Biotechnol Biofuels 12, 225.
55. Zhang, D., Zhang, Z., Unver, T., Zhang, B., CRISPR/Cas: a powerful tool for gene function study and crop improvement, Journal of Advanced Research (2020a), doi: https://doi.org/10.1016/jjare.
56. Zhang, M. et al. (2020b) CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of Clpsk1 in watermelon to confer resistance to Fusarium oxysporum f.sp. niveum. Plant Cell Reports 39 (5), 589-595.
57. Zhang, Y. et al. (2016) Efficient and transgene-free genome editing in wheat through transient expression of CRISPR/Cas9 DNA or RNA. NATURE COMMUNICATIONS 7 (1), 12617.
58. Zhang, Z. et al. (2018) Simultaneous editing of two copies of Gh14-3-3d confers enhanced transgene- clean plant defense against Verticillium dahliae in allotetraploid upland cotton. Front Plant Sci 9, 842.
59. Zhou Y., Xu S., Jiang N., Zhao X., Bai Z., Liu J., et al. (2022). Engineering of rice varieties with enhanced resistances to both blast and bacterial blight diseases via CRISPR/Cas9. Plant Biotechnol. J. 20 (5), 876-885. 10.1111/pbi.13766
