CC BY
9УДК [616-002.5:57.088.7]:615.015.8
ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ КОМПЛЕКСА М.ТиВЕГСиЮБ^ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЕГО УСТОЙЧИВОСТИ
А.Д.Адамбекова
КРСУ, кафедра микробиологии, вирусологии, иммунологии и эпидемиологии
Молекулярдык - генетикалык изилдоолорду M.Tuberculosis комплексин жана туруктуулугун
аныктоодо колдонулушу
Адамбекова А.Д.
Кыргыз - Россия Славян Университети Кыскача мазмуну: GenoType® MTBDRplus тест-системасынын артыкчылыгы - тажырыйбаларды тез алдамдыктаалуу - кургак учукка каршы дарылардын: изониазиддин жана рифампициндин туруктуулугун аныктоо (6 саттан 2 кунго чейин) кургак учуктун туруктуу формаларын аныктоодо колдонулушу керек.
Негизги создор: молекулярдык-генетикалыкизилдоо, GenoType® MTBDRplus тест-системасы, мутация, туруктуулук.
Using of the molecular genetic analis for identification of MBT complex and
determine resistance
Adambekova A.D Kyrgyz-Russian Slavonic University, Bishkek, the Kyrgyz Republic Abstract: The published data confirms that the GenoType® MTBDRplus assay should be used more widely in order to prevent circulation of infected patients in a community while a patients wait a result of conventional methods for mycobacteria culture and drug susceptibility testing (DST) which are slow and elaborate, requiring sequential procedures for the diagnosis.
Key words:molecular-genetic assay, GenoType MRDTB plus, M. tuberculosis, mutation, resistance.
Во всем мире туберкулёз (ТБ) является ведущей причиной смертности. По данным ВОЗ, около трети населения планеты - два миллиарда человек - инфицированы Mycobacteriumtuberculosis (МБТ) и подвержены риску заболевания. Ежегодно более чем у восьми миллионов человек развивается активный ТБ и примерно два миллиона умирают от этой болезни. Так, в 2010 году имели место 8,8 миллиона случаев заболевания туберкулезом, 1,1 миллиона случаев смерти от ТБ, и еще 0,35 млн. случаев смерти от ВИЧ-ассоциированного ТБ [1].
В Кыргызской Республике в 2011 году было зарегистрировано 5535 впервые выявленных больных туберкулезом. Заболеваемость при этом составила 101,1 на 100 тыс. населения. Показатель смертности от ТБ по республике в 2011 году составил 9,2 на 100 тыс [2, 3].
Несмотря на то что, в последние годы общее число случаев ТБ в Кыргызстане снижается, проблема осложняется распространением лекарственно-устойчивого туберкулеза и туберкулеза, сочетанного с ВИЧ-инфекцией. В 2010-2011 годах Республиканская референс-лаборатория Национального Центра Фтизиатрии (НЦФ) при поддержке CDC, Атланта, США, проекта ХОУП в Кыргызской Республике и Супра-Национальной референс лаборатории, г. Мюнхен, Германия, провела исследование распространенности лекарственной устойчивости в стране. Данные исследования
свидетельствуют о том, что бремя лекарственной устойчивости чрезвычайно высоко в Кыргызстане. Так ТБ со множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ) среди новых случаев ТБ составил 26.4% и среди ранее леченных - 51,6% [4].
Традиционные лабораторные методы мико-бактериологических посевов и тестирования лекарственной чувствительности (ТЛЧ) медленны и объемны, требуют выполнения последовательных процедур: выделения микобактерий из клинических образцов, идентификации комплекса МБТ и тестирования чувствительности штаммов к противотуберкулезным препаратам. В течение этого времени пациенты могут получать ненадлежащее лечение, лекарственно-устойчивые штаммы могут продолжать распространяться, кроме того может происходить нарастание устойчивости [5]. Поэтому новые технологии для быстрого выявления находятся в центре внимания научно-исследовательской работы и разработок, посвященных ТБ.
Внедрение молекулярно-биологических методов в широкую клиническую практику должно привести к повышению эффективности диагностики, к правильному выбору тактики лечения; позволит в перспективе осуществить динамическое наблюдение за путями переноса возбудителя туберкулеза, улучшить контроль эффективности лечения и улучшить систему эпидемиологического надзора за туберкулезом [6].
ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ КОМПЛЕКСА...
таблица 1
лекарственная устойчивость к рифампицину и изониазиду, выявленная тест-системой GenoType®
MTBDRplus
выявленная устойчивость n %
Устойчивость к ^Н и к RIF(RR)* 286 48
Чувствительность к ^Н и RIF (SS)* 79 13
Устойчивость к ^Н и чувствительность к RIF (RS)* 77 13
Чувствительность к ^Н и устойчивость к RIF (SR)* 15 3
Отр 140 23
Всего 599 100
*расшифровку аббревиатур см. в тексте
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) все чаще используется в диагностике ТБ. В основе тест-систем GenoType®MTBDRplus, производства HainLifescienceGmbH, Negren, Germany лежит ПЦР. Тест-система основана на уникальной DNA^Strip® технологии (гибридизация с ДНК-зондами) и позволяет проведение молекулярно-генетической идентификации комплекса МБТ и его устойчивости к рифампицину и/или изониазиду в культивированных образцах или в положительных клинических образцах мокроты. Быстрое получение результатов является главным преимуществом данной тест-системы. Получение окончательного результата минимум через 4-6 часов и максимум в течение 2- рабочих дней.
Проведение ТЛЧ к рифампицину возможно при детекции наиболее значимых мутаций гена rpob, (кодирующего бета субъединицу РНК полимеразы). Для определения высоко уровня устойчивости к изониазиду, исследуют ген katG,(кодирующий каталазу пироксидазу) и для определения низкого уровня устойчивости к изониазиду, изучается область промотора в гене inhA (кодирующего NАDHэноилACP-редуктазы) [7, 8].
целью нашего исследования явилось изучение распространенности МЛУ ТБ, вызванных мутациями в генах rpoB, katG и inhA в условиях Кыргызской Республики.
материал и методы исследования Проводилась идентификация комплекса M. tuberculosis и его резистентности к рифампицину и/или изониазиду в мокроте с положительным мазком и культуре с помощью тест-систем GenoType® MTBDRplus в РРЛ НЦФ за период с мая 2011 по февраль 2012 года. Процедура проведения теста подразделяется на три этапа: выделения ДНК из культивируемого материала (плотная/жидкая среда) или из клинических образцов (деконтами-нированные положительные образцы мокроты), амплификации и гибридизации.
Работа с культурами и инфекционными материалами велась в шкафу биологической безопаснос-
ти сламинарным потоком воздуха в соответствии с инструкциями производителя.
Полученные данные обработаны общепринятыми методами медико-биологической статистики.
результаты исследования. За исследуемый период времени было проведено 597 анализов с использованием тест-систем GenoType® MTBDRplus.
Как видно из таблицы мутации в генах гроВ, katG и ^А, ведущих к развитию резистентности к рифампицину и изониазиду (RR) наблюдались в 286 случаев, что составило 48%. Так, по данным Национальной противотуберкулезной программы (НТП) уровень МЛУТБ по результатам тестов на лекарственную чувствительность (ТЛЧ) на плотных и жидких средах в 2009 году составил 43,3%, в 2010 - 42%.
Наши данные, полученные по GenoType® MTBDRplus, являются, по-видимому, свидетельством того, что чаще направляются на данное исследование больные из группы риска по МЛУТБ. Также, GenoType® MTBDRplus позволил определить мутации, ведущие к развитию резистентности к изониазиду, но с сохраненной чувствительностью к рифампицину (RS) в 77 случаях, что составило 13%. Число резистентных штаммов к рифампицину, с сохраненной чувствительностью к изониазиду составило 15 (3%). Данный показатель близок к уровню распространенности монорезистентности к рифампицину - 0,86%, определенной классическими методами. Доля чувствительных штаммов как к рифампицину, так и к изониазиду (SS) составила 13%. Данный показатель требует к себе внимания со стороны клиницистов, так как свидетельствует о необходимости проведения оценки рисков у больных с подозрением на МЛУ ТБ и более тщательному отбору больных на обследование GenoType® MTBDRplus.
Таким образом, определение лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам (ПТП) при использовании классического метода - посева на плотной среде Левенштей-
№ 3, апрель-май 2013
13
на-йенсена составляет 2-3 месяца, на жидкой модифицированной среде в автоматическом анализаторе BactecMGIT 960 - 2-3 недели. Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что тест-система GenoType® MTBDRplus имея такое преимущество как скорость получения результата - определения чувствительности к основным ПТП: изониазиду и рифампицину (от 6 часов до 2-х рабочих дней) - должен шире использоваться в диагностике резистентных форм ТБ, назначении раннего и адекватного лечения, а также прерывания эпидемиологической цепочки в трансмиссии возбудителя.
Литература
1. World Health Organization. Global tuberculosis control: WHO report 2011.WHO/HTM/TB/2011.16. WorldHealthOrganization, Geneva, Switzerland 2011.
2. Аналитическая справка НЦФ по реализации противотуберкулезных мероприятий и Закона КР «О защите населения от туберкулеза» за 2011 г.
3. WHO (World Health Organisation). Global tuberculosis
control - epidemiology, strategy, financing. Geneva, WHO, 2009 (WHO/HTM/TB/2009.411)
4. Review of the laboratory network ofthe Kyrgyz Republic. 9-29 April 2012. Dr. HaraldHoffmann & Dr. UladzimirAntonenka, TB Laboratory Experts, IML red GmbH, Germany
5. Crudu V, Stratan E, Romanenco E, Allerheiligen V, Hillemann A, Moraru N. First evaluation of an improved assay for molecular genetic detection of tuberculosis as well as RMP and INH resistances. // JClinMicrobiol 2012; Epub ahead of print, doi: 10. 1128/JCM.05903-11.
6. TelentiA, Imbonden P, Marshesi F, Lowrie D, Cole S, Colston MJ, MatterL, Schopter K, Bodmer T. Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis. Lancet.-1993.- 341.-P. 647-650.
7. Исакова Ж.Т., Гончарова З.К., Юсупова Э.У. и др. Эффективность применения биочип-анализа для быстрого молекулярно-генетического определения мульти-резис-тентных штаммовM.Tuberculosis//Молекулярная медицина. - 2008. -№1. -С.51-55.
8. Zhang Y, Yew WW. Mechanisms of drug resistance in M.tuberculosis. //Int JTubercLungDis.-2009.-13.-Р. 13201330.
УДК 616.24-002.5-076:57.083.1
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА
А.Д. Адамбекова, Д.А. Адамбеков, А.Ш.Алишеров
КРСУ, Национальный Центр фтизиатрии
Кургак учуктун микробиологиялык ыкмаларынын есуп-енугуусу
Адамбекова А.Д., Адамбеков Д.А., Алишеров А.Ш. Кыргыз-Орус Славян Университети, Бишкек ш, Кыргызстан Национальный Центр фтизиатрии, Бишкек ш, Кыргызстан Корутунду: Автоматташтырылган BACTECMGIT 960 системасынын жана классикалык бактериология-лык Левенштейн-йенсен чeйрeнYн тажырыйбаларын салыштыруу анализи аткарылды.
Негизги сездер: кургак учукту дартын аныктоо, автоматташтырылгын BACTECMGIT 960 системасы,Левенштейн-йенсен чeйрeсY.
An improvement of microbiological methods in diagnosis of tuberculosis
A. D.Adambekova, D.A. Adambekov,A.Sh. Alisherov Kyrgyz-RussianSlavonicUniversity, NationalCenter of Phthisiology, Abstract: Comparative analysis of the automated BACTEC MGIT 960 and classical bacteriological method, culturing on Lowenstein-Jensen medium.
Keywords: diagnosis of tuberculosis, automated BACTEC MGIT 960, Lowenstein-Jensen medium.
Туберкулёз остается ведущей причиной смертности. Так, по данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), около трети населения планеты - два миллиарда человек - инфицированы Mycobacterium tuberculosis (МБТ) и подвержены риску заболевания. Ежегодно более чем у восьми миллионов человек развивается активный туберкулез (ТБ) и примерно два миллиона умирают от этой болезни. Так в 2010 году, зарегистрировано 8,8 миллиона случаев заболевания ТБ [1].
В Кыргызской Республике в 2011 году было
зарегистрировано 5 535 впервые выявленных больных туберкулезом (в системе Государственной Службы Исполнения Наказания (ГСИН) - 292 случая), заболеваемость составила 101,1 на 100 тыс. населения. Показатель смертности от ТБ составил 9,2 на 100 тыс. населения (с ГСИН) [2]. Ситуация по туберкулезу Кыргызской Республике, как и во всем мире, в последние годы характеризуется увеличением распространенности множественно лекарственно-устойчивого туберкулеза (МЛУ ТБ) как среди впервые выявленных, так и среди ранее
