CC BY
15
УДК 631.427:573.52:608.2
ПРИМЕНЕНИЕ НПВО-СПЕКТРОСКОПИИ В АСТРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ НА ПЛАНЕТНЫХ ПОСАДОЧНЫХ АППАРАТАХ*
А.В. Григорьев, Е.А. Воробьёва, В.С. Чепцов
Мы предлагаем применять спектроскопию нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО-спектроскопия) для контактных астробиологических исследований грунта посадочными космическими аппаратами на объектах Солнечной системы. В основе метода — наличие у биологических макромолекул (белки, ДНК/РНК, углеводы) полос поглощения в ИК-области спектра. Этот метод применим и для минералогических исследований, в частности, пыли или атмосферных осадков, а при установке на баллонах (например, на Венере) — аэрозолей. Оптимальный спектральный диапазон — от 2,5 до 25 мкм, спектральное разрешение — около 10 см-1.
Ключевые слова: НПВО-спектроскопия, почвенные микроорганизмы, астробиология, обнаружение жизни.
Введение
НПВО-спектроскопия применяется в земных лабораториях не один десяток лет как для минералогических, так и биологических исследований, но до сих пор не использовалась в космических планетных. Этот метод позволяет получать спектры поглощения тонкого (порядка длины волны) слоя вещества, находящегося в контакте с оптическим элементом, который мы здесь называем НПВО-призмой. Обычно применяемый спектральный диапазон — от 2,5 до 25 мкм, спектральное разрешение — около 10 см-1. В Институте космических исследований РАН (ИКИ) имеется опыт создания миниатюрных космических Фурье-спектро-радиометров с такими параметрами. Для решения астробиологических задач в эту разработку добав-
Рис. 1. Пояснение принципа НПВО-спектроскопии (по [17] с дополнениями)
ляются источник ИК-излучения и сменные кюветы со встроенными НПВО-призмами. Примерные параметры такого прибора: масса — 3 кг, потребляемая электрическая мощность — 9 Вт, один спектр регистрируется 20 с и занимает 0,4 кбайта данных. Простота приготовления образца и возможность варьирования объектов исследования — преимущества НПВО-метода, особенно ценные для посадочных аппаратов. Для исследования грунта проба может быть просто насыпана на НПВО-призму.
Основы НПВО-спектроскопии описаны, например, Н. Харриком [5] и кратко проиллюстрированы на рис. 1.
ИК-излучение направляется на боковую грань НПВО-призмы, которая представляет собой полированную плоскопараллельную пластинку (с боковыми гранями под углом 45°) из какого-либо материала, прозрачного в ИК-диапазоне: Ое, 2и8е, КЯ8-5 и т.п. Излучение достигает верхней грани под углом падения 0, достаточно большим, чтобы имело место полное внутреннее отражение. При этом падающее излучение проникает в соседнюю среду на расстояние порядка длины волны (эванесцентная волна). Если эта соседняя среда — вакуум, то потока энергии через границу раздела сред не будет и спектр излучения на выходе из НПВО-призмы будет, упрощенно говоря, такой же, как на входе. Но если исследуемое вещество, имеющее полосы поглощения, находится в контакте с рабочей поверхностью НПВО-призмы, то фотоны эванесцентной волны будут им поглощаться, и спектр на выходе будет иметь эти полосы поглощения.
Возможный порядок регистрации НПВО-спект-ра исследуемого вещества:
* Работа выполнена при поддержке Программы РАН 1.7П.
1) регистрируется референтный спектр, т.е. спектр с «чистой» НПВО-призмой;
2) обеспечивается контакт образца исследуемого вещества с рабочей поверхностью НПВО-призмы;
3) регистрируется информативный спектр;
4) спектр (3) делится на спектр (1), в результате чего получается относительный НПВО-спектр в относительных единицах — от 0 до 1.
Это самокалиброванный метод: относительный НПВО-спектр не зависит ни от формы спектра вхо-
дящего излучения, ни от кривой чувствительности детектора, ни от параметров электроники — только от спектра поглощения исследуемого вещества.
Применение НПВО-спектроскопии в исследовании минералов. Вибрация атомов в кристаллической решетке приводит к характерным полосам поглощения минералов [11, 26]. Их фундаментальные частоты и обертоны обычно соответствуют длинам волн >2,5 мкм. В частности, в практике почвенных исследований с применением инфракрасной спектрометрии (ИКС) используют область от 2,5 до 12—15 мкм [3]. ИКС-методы позволяют
1,0
0-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1—
600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600
Волновое число, см 1
1,0
0 -1-1-1-1-1-
1600 1400 1200 1000 800 600 400
Волновое число, см"1
Рис. 2. Инфракрасные спектры минералов; а — положение основных полос поглощения карбонатов, боратов, сульфатов, фосфатов, арсенатов и силикатов [4]; б — относительные НПВО-спектры порошков магнезита и гематита, полученные в нашей лаборатории (на врезке — фото НПВО-призмы с насыпанным образцом-порошком, общий объем которого — ~1 мм3)
Рис. 3. Инфракрасные спектры биообъектов: а — характерные полосы поглощения белков (Амид-1 и Амид-11), нуклеиновых кислот и липидов [16]; б — относительные НПВО-спектры жидкой воды (сплошная линия) и культуры типичной почвенной неспорообразующей бактерии Arthrobacter 8р. (пунктирная линия), полученные в нашей лаборатории
изучать важнейшие атомные группы и типы связей, адсорбцию и десорбцию влаги и газов, минералы с кристаллитами любых размеров, а также аморфные и органические компоненты в минеральной среде. Мы исследовали серию минералов с помощью Фурье-спектрометра с НПВО-пристав-кой. Для получения четких спектров поглощения минералов достаточно около 1 мм3 материала, представляющего собой порошок. Чем меньше размеры гранул, тем контрастнее полосы поглощения. Желательно, чтобы эти размеры были <0,1 мм.
На рис. 2 представлены спектры, содержащие полосы поглощения карбонатов, боратов, сульфатов, фосфатов, арсенатов и силикатов (а) и некоторые из полученных нами результатов (б): относительные НПВО-спектры порошков магнезита и гематита, которые вполне соответствуют известным спектрам. В интернете имеются различные библиотеки НПВО-спектров минералов, например, [12, 22].
Применение НПВО-спектроскопии в биологических исследованиях. НПВО-спектроскопия применяется и в биологических исследованиях [9,14,27]. В частности, предложено использовать этот метод для дифференциации бактериальных клеток различного физиологического статуса и исследования покоящегося состояния микроорганизмов в культуре [1].
Наша задача — обнаружить присутствие микроорганизмов в минеральной естественной среде методом НПВО-спектроскопии с оценкой возможности его использования в астробиологическом поиске.
Исследования экстремальных местообитаний Земли убеждают, что жизнь, однажды возникнув, проявляет способность адаптироваться к изменению факторов среды. Пределы адаптации микроорганизмов до сих пор не выяснены. Присутствие микроорганизмов и/или биологической активно-
сти фиксируется в недрах Земли до глубин более 5 км [18, 19] ив океанических донных осадках [2]. В древней мерзлоте и льду полярных регионов многочисленные и разнообразные микробные сообщества сохраняют жизнеспособность в течение миллионов лет при отрицательных температурах (вплоть до —50 +—80°) в условиях дефицита воды [7, 13, 15, 25]. Известна способность микроорганизмов метаболизировать и размножаться при температурах выше 100°, выдерживать высокие дозы радиации [6, 10, 24] и проч. Помимо адаптации, другой особенностью микроорганизмов является их способность образовывать покоящиеся формы, которые могут неопределенно длительное время переживать неблагоприятные условия и вновь реверсировать в метаболически активное состояние. Природные минеральные гетерофазные системы обеспечивают дополнительную протекцию микробных клеток, тесно взаимодействующих со средой обитания [20]. Известный диапазон устойчивости микроорганизмов к воздействию физико-химических факторов и известные данные планетологии позволяют обсуждать возможность существования жизни, подобной земной, в инопланетных условиях. Сегодня астробиологические программы положены в основу реализуемых планетных исследований [8, 23]. Спектральные методы, в том числе ИК-спектрометрия, активно используется для анализа инопланетного грунта.
Главные биополимеры живых клеток (белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды и др.) имеют характерные полосы поглощения в ИК области спектра. На рис. 3, б видны полосы липидов, углеводов, нуклеиновых кислот и белков. Полоса Амид-1 накладывается на полосу воды и вследствие этого неинформативна. Однако полоса поглощения Амид-11 хорошо различима. Присутствие воды не мешает и выявлению полос поглощения ДНК/РНК и углеводов. В данном случае представлены НПВО-спектры бактерии рода Arthrobacter,
широко распространенного в природных экотопах. Представители этого рода обычно встречаются и в экстремальных местообитаниях. Их устойчивость к воздействию неблагоприятных физико-химических факторов среды обеспечивается доказанной способностью формировать цистоподобные покоящиеся формы, что дает возможность бактериям длительно поддерживать жизнеспособность в состоянии анабиоза [20, 21].
Активизация микроорганизмов на поверхности НПВО-призмы. Основной проблемой применения спектральных методов анализа природных образцов является разделение спектров поглощения минералов и биологических объектов. Прямой анализ нативных образцов позволяет выявлять иско-
мые биологические полосы поглощения, однако четкость их проявления часто оставляет желать лучшего. Кроме того, в земном грунте обычно присутствуют органические вещества, не связанные с клетками (белки, нуклеиновые кислоты). Поэтому само по себе обнаружение в спектре образца полос поглощения, совпадающих с биологическими полосами, еще не доказывает присутствие микроорганизмов. Надо увидеть динамику, последовательное углубление биологических полос поглощения, обусловленное развитием микроорганизмов непосредственно на рабочей поверхности НПВО-призмы.
Нами были поставлены такие эксперименты сначала с лабораторной культурой бактерии Rho-
Рис. 4. Развитие микроорганизмов на рабочей поверхности НПВО-призмы: а — бактерия Rhodococcus 8р. (размножение на стерильной агарозе, нанесенной на поверхность призмы); б — мерзлая осадочная порода Антарктиды
dococcus sp., (рис. 4, а), а затем с образцом из Антарктиды (рис. 4, б). В последнем случае в качестве образца использовали мерзлую осадочную породу, отобранную с глубины 1,5 м (район Beacon Valley, 77°50'S, 160°36'E, 1270 м над ур.м.). Для проведения эксперимента ее высушивали до воздушно-сухого состояния. Содержание общего углерода было близко к нулю (0—0,1%), при этом содержание микроорганизмов в нем — достаточно высокое. Общее число бактериальных клеток перед анализом составляло 3 • 108 кл/г, 1 • 107 КОЕ/г давали рост на питательных средах. Подробное описание стерильного отбора, доставки и хранения образцов из района антарктической мерзлоты и описание места их отбора даны в публикации Д.А. Гиличин-ского с соавторами [13].
Грунт (~0,03 см3) наносили равномерным слоем на рабочую поверхность НПВО-призмы. Развитие микроорганизмов инициировали добавлением стерильного физиологического раствора (0,9% NaCl), который не содержал органических веществ. В течение 10 сут происходила сукцессия (развитие) микробных сообществ. Вследствие этого появились и стали последовательно углубляться инфракрасные полосы поглощения, характерные для микроорганизмов (рис. 4, б). Аналогичным образом динамику активизации клеток прослеживали на чистых культурах бактерий. На спектре Rhodococcus sp. (рис. 4, а) в первые сутки роста полоса Амид-II отсутствует. На пятые сутки она появилась, на девятые — становилась хорошо выраженной. На рис. 4, б видно углубление со временем полосы Амид-II при активизации естественного микробного сообщества грунта. Таким образом, возможность активизации населяющих грунт (почву, породу) микроорганизмов непосредственно на рабочей поверхности
НПВО-призмы дает существенный дополнительный аргумент в пользу их присутствия.
Выводы
Применение метода НПВО-спектроскопии на посадочных космических аппаратах перспективно как для минералогических исследований, так и для поиска возможно существующей внеземной жизни, основанной на белках и ДНК/РНК (или только РНК).
Важным свойством этого метода является простота приготовления исследуемого образца. Существенно также, что в какой бы части рабочей поверхности НПВО-призмы (~1 см2) ни находился образец, он даст вклад в НПВО-спектр; чем большую поверхность он занимает, тем сильнее сигнал.
Имеющийся в ИКИ РАН опыт и задел позволяют создать космический прибор, с помощью которого можно применить этот метод в планетной экспедиции. Ориентировочные параметры такого прибора: спектральный диапазон — от 2,5 до 25 мкм, спектральное разрешение — 10 см-1, масса — 3 кг, потребляемая электрическая мощность — 9 Вт; длительность регистрации одного спектра, занимающего 0,4 кбайта данных — 20 с.
Прибор может быть установлен на посадочный аппарат или на баллон, летающий в атмосфере (например, Венеры).
Благодарим Габриэле Арнольд (ДЛР, Германия) и Филипа Кристенсена (АНУ, США) за предоставленные образцы минералов.
Авторы выражают глубокую признательность
Д.А. Гиличинскому за предоставленные нам уни-
кальные образцы древних вечномерзлых пород.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Дуда В.И., Королев Ю.Н., Эль-Регистан Г.И. и др. Распределение и пространственная упорядоченность молекул биополимеров в покоящихся бактериальных спорах // Микробиология. 1978. Т. 47, № 4.
2. Леин А.Ю., Глущенко Н.Н., Осипов Г.А. и др. Биомаркеры сульфидных руд современных и древних «черных курильщиков» // Докл. АН. 1998. Т. 359, № 4.
3. Орлов Д.С., Осипова Н.Н. Инфракрасные спектры почв и почвенных компонентов. М., 1988.
4. Плюснина И.И. Инфракрасные спектры минералов. М., 1976.
5. Харрик Н. Спектроскопия внутреннего отражения. М., 1970.
6. Чепцов В.С., Воробьева Е.А., Горленко М.В. и др. Воздействие гамма-излучения, низкого давления и низкой температуры на жизнеспособность микробного сообщества серозема как аналитическая модель марсианского реголита // Современные проблемы науки и образования. 2015. № 3.
7. Abyzov S.S. Microorganisms in the Antarctic ice // Antarctic Microbiology/Ed.by E.I. Friedmann.N.Y., 1993.
8. Board S.S. A science strategy for the exploration of Europa. Washington, 1999.
9. Castro F.D., Sedman J., Ismail A.A. et al. Effect of dissolved oxygen on two bacterial pathogens examined using ATR-FTIR spectroscopy, microelectrophoresis, and potentiometric titration // Environ. Sci. Technol. 2010. Vol.44, N 11.
10. Dartnell L.R., Hunter S.J., Lovell K.V. et al. Low-temperature ionizing radiation resistance of Deinococcus radiodurans and Antarctic Dry Valley bacteria // Astrobio-logy. 2010. Vol.10, N 7.
11. Farmer V.C. The infrared spectra of minerals. L., 1974.
12. FDM FTIR and Raman Spectral Libraries. URL: http://www.fdmspectra.com/ (дата обращения: 08.12.2016).
13. Gilichinsky D.A., Wilson G.S., Friedmann E.I. et al. Microbial populations in Antarctic permafrost: biodiversity, state, age and implication for astrobiology // Astrobiology. 2007. Vol.7, N 2.
14. Goormaghtigh E, Cabiaux V., Ruysschaert J.-M. Secondary structure and dosage of soluble and membrane
proteins by attenuated total reflection Fourier-transform infrared spectroscopy on hydrated films // Eur. J. Biochem. 1990. Vol.193, N 2.
15.Kargel J.S., Kaye J.Z., Head J.W. et al. Europa's crust and ocean: origin, composition, and the prospects for life // Icarus. 2000. Vol. 148, N 1.
16. Mantsch H.H, Chapman D. (Eds). Infrared Spectroscopy of Biomolecules. N.Y., 1996.
17. Martin-Gil J., Palacios-Leble G, Ramos P.M., Martin-Gil F.J. Analysis of a Celtiberian protective paste and its possible use by Arevaci warriors // J. Interdiscipl. Celtic Stud. 2007. Vol. 5.
18. Pedersen K. Microbial life in deep granitic rock // FEMS Microbiol. Rev. 1997. Vol. 20, N 3—4.
19. Shekhovtsova N.V., Osipov G.A., Verkhovtseva N.V., Pevzner L.A. Analysis of lipid biomarkers in rocks of the Ar-chean crystalline basement // Proc. SPIE. 2003. Vol. 4939.
20. Soina V.S., Mulyukin A.L., Demkina E.V. et al. The structure of resting bacterial populations in soil and subsoil permafrost // Astrobiology. 2004. Vol. 4, N 3.
21. Soina V.S., Vorobyova E.A. Role of cell differentiation in high resistance of prokaryotes to cryoconserva-tion in permafrost // Adv. Space Res. 1996. Vol. 18, N 12.
22. S.T. Japan USA, LLC. URL: http://www.stjapan-usa.com (дата обращения: 08.12.2016).
23. Squyres S. Vision and voyages for planetary science in the decade 2013—2022. Washington, 2011.
24. Vorobyova E, Cheptcov V., Pavlov A. et al. The viability of native microbial communities in martian environment (model). In 40th COSPAR Sci. Assem. M., 2014.
25. Vorobyova E, Soina V., Gorlenko M. et al. The deep cold biosphere: facts and hypotheses // FEMS Microbiol. Rev. 1997. Vol.20, N 3—4.
26. Wilson Jr. E.B., Decius J.C., Cross P.C. Molecular vibrations: the theory of infrared and Raman vibrational spectra. N.Y., 1955.
27. Yu C, Irudayaraj J. Spectroscopic characterization of microorganisms by FTIR microspectroscopy // J. Biopolymers. 2005. Vol. 77, N 6.
Поступила в редакцию 14.01.2017
APPLICATION OF ATR SPECTROSCOPY IN ASTROBIOLOGY RESEARCH
ON THE PLANETARY LANDING SPACECRAFTS
A.V. Grigoriev, E.A. Vorobyova, V.S. Cheptsov
We propose to implement infrared Attenuated Total Reflectance (ATR) spectroscopy technique aboard landers for astrobiological research of terrestrial planets soil. The method is based on the absorption bands inherent to biological macromolecules (proteins, DNA/RNA and carbohydrates). This method is also applicable to mineralogical studies of soil, dust, atmospheric precipitation; use of balloons (e.g., on Venus) adds to this list aerosols. Optimal spectral range seems to be 2,5—25 micron, spectral resolution — about 10 cm-1.
Key words: ATR spectroscopy, soil microorganisms, astrobiology, detection of life.
Сведения об авторах
Григорьев Алексей Викторович, гл. специалист лаб. спектроскопии планетных атмосфер Ин-та космических исследований РАН. E-mail: [email protected]. Воробьёва Елена Алексеевна, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова, ст. науч. сотр. лаб. масс-спектрометрии и активной диагностики Ин-та космических исследований РАН. E-mail: [email protected]. Чепцов Владимир Сергеевич, аспирант каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В.Ломоносова. E-mail: [email protected].
