CC BY
294
Тема номера
_
Применение спектроскопии в органической химии
Спектроскопические методы исследования занимают ведущие позиции в химии, биологии, фармацевтике, других областях. Их используют, чтобы определить состав сложных композиций, состояние живых организмов, контролировать качество продукции, изучить строение веществ и т.д. Применение спектроскопических методов основано на взаимодействии молекул вещества с электромагнитным излучением, в результате чего происходит поглощение, испускание или рассеяние части энергии, что регистрируется в виде соответствующего спектра.
В органической химии чаще всего применяют спектроскопию инфракрасного (ИК), ультрафиолетового (УФ) и видимого диапазона, ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрию.
ИК-спектроскопия использует диапазон длин волн электромагнитного спектра, отвечающий колебательным и вращательным уровням энергии молекул. При исследовании органических соединений обычно используют поглощение ИК-излучения в области А=2-50 мкм, что соответствует волновым числам у=5000-200 см-1. С помощью ИК-спектро-скопии можно быстро и надежно идентифицировать разнообразные функциональные группы (карбонильную, гидроксильную, карбоксильную, амидную, амино-, циано- и др.), а также различные непредельные фрагменты (двойные и тройные углерод-углеродные связи, ароматические или гетероароматические системы). ИК-спектроскопия широко применяется для идентификации и подтверждения качества фарма-
цевтических субстанций, действующих веществ пестицидов и т.д. при условии, что спектры эталонов были записаны ранее и доступны для сравнения.
В УФ-спектроскопии используется более коротковолновая область (400-700 нм) электромагнитного излучения, обладающего большей энергией, которая вызывает электронные переходы в молекуле. В УФ-спектрах наблюдают функциональные группы или системы, которые получили название хромофоров. Обычно они имеют п-электроны или свободные электронные пары гетероатомов, переход которых с основного на возбужденный энергетический уровень соответствует УФ-диапазону. Хромофоры входят в состав белков и нуклеиновых кислот, поэтому УФ-спектроско-пия широко применяется в биохимических исследованиях.
В основе метода ЯМР лежит взаимодействие магнитных моментов атомов с внешним магнитным полем. Под его влиянием происходит ориентация спиновых моментов ядра и возникает диф-
Наталия Хрипач,
заместитель
директора
по научной работе
Института
биоорганической
химии
НАН Беларуси, кандидат химических наук
Александр Барановский,
заведующий
лабораторией
физико-химических
методов
исследования
Института
биоорганической
химии НАН
Беларуси, кандидат
химических наук
ференцировка энергетических уровней, поскольку магнитная энергия ядра может принимать лишь дискретные значения. С помощью высокочастотного генератора можно вызвать переходы между энергетическими уровнями. При этом ядро будет поглощать (резонировать) только в узком диапазоне длин волн, соответствующем разнице энергий основного и возбужденного состояний.
Метод начали применять в химии в начале 1950-х гг., практически сразу вслед за открытием явления ядерного магнитного резонанса. Поскольку атом водорода - непременный компонент органических соединений, а его наиболее распространенный изотоп 1Н обладает ядерным магнитным моментом, долгое время развивалась в основном спектроскопия ЯМР на протонах атомов водорода. Открытие фурье-спектроскопии позволило на 2-3 порядка повысить чувствительность ЯМР-спектрометров за счет накопления сигналов, а появление новых магнитов на основе сверхпроводящих материалов многократно увеличило разрешающую способность аппаратов.
Широкое использование метода ЯМР в химии связано с тем, что на резонансные частоты поглощения ядра влияет его непосредственное окружение, поэтому по виду и положению сигналов в спектре можно узнать взаимное расположение атомов. Основные характеристики, получаемые из протонного ЯМР-спектра, -химический сдвиг сигнала атома, который зависит от электроотри-
цательности соседних атомов в молекуле, и тонкая структура сигнала (мультиплетность), которая определяется наличием соседних атомов водорода. В зависимости от пространственного расположения последних энергия их взаимного влияния, проявляющегося в спектре в виде константы спин-спинового взаимодействия, принимает различные значения, благодаря чему можно выяснить структуру молекул. Поскольку интенсивность сигнала в спектре ЯМР прямо зависит от концентрации исследуемого вещества, метод может быть использован для количественного анализа без применения стандарта.
В настоящее время спектроскопия ЯМР - основной способ изучения кинетики и динамики молекул в растворах, установления строения молекул и состава биологических жидкостей, растворов или смесей. Размер изучаемых молекул может варьироваться от небольших молекул органических соединений до природных биомолекул с массой в десятки килодальтонов. С помощью ЯМР-спектроскопии изучают содержание метаболитов в физиологических жидкостях человека в норме и патологии, а также определяют метаболический профиль в процессе лечения пациентов и даже во время проведения операции. В медицине используют магнитно-резонансную томографию (МРТ), основанную на резонансном поглощении электромагнитного излучения атомами водорода молекул воды, которая содержится в органах и тканях организма. В фармацевтике ЯМР-спектроскопия помогает не только выяснять структуру соединений при разработке новых фармацевтических субстанций, но и контролировать качество субстанций и готовых лекарственных форм. С помощью метода ЯМР также выявляют фальшивки среди фармацевтических препаратов. Разработаны специальные устройства для контроля качества пищевых продуктов по принципу «отпечатков пальцев», когда эксперименталь-
ный спектр исследуемого объекта автоматически сравнивается с хранящимся в памяти устройства эталоном.
Спектроскопия ЯМР позволяет получить прямую информацию о строении изучаемого предмета, и ее применение на практике ограничивается только высокой стоимостью приборов и их частей, например электромагнитов. При их эксплуатации необходимо постоянное охлаждение жидкими азотом и гелием, что весьма затратно и требует наличия определенной инфраструктуры.
В Институте биоорганической химии (ИБОХ) установлен современный мультиядерный фурье-ЯМР-спектрометр высокого разрешения AVANCE-500 с рабочей частотой 500 МГц производства Bruker-Biospin (рис. 1). Конфигурация прибора позволяет проводить одномерные и двумерные эксперименты в растворах в широком диапазоне температур (-150 - 150 °С) путем детектирования большинства ядер периодической системы.
Использование ЯМР-спектро-метра позволяет решать основные научные задачи, возникающие в процессе синтеза новых органических соединений: определять состав реакционных смесей, оценивать кинетику процесса, устанавливать конфигурацию и конформационное поведение сложных органических молекул в растворах. Внедрение в практику исследования современных методов двумерной спектроскопии ЯМР (HSQC, TOCSY, NOESY и др.) позволило вывести на новый качественный уровень и значительно расширить доказательную базу при установлении структуры сложных органических соединений.
Для ядер ЗД и 13C проводятся гомо- и гетероядерные двумерные эксперименты.
Гомоядерные эксперименты:
■ COSY (homonuclear correlation spectroscopy) отражает скалярное взаимодействие между протонами (обычно до трех связей);
■ TOCSY (total correlation spectroscopy) выявляет изоли-
рованные спиновые системы и отражает взаимодействие ядер внутри системы;
■ NOESY (nuclear Overhauser effect spectroscopy) показывает ди-поль-дипольные взаимодействия, определяет пространственную сближенность протонов. Полезен для установления стереохимии молекул.
Гетероядерные эксперименты:
■ HSQC (heteronuclear singlequantum correlation spectroscopy) позволяет выявить углерод-протонные взаимодействия через одну связь и соотнести сигналы атомов углерода в спектре WC с сигналами протонов, присоединенными к данным атомом углерода (рис. 3);
Рис. 2.
!Н ЯМР-спектр гепарина
Рис. 3.
Двумерный HSQC корреляционный спектр стероида
о
X X
5
X
Тема номера
_
Рис. 4.
Хроматомасс-спектрометр
о
X X
5
X
■ HMBC (heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy) позволяет установить протон-углеродную корреляцию более чем через одну связь. Используется для определения порядка соединения атомов в молекуле; метод эффективен для установления положения сигналов четвертичных атомов углерода. HMBC можно применить также для записи двумерных корреляционных спектров протон-азот с естественным содержанием 15N в молекуле. Это дает возможность исследовать на спектрометре AVANCE-500 низкомолекулярные азотсодержащие соединения.
AVANCE-500 весьма эффективен для установления или подтверждения химического строения и пространственной структуры низкомолекулярных органических соединений; изучения структуры неорганических и металлорганических соединений (ЯМР-спектроскопия на ядрах 29Si, 119Sn, 113Cd, 77Se, 195Pt, 103Rh и др.); исследования структуры полимеров в растворах; количественного и качественного анализа лекарственных препаратов, средств защиты растений, стимуляторов роста, препаратов для ветеринарии; проведения качественного и количественного анализа биологических жидкостей на содержание глюкозы, липидов и других метаболитов.
Один из простых примеров применения ЯМР-спектроскопии для контроля качества лекарственного средства представлен на примере гепарина, закупаемо-
го в качестве фармацевтической субстанции для производства готовой лекарственной формы. Методика была введена в качестве обязательной для фармпред-приятий в связи с выявлением серьезных побочных эффектов при применении препаратов гепарина, содержащих гиперсульфа-тированный хондроитин сульфат, анализ на содержание которого является затруднительным и ранее не проводился. На рис. 2 представлен протонный спектр чистого гепарина (имеет один сигнал в области 2.04 м.д.). В случае содержания примеси хондроитин сульфата в спектре появляется дополнительный пик при 2.16 м.д. (отмечено на рисунке красной вертикальной линией).
На рис. 3 представлен двумерный HSQC спектр молекулы стероида. В верхней части рисунка изображен ЯМР-спектр ЗД, а в левой части - спектр 13C. Пятна на плоскости, так называемые кросс-пики, указывают на связь атома углерода, сигнал которого находится на одной горизонтальной линии с кросс-пиком, с атомом водорода, чей сигнал расположен на одной вертикальной линии с кросс-пиком. Имея набор одномерных и двумерных спектров, специалист без труда установит строение неизвестного соединения.
Другой важный метод исследования веществ - масс-спектро-метрия. В отличие от оптических методов спектроскопии, которые детектируют поглощение или испускание энергии молекулами или атомами, в данном случае регистрируются ионы. Масс-спек-трометрия основана на измерении отношения массы к числу элементарных положительных или отрицательных зарядов ионов (m/z), полученных из молекул анализируемого вещества. Это отношение выражается в атомных единицах массы, или дальтонах. Ионы, образовавшиеся в ионном источнике, ускоряются и перед попаданием в детектор разделяются с помощью масс-анализатора.
Сочетание масс-спектроме-трии с другими методами позво-
ляет получать больше информации об объекте исследования. Оказались весьма эффективными и широко распространились в качестве аналитических приборов хроматомасс-спектрометры, в которых различные типы газовых, жидкостных или ионных хроматографов обеспечивают предварительное разделение компонентов пробы, а масс-спектрометр осуществляет индикацию разделенных веществ и измерение их содержания.
В качестве масс-селективного детектора используют разные анализаторы: магнитный, электростатический, квадрупольный, времяпролетный, ионную ловушку, циклотронно-резонансный. Чтобы ионизировать компоненты образца, применяются электронный удар, химическая ионизация, электроспрей, фотоионизация, лазерная десорбция, химическая ионизация при атмосферном давлении, полевая десорбция.
В ИБОХ используются хро-матомасс-спектрометры: газовый хроматограф Agilent 6890N с масс-селективным детектором Agilent 5975 Inert, жидкостные хроматографы Agilent 1200 с одиночным и тройным квадру-польными анализаторами Agilent 6120 и 6410, а также масс-спектрометр с индуктивно связанной плазмой Agilent 7500cx. (рис. 4-5). В каждом из них масс-се-лективным детектором является квадрупольный анализатор. Под действием постоянного и переменного электрических полей ионы с определенной массой испытывают стабильные колебания и могут пройти через квадрупольный фильтр только при определенных значениях постоянного и переменного напряжений на электродах.
Высокоэффективную жидкостную хроматографию в сочетании с масс-детектором можно использовать для анализа термолабильных и малолетучих веществ, растворимых в полярных растворителях, таких как ацетонитрил, вода, метанол. Предварительное разделение на колонке позволяет анализировать
искомые вещества в сложных матрицах и смесях. Тандемная масс-спектрометрия в режиме детектирования заданных масс, когда первый масс-детектор «тройного квадруполя» работает как фильтр на пропускание ионов с определенными фиксированными значениями m/z, а последний фиксирует получающиеся из этих ионов в ячейке соударений дочерние ионы только с определенной заданной массой, дает высокую чувствительность и исключительную селективность. Благодаря надежности, универсальности, возможности работы в автоматическом режиме хрома-томасс-спектрометры используют для анализа остаточных количеств пестицидов, для осуществления допинг-контроля, а также в фармацевтике, протеомике и других областях.
Примером применения тандемной масс-спектрометрии могут служить проведенные в ИБОХ работы по изучению фар-макокинетических особенностей изменения концентрации бисо-пролола и карведилола в крови пациентов с кардиологическими заболеваниями. Разработанный метод позволил количественно определить искомые вещества в плазме крови на уровне 1 нг/мл. На хроматомасс-спектрометре Agilent 6410 Triple Quad LC/MS определено количественное содержание пятнадцати основных антоцианов и их производных в сортах голубики высокорослой и голубики топяной, установлена химическая структура пяти гликозидов олеаноловой кислоты в корнях патринии средней. Исследуется также химический состав ряда других перспективных лекарственных растений.
Для масс-спектрометрическо-го анализа металлов в качестве источника ионов применяется индуктивно-связанная плазма. Метод имеет высокую чувствительность, широкий линейный диапазон, требуемую разрешающую способность и точность. Это способствует его широкому применению в различных отраслях науки и технологии: ядерная
физика и ядерные технологии, химия и химические технологии, лазерные, полупроводниковые и вакуумные технологии, материаловедение, геохимия и космохимия, биология и биохимия, экология, медицина, фармакология, криминалистика и т.д. Так, контроль примесей тяжелых металлов - важный этап разработки и производства фармацевтических продуктов. В настоящее время используется колориметрический тест на суммарное содержание металлов, образующих сульфиды (Ag, As, Bi, Cd, Cu, Hg, Mo, Pb, Sb, Sn). Тест весьма субъективен, и результаты не всегда точны. Например, железо, хром и никель с помощью этого теста не обнаруживаются. Кроме того, подготовка образцов для оценки следовых количеств металлов обычно включает в себя этап озоления при высокой температуре, что может привести к потере некоторых элементов.
С 2014 г. фармакопеи развитых стран переходят на масс-спектрометрию с индуктивно-связанной плазмой для анализа тяжелых металлов и высокотоксичных элементов в фармацевтических препаратах. Метод позволяет определять содержание металлов в чрезвычайно низких концентрациях (до 10"10 %) в биологических, геологических объектах, окружающей среде, пище и т.д. По списку Европейского медицинского агентства (ЕМЕА) все фармацевтические продукты должны подвергаться анализу на содержание четырех высокотоксичных элементов: мышьяка, кадмия, ртути и свинца. В идеале они должны полностью отсутствовать. Кроме того, 12 элементов класса 2 должны быть лимитированы в лекарствах и вспомогательных веществах и измерены, если они использовались в процессе производства (в особенности остатки катализаторов Os, Ir, Pt, Ru, Rh, Pd, Cr, Mo, Ni и др.). Такого рода работы на имеющемся в ИБОХ масс-спектрометре с индуктивно связанной плазмой Agilent 7500cx имеют большую перспективу.
История применения спектроскопических методов для установления структуры вещества лишь недавно перешагнула полуторавековой рубеж. За это время были сделаны многие выдающиеся открытия: от обнаружения новых химических элементов и выяснения химического состава Солнца до расшифровки пространственной структуры биологических макромолекул и визуализации внутреннего строения живого организма. В последние десятилетия быстро развивается методология, обновляется инструментальный арсенал исследователей, появляются новые подходы, связанные с широким использованием математических методов и компьютерного анализа для обработки спектроскопических данных. О продуктивности научного поиска, непосредственно за которым следуют инновационные разработки, можно судить, например, по тому, что с 1991 по 2003 г. только за работы по спектроскопии ЯМР были присуждены три Нобелевские премии. Потребности медицины, экологии, сельского хозяйства и других отраслей практической деятельности человека способствуют росту научных исследований и практических разработок в спектроскопии, а следовательно, вскоре мы станем свидетелями новых ярких открытий в этой области.
Рис. 5.
Масс-спектрометр с индуктивно связанной плазмой
о х
X
5
X
