CC BY
39
I Случаи отравления курительными смесями в Московской области
• И. Б. Бантыш, М. В. Марченко,
Э. Г. Николаева, С. И. Реброва, Н. А. Крупина ГБУЗ МО «Бюро СМЭ» МЗ МО (нач.— д.м.н., проф. В. А. Клевно) Аннотация: Доклад посвящен обзору нескольких летальных случаев, произошедших на территории Московской области в 2014 году вследствие употребления курительных смесей, содержащих ^(1-карбамоил-2,2-метилпро-пил)-1-(циклогексилметил)-1Н-индазол-3-кар-боксамид (ADB-PINACA-CHM), метиловый эфир 3,3-диметил-2-(1-(циклогексилметил)-1Н-ин-дазол-3-карбоксамидо) бутановой кислоты (MDMB(N)-CHM), нафтален-1-ил-(5-фтор-пентил)-1Н-индол-3-карбоксилат (CBL-2201) и N-(1-карбомоил-2-метилпропил)-1-пентил-1Н-индазол-3-карбоксамида (AB-PINACA). Ключевые слова: синтетические каннаби-миметики, газовая хроматография с масс-се-лективным детектором, жидкость-жидкостная экстракция
Cases of poisoning from "Spice" herbal mixtures in Moscow region
• I. B. Bantish, M. V. Marchenko,
E. G. Nikolaeva, S. I. Rebrova, N. A. Krupina Abstract: The report focuses on a review of several deaths that occurred in the Moscow region in 2014 due to the use of smoking mixtures ADB-PINACA-CHM, MDMB (N) -CHM, CBL-2201, AB-PINACA. Keywords: synthetic cannabimimetics, GC/MS, liquid-liquid extraction
ВВЕДЕНИЕ
Надежным и наиболее распространенным методом обнаружения и идентификации синтетических каннаби-миметиков является метод газовой хроматография с масс-селективным детектором (ГХ/МС) с применением процедуры жидкость-жидкостной экстракции.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В судебно-химическом отделе и в районных судеб-но-химических отделениях ГБУЗ МО Бюро СМЭ в 2014 год внедрены новые схемы исследования биологических объектов с применением метода ГХ/МС и современных библиотек масс-спектров. В результате количество случаев обнаружения метаболитов синтетических канна-бимиметиков при аналитической диагностике наркотического опьянения у живых лиц увеличилось. При этом значительная часть случаев приходится на производные ^(1-карбомоил-2-метилпропил)-1-пентил-1Н-инда-зол-3-карбоксамида (AB-PINACA) или их метиловых эфиров. При исследовании трупного материала большая часть обнаруженных веществ относится к производным ^(1-карбамоил-2,2-метилпропил)-1-пентил-1Н-инда-зол-3-карбоксамида (ADB-PINACA), либо метилового эфира 3,3-диметил-2-(1-пентил-1Н-индазол-3-карбок-самидо) бутановой кислоты (MDMB(N)-018). Трудность в отнесении метаболитов канабимиметиков к какому-либо конкретному веществу из группы зачастую обусловлена наличием общего основного метаболита. В 2014 году зафиксировано 18 случаев обнаружения метаболитов синтетических каннабимиметиков в трупном материале, где причина смерти установлена как отравление.
Основными объектами исследования при отравлениях курительными смесями являются кровь и моча.
Подготовку биологических жидкостей с целью исследования методом ГХ/МС на метаболиты синтетических каннабимиметиков основана на процедурах гидролиза (щелочного, кислотного или ферментативного) и жидкость-жидкостной экстракции с проведением деривати-зации - силилирования. Подготовку проводят методами, разработанными и принятыми в практике СХО. В связи с быстрым и практически полным метаболизмом синтетических каннабимиметиков в организме необходимо проводить поиск не нативных веществ, а их метаболитов. TMS-производные метаболитов синтетических канна-биноидов определяют методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором в режиме полного сканирования ионов по масс-спектрам электронного удара. Исследования проводят на хромато-масс-спектрометрах Agilent Technologies 7890В / 5975; 6890N / 5973.
ВЫВОДЫ
• Поиск и обнаружение психоактивных метаболитов новых наркотических средств, входящих в состав курительных смесей «СПАЙС» в объектах биологического происхождения методом ГХ/МС является актуальной задачей для врачей СМЭ СХО ГБУЗ МО Бюро СМЭ.
• Наличие огромного числа уже синтезированных каннабимиметиков и появление новых диктует необходимость пристального изучения их путей метаболизма и поиска не только основных, но и минорных метаболитов.
• Для разработки валидированных методик определения необходимы стандарты этих веществ и их метаболитов.
Применение ретроградной экстраполяции в практике расследования правонарушений, связанных с употреблением алкоголя
• Т. О. Баринская, А. В. Смирнов
ГБУЗ «Московский научно-практический центр наркологии ДЗМ», Москва Аннотация: Статья посвящена анализу типичных случаев расчетов по уравнениям Видмар-ка. Она и знакомит российских специалистов с современной мировой судебно-медицинской практикой применения ретроградной экстраполяции с использованием модернизированных уравнений и обновленных величин параметров-членов уравнений. Ключевые слова: этанол, фактор скорости 360, объем распределения Vd, общая вода TBW
Using of retrograde extrapolation in practice of the investigations of crimes associated with alcohol consummation
• T. O. Barinskaya, A. V. Smirnov Abstract: The article is devoted to analysis of typical cases of calculation after Widmark equations. It introduces modern forensic practice of retrograde extrapolation using upgraded equations and values of equations' parameters to Russian specialists. Keywords: ethanol, elimination rate constant 360, volume of distribution Vd, total body water TBW
ВВЕДЕНИЕ
Уравнения Видмарка представляют собой токсико-кинетическую модель нулевого порядка, с чем связано наиболее существенное ограничение их применения: ими можно пользоваться только тогда, когда есть уверенность,
что оба момента времени - и тот, в который отбирался образец биосреды на анализ (момент 2), и тот, для которого производится расчет (момент 1), принадлежат фазе элиминации, т.е. находятся на прямолинейном участке кинетической кривой, отражающем состояние концентрационного равновесия этанола между кровью и тканями.
МЕТОДЫ
Кинетическую фазу в момент 2 можно определить двумя способами: у живых лиц - путем повторного отбора образца спустя не менее 1 часа, что дает также информацию об индивидуальной величине фактора скорости, или, как и для трупа, путем сопоставления концентраций этанола в двух различных одновременно отобранных биосредах. У живых лиц с этой целью можно использовать не только соотношения концентраций в крови и моче, но и в крови и выдыхаемом воздухе или выдыхаемом воздухе и моче. Кинетическую фазу в момент 1 определить невозможно даже теоретически без дополнительной информации о времени приема алкоголя. Чтобы не совершить грубую ошибку в отношении концентрации, следует исключить из расчета период не только фазы абсорбции, но и фазы распределения, т.е. в сумме 3-4 часа после приема. Как правило, это условие не выполняется и к тому же эксперт не располагает надежной информацией о времени приема алкоголя. Тем не менее это не означает, что следует отказываться от расчетов, поскольку предметом интереса является не точная концентрация, а факт превышения или непревышения допустимого порога.
В отношении выдыхаемого воздуха этот порог составляет 0,16 мг/л, причем только для водителей транспортных средств. Единственные (и вполне надежные) данные о величине фактора скорости ß60 принадлежат Dettling A. et al., 2009: 0,049-0,112 мг/л в ч, n=96, у мужчин; 0,061-0,124 мг/л в ч, n=81 у женщин (показаны границы доверительного интервала при P=0,994). Расчет следует делать с учетом и нижней, и верхней границы. Категорически недопустимо рассчитывать ß60 на основании двух результатов анализа, полученного с интервалом 20 мин в ходе медицинского освидетельствования - это приводит к грубым ошибкам в силу целого ряда причин.
В отношении крови такая норма отсутствует - из-за несовершенства современного законодательства. Порог 0,5 г/л для водителей транспортных средств, доставленных в соматические ЛПУ фигурирует только в Приказе Минздрава РФ от 14.07.2013 № 308. Поэтому суды часто ставят вопрос о соответствии выявленной концентрации этанола в крови уровню в выдыхаемом воздухе. При крайней необходимости пересчет следует делать, используя наиболее достоверные данные о коэффициенте Jones A. W., Andersson L. 1996, для обеих границ доверительного интервала (P=0,95): 2001-2821.
Несмотря на огромное число работ, отражающих величину ß60 в крови, лишь два источника можно использовать для судебных расчетов (критерии отбора изложены нами ранее, Баринская, Смирнов, 2012): Clarke's Analysis, 2011: 0,09-0,29 г/л в ч у мужчин и 0,12-0,32 г/л в ч у женщин, P=0,95, и упомянутую выше работу Dettling A. et al., 2009, в которой указан более узкий доверительный интервал: 0,101-0,254 г/л в ч у мужчин и 0,121-0,274 г/л в ч, у женщин, P=0,994. Последние данные рекомендуются для нормостеничных освидетельствуемых, не страдающих алкоголизмом.
Анализ мочи необходим не только для оценки кинетической фазы. Этанол в моче можно обнаружить даже тогда, когда он полностью исчезает из крови и выдыхаемого воздуха. Это распространяется на то время, пока в мочевом пузыре накапливается моча, образованная в период
присутствия этанола в крови (вплоть до опорожнения мочевого пузыря). И наоборот, нулевой результат анализа мочи означает отсутствие этанола в крови не только в момент отбора, но и в течение всего периода времени, за которое данная порция мочи была накоплена. Скорость мочеобразования у человека находится в диапазоне от 42 до 78 мл/ч; если известен объем мочи в мочевом пузыре в момент отбора образца, можно рассчитать диапазон времени, за которое она могла быть накоплена, и сделать выводы относительно состояния опьянения, имевшего место ранее, если в момент отбора этанол в выдыхаемом воздухе и крови уже не определяется.
Для расчета количества выпитого алкоголя необходимо знать величину V^ - кажущегося объема распределения. Этот параметр заменил фактор р Видмарка в связи с выражением концентраций не в г/кг крови (%о), а г/л. Поэтому уравнение Видмарка в современной модификации имеет следующий вид:
Л(г)=ш(кг)^^ (л/кг)х(С(г/л)+в(г/л-ч)хг(ч)).
Как и фактор редукции, Vd связывает концентрацию этанола в крови с содержанием общей воды (СТБШ, л/кг):
с„
где CBW - содержание воды в крови, %. При выборе значений Vd лишь в крайнем случае следует опираться на руководство Кларка: 0,7 и 0,6 л/кг для мужчин и женщин, соответственно, с доверительным интервалом ±20% (P=0,95). Однако при наличии необходимой информации было бы гораздо точнее рассчитать индивидуальную величину Vd в соответствии с какой-либо антропометрической моделью (Watson, Watson, Batt, 1981; Forrest, 1986; Seidl, Jensen, 2000; Ulrich, Cramer, Zink, 1987). В нашем исследовании результаты, полученные токсико-кинетическим методом, лучше всего совпали с расчетами по уравнению Ватсон:
TBW(n)=2,447-0,09516*A+0,1074*H+0,3362*W для мужчин и TBW(n)=0.2466*W+1,069*H-2,097 для женщин. Если рост неизвестен, то, соответственно:
TBW(n)=20,03-0,1183*A + 0,3626*W и TBW(n)=14,46+0,2549*W, где A - возраст (годы), Н - рост (см), W - масса тела (кг), TBW=CTBW*m. Отсюда определяется Vd согласно уравнению:
CTBW = VdCW *1,055, где 1,055 - плотность крови. TBW, а следовательно, и Vd сильно варьирует у разных людей, но у одного человека, в отличие от ß60, остается величиной относительно постоянной, во всяком случае до тех пор пока сохраняется без резких изменений масса тела. Также относительно мало варьирует у живых лиц содержание воды в крови. У женщин из-за более низкого ге-матокрита оно несколько выше, чем у мужчин, однако эти различия в 1-2% незначительны и обычно не принимаются во внимание, так что 80% считается надежной средней величиной для обоих полов (Clarke's Analysis, 2011). Ранее было показано, как важно учитывать посмертные изменения в содержании воды в крови при исследовании трупа (Баринская и др., 2013), однако определение этого параметра важно только для определения прижизненной концентрации этанола, а в расчетах по Видмарку используется значение CBW, присущее живым лицам, т.е. 80%.
С особой осторожностью следует делать расчеты относительно погибших детей - содержание воды у них гораздо выше, чем у взрослых и определяется из специальной возрастной литературы. Величина параметра ß60 у детей, разумеется, не известна, поэтому при расчете количества выпитого алкоголя кинетическую составляющую, указывающую, сколько этанола успело элиминироваться к мо-
менту смерти, приходится игнорировать. Однако ясно, что это не приводит к сильному занижению результата, т.к. у детей процессы элиминации протекают гораздо медленнее, чем у взрослых, и концентрация, близкая к максимальной, может сохраняться в течение многих часов.
Наконец, наиболее современный метод - непосредственное определение содержания воды с помощью специальных весов, определяющих содержание воды и жира. Даже недорогие бытовые приборы обнаруживают отличное совпадение с результатами расчета по модели Ватсон. Этот метод незаменим при оценке TBW у особенно тучных или истощенных людей, для которых плохо подходят антропометрические модели, ориентированные на средние параметры.
I Метаболиты фазы II синтетических каннабимиметиков в моче: нужна ли пробоподготовка?
• О. Л. Заикина1, к.х.н. А. М. Григорьев2
1ГКУЗ Ленинградский областной наркологический диспансер, 2ГБУЗ МО «Бюро СМЭ» МЗ МО (нач.— д.м.н., проф. В. А. Клевно) Аннотация: Представлены разработки быстрых методов обнаружения метаболитов синтетических каннабимиметиков фазы I и II в моче, базирующиеся на применении жидкостной хромато-масс-спектрометрии. Рассмотрены способы подготовки проб, допускающие отказ от применения стадий экстракции и деконъю-гирования образцов. Предложены поисковые библиотеки, адаптированные для разных типов масс-фильтров и предназначенные для автоматизированного скрининга биообразцов в практике судебно-химического и химико-токсикологического анализа.
Ключевые слова: ГХ-МС, ЖХ-МС\МС, синтетические каннабиноиды, метаболиты, глюкуро-ниды, моча, скрининг, библиотеки
Phase II metabolites of synthetic cannabimimetics in urine: is the sample preparation necessary?
• O. L. Zaikina, A. M. Grigoryev Abstract: The development of fast methods of phases I and II synthetic cannabimimetics metabolites detection in urine which is based on application of liquid chromatography-mass spectrometry is presented. The sample preparation methods based on refusal of application of extraction and deconjugation stages are considered. The search libraries adapted for different types of mass filters and intended for the automated screening of samples in the forensic-chemical and toxicological analysis are offered.
Keywords: GC-MS, LC-MS/MS, synthetic cannabinoids, metabolites, glucuronides, urine, screening, libraries
ВВЕДЕНИЕ
Одним из важнейших достоинств жидкостной хроматографии (ЖХ, обращенно-фазовый вариант) следует признать возможность минимизации стадии подготовки проб или полного отказа от нее. Учитывая меньшую (по сравнению с газовой хроматографией) зависимость этого метода от молекулярного веса и термической стабильности аналитов, в круг определяемых соединений должны включаться метаболиты фазы II. Такой подход
позволяет нивелировать стадию деконъюгирования биологических образцов, что значительно снижает стоимость и трудоемкость анализа.
Группа синтетических каннабимиметиков (канна-биноидов, СК, «спайсы») - естественный объект для подобного подхода, поскольку эти соединения подвержены практически полному метаболизму, приводящему, как правило, к образованию преимущественной доли конъю-гатов в метаболических смесях. Поскольку о свойствах этих соединений известно немного, мы выполнили идентификацию ряда метаболитов СК фаз I и II методами газовой и жидкостной хромато-масс-спектрометрии. Кроме того были разработаны способы пробоподготовки, адаптированные для разных концентрационных диапазонов метаболитов СК в моче и ориентированные на разные возможности аналитических лабораторий. Полученные результаты позволили создание скрининговых методов, облегчающих диагностику употребления и интоксикации СК для целей судебно-химического и химико-токсикологического анализа.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для идентификации метаболитов СК использовали следующие жидкостно-хроматографические системы:
• ЖХ + МС LCMC-8040 (тройной квадруполь, Shimadzu). Применен скрининговый метод, рекомендованный производителем.
• ЖХ 1200 + МС 6460 (тройной квадруполь, Agilent Technologies).
• ЖХ UltiMate 3000 (Thermo Scientific) + МС amaZon Speed (ионная ловушка, Bruker Daltonik). Применены условия скрининговой библиотеки Toxtyper 1.1.
• ЖХ 1200 Infinity + МС 6520 (квадруполь-времяпро-летный масс-анализатор, Agilent). Применены условия скрининговой библиотеки Broecker, Herre, Prägst.
• ЖХ 1200 + диодно-матричный детектор G1315B (Agilent). Система использована для поиска конъюгатов при учете их гидролизуемости и идентичности хромофоров у метаболитов фаз I и II, а также для количественных измерений.
Подготовка проб мочи включала следующие варианты.
• Центрифугирование и добавку 10 об.% ацетонитрила (минимальная пробоподготовка; метод пригоден для анализа образцов с высоким и средним содержанием аналитов. Требует наличия линии сброса элюата и предколонки).
• Подкисление муравьиной кислотой и экстракцию ацетонитрилом при сниженной температуре (-20 °C) с последующим упариванием водно-органической фазы досуха и растворением остатка в ЖХ элюенте (метод не содержит ограничений по концентрации аналитов).
• Подкисление ортофосфорной кислотой и экстракцию этилацетатом с последующим упариванием органической фазы досуха и растворением остатка в ЖХ элю-енте (метод не содержит ограничений по концентрации аналитов; низкую степень экстрагируемости (~ 40%) наблюдали только для наиболее гидрофильного аналита -моноглюкуронида 1-(4-карбоксибутил)-1Н-индол-3-карбо-новой кислоты).
• Твердофазная экстракция на анионообменных патронах Sampli Q Silica SAX, Agilent (получаемые растворы почти свободны от соединений неионогенного и катион-ного характера; метод не содержит ограничений по концентрации аналитов, но ограничен анионообменгой емкостью сорбента и, следовательно, содержанием ионогенных соединений в образце мочи; степень экстрагируемости для наиболее гидрофильных аналитов > 50%).
