CC BY
0
НАУЧНАЯ СТАТЬЯ
УДК 577.21
ПРИМЕНЕНИЕ МИКРОБНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА MF3 В РЕФОЛДИНГЕ РАСТИТЕЛЬНОЙ ХИТИНАЗЫ
Александра Михайловна Рожкова1, Юрий Андреевич Денисенко1,
1 2 Игорь Геннадьевич Синельников , Иван Никитич Зоров ,
3 3
Денис Валерьевич Ерохин , Виталий Георгиевич Джавахия
1 Институт биохимии им. АЛ. Баха, Федеральный исследовательский центр «Ф^вд^ентальные основы биотехнологии» Российской академии наук
2 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет,
3 Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии
Автор, ответственный за переписку: Александра Михайловна Рожкова, amroj kova@yahoo.com
Аннотация. Экспрессия рекомбинантных белков важна для изучения их биологической функции. Наиболее часто для первичного описания свойств белка используется система экспрессии бактерии E. coli. Однако в условиях сверхэкспрессии скорость агрегации целевых белков часто превышает скорость правильного сворачивания, что приводит к образованию нерастворимых телец включения. Тельца включения являются существенным недостатком системы экспрессии E. coli, поскольку препятствуют выделению целевых рекомбинантных белков. Одним из решений существующей проблемы является использование шаперон-подобных белков in vitro при рефолдинге целевого белка. В качестве примера шаперон-по-добного белка был взят рекомбинатный белок MF3, который увеличил выход растворимой растительной хитиназы на 92% в сравнении с выходом этого белка при использовании стандартной процедуры рефолдинга.
Ключевые слова: рефолдинг, MF3, элиситоры, шапероны
DOI: 10.55959/MSU0579-9384-2-2024-65-2-152-160
Список сокращений: MF3 - microbial factor 3, ДСН - додецилсульфат натрия, ДТТ - дитиотреитол, 2-МЭ - 2-мер^т'оэтанол.
Финансирование. Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 22-16-00154).
Для цитирования: Рожкова AM., Денисенко Ю.А., Синельников ИТ., Зоров И.Н., Ерохин Д.В., Джавахия ВТ. Применение микробного рекомби-нантного белка MF3 в рефолдинге растительной хитиназы // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2024. Т. 65. № 2. С. 152-160.
© Рожкова AM., Денисенко Ю.А., Синельников ИТ, Зоров И.Н., Ерохин Д.В., Джавахия ВТ, 2024
ORIGINAL ARTICLE
APPLICATION OF MICROBIAL RECOMBINANT PROTEIN
MF3 IN REFOLDING OF PLANT CHITINASE
1 1 12 Aleksandra M. Rozhkova , Yuri A. Denisenko , Igor G. Sinelnikov , Ivan N. Zorov ,
3 3
Denis V. Erokhin , Vitaly G. Dzhavakhia
1 Bach Institute of Biochemistry, Federal Research Centre "Fundamentals of Biotechnology" of the Russian Academy of Sciences Department of Chemistry, Lomonosov Moscow State University All-Russian Institute of Phytopathology Corresponding author: Alexandra Mikhailovna Rozhkova, amrojkova@yahoo.com
Abstract. Expression of recombinant proteins is important for studying their biological function. Most often, the expression system of the E. coli is used for the primary description of protein properties. However, under overexpression conditions, the rate of aggregation of target proteins often exceeds the rate of proper folding, resulting in the formation of insoluble inclusion bodies. Inclusion bodies are a clear disadvantage of the E. coli expression system because they interfere with the release of target recombinant proteins. One solution to the existing problem is the use of chaperone-like proteins in vitro to refold the target protein. In this work, the recombinant protein MF3 was taken as an example of a chaperone-like protein, which increased the yield of soluble plant chitinase by 92% compared to the yield of this protein using the standard refolding procedure.
Keywords: refolding, MF3, elicitors, chaperones
Financial Support. The work was supported by Russian Science Fund (Grant № 22-16-00154).
For citation: Rozhkova A.M., Denisenko Yu.A., Sinelnikov I.A., Zorov I.N., Erokhin D.V., Dzhavakhia V.G. Application of microbial recombinant protein MF3 in refolding of plant chitinase // Vestn. Mosk. un-ta. Ser. 2. Chemistry. 2024. T. 65. № 2. S. 152-160.
Экспрессия рекомбинантных белков важна для изучения их биологической функции [1]. Существует несколько стандартных систем экспрессии для производства целевых белков: бактерии, дрожжи, клетки насекомых, клетки млекопитающих и бесклеточные системы. Экспрессия в клетках млекопитающих и насекомых приводит к образованию биологически активных белков, которые содержат посттрансляционные модификации, такие как фосфорилирование, ацетилирование и гликозилирование. Однако экспрессия с использованием этих систем дает низкие выходы рекомбинантных белков, а стоимость этих систем обычно высока для производства белков в промышленных масштабах. Бесклеточные системы также не позволяют получать высокие выходы рекомбинантных белков. В настоящее время наиболее удобной и часто используемой системой для получения рекомбинантных белков является экспрессия в бактериях Escherichia coli [2].
Рекомбинантным белкам в процессе биосинтеза в E. coli часто требуются модуляторы сворачивания, так называемые белки-шаперо-ны. В условиях сверхэкспрессии скорость агрегации целевых белков часто превышает скорость правильного сворачивания, и собственные белки-шапероны быстро расходуются [3], что приводит к образованию нерастворимых телец включения. Тельца включения являются явным недостатком системы экспрессии E. coli [1], поскольку препятствуют выделению целевых рекомбинантных белков.
Существует множество химических и физико-химических способов снижения скорости образования телец включения при экспрессии в E. coli. Изменение условий роста, таких как температура роста, концентрация индуктора и время индукции, часто может помочь уменьшить образование телец включения (нерастворимой фракции белков). Недавно сообщалось, что ре-комбинантные белки сверхэкспрессируются в
растворимой форме при добавлении совместимых химических реагентов в среду экспрессии [4]. Вместо образования телец включения целевой белок может экспрессироваться в виде растворимого белка в присутствии сорбита, аргинина и трегалозы, добавленных при культивировании рекомбинантных штаммов. Эти добавки могут подавлять образование телец включения и тем самым повышать растворимость целевых белков в системах сверхэкспрессии E. Coli [4].
Для восстановления биологически активной растворимой формы рекомбинантных белков из телец включения существует метод рефолдинга. В типичной процедуре рефолдинга агрегированные формы денатурируют и растворяют с помощью высокой концентрации денатурантов, таких как мочевина и хлорид гуанидиния, или ионных детергентов, таких как N-лауроилсаркозин. Эти химические реагенты используются для уменьшения нековалентных взаимодействий между молекулами белка. Кроме того, добавляют дитио-треитол (DTT) или 2-мергаптоэтанол (2-МЭ) для уменьшения нежелательных меж- и/или внутримолекулярных дисульфидных связей. Рефолдинг денатурированных белков (р^вернутая форма) в активные белки (свернутая форма) происходит за счет удаления денатуранта. Эффективность рефолдинга, те. выход биологически активного белка можно оценить, например, по ферментативной активности.
Существует нескольких основных методов рефолдинга: эксклюзионная хроматография [5], обращенные мицеллярные системы [6], цеолит-поглощающие системы [7] и естественная ша-перонная система GroEL-GroES [8-10]. Методы рефолдинга, использующие хроматографические или нехроматографические стратегии, представлены в недавних обзорах [11-12]. Хотя эти методы хорошо работают для многих телец включения и денатурированных модельных систем, в большинстве случаев происходит значительное осаждение белков, что приводит к низкому выходу рефолдинга. Поэтому процедура рефолдинга для каждого конкретного белка по-прежнему выполняется с помощью серии предварительных оптимизационных экспериментов.
Например, для получения растительной хити-назы из плотоядных растений рода Drosera в растворимой форме в экспрессионной системе E. coli нами недавно были протестированы три разных подхода: диализ, быстрое разведение и рефолдинг на Ni-NTA-агарозе до ренатурации.
Разработанный протокол быстрого разведения с использованием ренатурационного буфера с добавлением 10%-го глицерина и 2 М аргинина в сочетании с окислительно-восстановительной парой восстановленного/окисленного глутатиона увеличил выход активного растворимого белка до 9,5 мг на 1 г сырой биомассы [13]. Тем не менее, поиск новых подходов к рефолдингу хитиназы все еще представляется актуальной задачей.
В этом смысле использование при рефолдин-ге дополнительных молекулярных шаперонов может быть оригинальным решением в получении растворимого рекомбинантного белка. Шапероны представляют собой белки, которые способствуют нековалентному сворачиванию или разворачиванию, а также сборке или разборке других макромолекулярных структур. Одной из основных функций шаперонов является предотвращение агрегации как вновь синтезированных полипептидных цепей, так и собранных субъединиц в нефункциональные структуры. Помимо своей фундаментальной роли в сворачивании белков de novo, шапероны участвуют в различных аспектах поддержания протеома, включая помощь в сборке макромолекулярных комплексов, транспортировке и деградации белков, а также диссоциацию агрегатов и рефолдинг стресс-дена^рированных белков [14]. Шаперон может связываться с экспрессируемым формирующимся белком внутри клетки и предотвращать его агрегацию, уменьшая скорость агрегации, вызванной образованием гидрофобных связей между специфическими сайтами на поверхности белковой глобулы [15].
Несколько исследований подтвердили преимущества шаперонов в сворачивании белков при совместной экспрессии. Некоторые системы шаперонов действуют как фолдазы: они поддерживают сворачивание белков АТФ-зависимым образом (например, система GroEL/GroES или система DnaK/DnaJ/GrpE) [16-17]. Другие шапероны действуют как холдазы (например, DnaJ или Hsp33): они связывают промежуточные соединения в процессе сворачивания, чтобы предотвратить их агрегацию [18-19]. Hsp60 (комплекс GroEL/GroES в E. coli) представляет собой наиболее охарактеризованный большой (~1 МДа) шаперонный комплекс. GroEL представляет собой двойное кольцо с гидрофобной открытой полостью, в просвете которой может разместиться нативный зеленый флюоресцентный белок (GFP, 54 кДа). GroES представляет собой гептамер, ко-
торый связывается с GroEL в присутствии АТФ или АДФ. Система GroEL/GroES конкурентна в процессах сворачивания целевого белка, те. его связывание внутри полости GroEL идет быстрее, чем агрегация [20]. Шапероны Hsp70 (DnaK в E. coli) представляют собой широко распространенный класс белков и, возможно, являются наиболее охарактеризованными небольшими (~70 кДа) шаперонами [14]. Белкам Hsp70 помогают белки Hsp40 (DnaJ в E. coli), которые увеличивают скорость потребления АТФ и активность Hsp70. Считается, что многие Hsp70 собираются вокруг развернутого субстрата, стабилизируя его и предотвращая агрегацию до тех пор, пока развернутая молекула не свернется должным образом, после чего Hsp70 теряют сродство к молекуле и диффундируют [21].
Иногда оптимизация условий роста, например снижение концентрации индуктора и температуры индукции, может не привести к получению белка в растворимой форме. Например, альдегид-дегидрогеназа (6-His-ALDH3A1) экспрессирова-лась с более высокой скоростью, но весь реком-бинантный белок находился в тельцах включения. Ни индукция при более низкой температуре, ни стратегия аутоиндукции не улучшали его растворимость. Тем не менее, совместная экспрессия двух групп молекулярных шаперонов (GroES/ GroEL и DnaK/DnaJ/GrpE) приводила к более высокому выходу растворимой активной формы ALDH3A1 [22]. Аналогичным образом, доля растворимого фермента хитобиазы была увеличена с 42 до 71% за счет совместной экспрессии системы шаперонов GroEL/ES и оптимизации условий культивирования рекомбинантных штаммов [23].
Однако существует и другая группа белков, улучшающая процесс рефолдинга. К ним относятся пептидил-пролил-^ис/т^анс-изомеразы (PPIase) [24], которые катализируют изомеризацию пептидных связей для достижения конфор-мационных изменений в нативных свернутых белках, а также обладают шаперон-подобной активностью [25-27].
В качестве примера можно привести РР1&зу FKBP-типа с приблизительной молекулярной массой 17 кДа (VaFKBP17), выделенную из бактерии Vibrio anguillarum O1. Ген ppi из V. anguillarum O1 был амплифицирован и экспрессирован в E. coli. Анализ изомеризационной активности с использованием нитроанилида сукцинил-Ala-Phe-Pro-Phe-p в качестве субстрата показал, что активность VaFKBP17 была максимальной при низкой температуре (5 °С) и щелочных условиях (pH 10). Для оценки шаперон-подобной активно-
сти VaFKBP17 было изучено влияние VaFKBP17 на рефолдинг Р-1,3-1,4-глюканазы из Bacillus sp. J-10, образующей тельца включения при сверхэкспрессии в клетках E. coli. Было показано, что повышение концентрации VaFKBP17 от 1 до 4 мкг увеличивает активность ß-глюканазы до 160% в сравнении с контролем (без добавления 4 мкг VaFKBP 17) [28].
Недавно во Всероссийском научно-исследовательском институте фитопатологии был выделен и охарактеризован новый белок-элиситор MF3 (microbial factor 3) из бактерии Pseudomonas fluorescens, способный индуцировать устойчивость растений к вирусным и грибным патогенам [29]. Определение полной аминокислотной последовательности MF3 [30] показало высокую степень его гомологии к пептидил-пролил-цис/транс-шош>разам FKBP-типа бактерии P. fluorescens [31], в связи с чем MF3 был отнесен к PPI^aM. MF3 обладает относительно низкой молекулярной массой (16,9 кДа), а также высокой термостабильностью, что значительно облегчает процесс выделения белка из клеточных лизатов. Был получен рекомбинантный штамм - продуцент MF3 в бактериальной системе экспрессии E. coli и оптимизирована методика очистки гомогенного препарата MF3 [32].
Цель настоящей работы - определение ша-перон-подобной активности PPI^bi MF3 в процессе рефолдинга растительной хитиназы D. capensis для увеличения выхода растворимого фермента.
Экспериментальная часть
Получение рекомбинантного ферментного препарата MF3
Методом ПЦР с использованием синтетических олигонуклеотидов
5 '-3': gacatatgctgatcgccgccaataag;
5 '-3': tcgcggccgctcagtggtgatggccaccttc был получен ПЦР-продукт размером 501 п.н., кодирующий белок MF3. Далее фрагмент был обработан эндонуклеазами рестрикции Ndel и NotI, очищен от компонентов реакции и коротких фрагментов ДНК с помощью Gel Extraction Kit («Qiagen», Германия). Затем была определена концентрация ДНК полученного фрагмента на приборе «NanoDrop Lite» («Thermo Fisher Scientific», США). Эндонуклеазами рестрикции Ndel и NotI был также обработан 1 мкг ДНК плаз-миды pET28a. Фрагменты ДНК после рестрикции были анализированы в 1%-м агарозном геле и затем выделены с помощью Gel Extraction Kit («Qiagen», Германия).
Фрагменты смешивали в эквимолярном соотношении и лигировали с помощью T4 ДНК-лигазы («Thermo Fisher Scientific», США) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Лигазная смесь была трансформирована в компетентные клетки Escherichia coli Machi («Invitrogen», США). Клетки высевались на ага-ризованую LB: триптон (10 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л), NaCl (5 г/л), бактериологический агар (20 г/л), канамицин (50 мкг/мл). Далее трансформанты культивировали на жидкой среде LB для выделения плазмидной ДНК («Plasmid Mini Kit», «Qiagen», Германия). Полученной плазмидной ДНК трансформировали штамм E. coli Rosetta™ (DES) («Merck», Германия). Селекцию трансформантов проводили на агаризованной среде LB с добавкой канамицмна (50 мкг/мл) и хлорамфени-кола (34 мкг/мл).
Отобранный рекомбинантный штамм E. coli MF3 переносили петлей в 5 мл жидкой среды LB (50 мкг/мл канамицин, 34 мкг/мл хлорамфеникол). Клетки выращивали 16 ч при 30 Затем ночную культуру разбавляли 1:100 средой ТВ. Состав среды TB: пептон микробиологический (12 г/л), дрожжевой экстракт (24 г/л), K2HPO4 (9,4 г/л), KH2PO4 (2,2 г/л), глицерин (4 г/л), канамицин (50 мкг/мл). Через 3 ч роста температуру снижали до 26 °С, вносили индуктор изопропил-ß-D-таогмаетопиранозил до 0,2 мМ и продолжали культивирование при 26 После культивирования надосадочную жидкость отделяли центрифугированием (4000 об/мин, 5 мин, 4 °С), а клетки ресуспендировали в 5 мл 50 мМ K-Ph-буфере (pH 7,0). Далее суспензия клеток была обработана ультразвуком 3 раза по 30 с с промежутком 1 мин на приборе «Sonics Vibra-cell» («Sonic Materials Inc», США). Суспензию клеток центрифугировали (13 000 об/мин, 15 мин, 4 X). Су-пернатант подвергали аффинной хроматографии на колонках с Ni-NTA («Qiagen», Германия) по стандартной процедуре фирмы-производителя.
Рефолдинг рекомбинантной растительной хитиназы
Растительная рекомбинантная эндохитиназа Drosera capensis была получена, как описано в [13]. После культивирования трансформированного штамма-продоцента E. coli Chit 100 мл куль-туральной среды центрифугировали и клетки ресуспендировали в 10 мл буфера (50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 100 мМ NaCl, 5 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF). Суспензию клеток разрушали ультразвуком (5x30 с), охлаждая на льду. Лизат бактерий центрифугировали при 12 000 g в течение 30 мин при
4 °С, супернатант и осадок отделяли и идентифицировали электрофорезом в полиакри-ламидном геле в денатурирующих условиях. Результаты показали, что эндохитиназа образует тельца включения. Осадок пять раз промывали
5 мл буфера (50 мМ Трис-HCl (pH 8,5), 100 мМ KCl и 2 М мочевина) для максимального удаления белков E. coli. Тельца включения осаждали в течение 15 мин при максимальных оборотах, супернатант удаляли. Осадок растворяли в 5 мл буфера для денатурации (50 мМ Трис-HCl (pH 8,5), 100 мМ KCl, 8 М мочевина, 1 мМ ЭДТА и 20 мМ ДТТ) в течение 2 ч при 40 °C. Раствор центрифугировали 15 мин при максимальной скорости.
Химические добавки и белки-шшероны способны в значительной степени способствовать правильному сворачиванию биомолекул [33]. Основной буфер рефолдинга включал 50 мМ Трис-HCl (pH 8,5) и 200 мМ KCl, с добавками: (NH4)2SO4, додецилсульфат натрия (ДСН). Twen 80, аргинин, аланин, глицин, глицерин, сахароза, 2-меркаптоэтанол (2-МЭ), глутатион GSH/ GSSH и MF3 в разных концентрациях. Концентрации ферментов в запасных растворах определяли на приборе «NanoDrop Lite» («Thermo Fisher Scientific», США). Соотношение концентрации эндохитиназы и MF3 составляло 10:1, 5:1, 2:1. Быстрое «шоковое» разведение белка в рефолдинг-буфере в соотношении 1:10 в некоторых случаях предпочтительнее постепенного диализа [34]. Раствор хитиназы в денатурирующем буфере (10 мг/мл) объемом 100 мкл охлаждали до 4 X и быстро добавляли к охлажденному образцу буфера для рефолдинга объемом 900 мкл при интенсивном перемешивании. Смесь инкубировали 24 ч, отделяли от осадка центрифугированием при 14 000 g в течение 15 мин. Эффективность рефолдинга оценивали по высвобождению растворимой формы хитиназы и ее активности.
Определение хитиназной активности и концентрации белка
Для измерения активности эндохитиназы использовали коллоидный хитин в качестве субстрата. Коллоидный хитин получали из хитина креветки («Sigma», США) по модифицированному методу Хсу [35]. К порошку хитина (40 г) медленно добавляли 600 мл концентрированной соляной кислоты, выдерживали в течение 60 мин при 30 °C и интенсивном перемешивании. Хитин осаждали в виде коллоидной суспензии, медленно разбавляя раствор в 2 л воды при 10 °C. Суспензию фильтровали и промывали дистиллиро-
ванной водой до нейтрального значения pH. Полученную суспензию использовали в работе для определения хитиназной активности.
Активность по хитину определяли методом, основанном на спектрофотометрической детекции выделяемого в ходе гидролиза N-ацетилглю-козамина. К 120 мкл суспензии коллоидного хитина (10 г/л), подогретого до 55 °С, добавляли 90 мкл ацетатного буфера (pH 5,0) и 60 мкл ферментного препарата (с концентрацией 1 мг/мл) После чего инкубировали 10 мин и добавляли 900 мкл красящего раствора (0,5 г/л гексацианоферрата(Ш) калия в 0,5 М Na2CO3). Смесь инкубировали 15 мин при 100 °С, центрифугировали и измеряли оптическую плотность при длине волны 400 нм [36]. За единицу хитиназной активности принимали количество фермента, необходимое для высвобождения 1 мкмоля ^ацетил^-глюкозоамина из коллоидного хитина в течение 1 мин.
Результаты и обсуждение
Влияние РРЫзы MF3 на процесс рефолдинга
рекомбинантной хитиназы из D. capensis
Электрофоретический анализ образцов эндо-хитиназы в клеточном дебрисе подтвердил наличие нерастворимой формы фермента, находящейся в виде телец включения. На рис. 1 представлена электрофореграмма, на которой видно, что полоса, соответствующая эндо-хитиназе массой 37 кДа, присутствует только в нерастворимой фракции.
Для определения шаперон-подобной активности у PPI^bi MF3 (т.е. изучения влияния MF3 на правильный фолдинг эндохитиназы) был проведен эксперимент по рефолдингу эндохитиназы в присутствии MF3 по аналогии с экспериментом, поставленным Geon A.J. с соавторами для рефолдинга Р-1,3-1,4-гдак1назы в присутствии PPI^bi VaFKBP17 [28]. Для сравнения эффекта были также протестированы буферы для рефолдинга c классическими добавками: 100 мМ (NH4)2SO4; 0,25% додецилсульфат натрия; 0,1% Twen 80; 0,25 М аргинин; 0,25 М пролин; 0,25 М глицин; 5% глицерин; 2 мМ 2-МЭ; глутатион GSH/GSSH 0,5/0,5%. Концентрация PPfebi MF3 в буфере для рефолдинга составляла 0,1; 0,2 и 0,5 мг/мл.
Как следует из рис. 2, сульфат аммония, Twen 80 и сахароза не оказали значительного влияния на выход эндохитиназы после рефолдинга, в то время как 2-МЭ и ДСН снизили выход рекомбинантного фермента по сравнению с контролем. В качестве контроля использовали основной буфер для рефолдинга (50 мМ
Трис-HCl (pH 8,5) + 200 мМ KCl). Глицерин является основной буферной добавкой, которая доказала эффективность рефолдинга для широкого спектра ферментов [37]. В случае добавления глицерина при рефолдинге эндохитиназы выход увеличился на 188% по сравнению с контролем. Добавление аминокислот, таких как аргинин, ала-нин, глицин увеличило выход на 122, 41, 44% соответственно. Аминокислоты могут действовать как «химические шапероны», взаимодействуя с гидрофобными участками полипептидной цепи и предотвращая внутри- и межмолекулярную агрегацию молекул белка [38]. Использование буфера для рефолдинга с окислительно-восстановительной парой глутатиона GSH/GSSG (1:1) увеличило выход эндохитиназы на 47%. Ранее эффективность использования окислительно-восстановительных пар глутатиона GSH/GSSG, используемых в соотношении 1:10, была продемонстрирована в работах по рефолдингу лизоци-ма [39]. Добавление белка PPtobi MF3 к эндохи-тиназе в количестве 0,1 и 0, 2 мг/мл не увеличило выход эндохитиназы. При добавлении 0,5 мг/мл MF3 наблюдалось увеличение выхода активной формы эндохитиназы на 92% по сравнению с контролем.
Полученные результаты согласуются с аналогичными данными для РР1аз FKBP-типа. Известно, что шапероны и фолдазы способствуют правильному сворачиванию полипептидов в функциональные белки внутри клеток. Шапероны, такие как DnaJ, DnaK, GrpE и GroE, определяются как белки, обеспечивающие правильное сворачивание при отсутствии ковалентных изменений. Они распознают и избирательно связываются с ненативными белками и подавляют агрегацию промежуточных продуктов сворачивания. Напротив, фолдазы катализируют ковалентные реакции, необходимые для сворачивания белка. Таким образом, фолдазы отличаются от шаперо-нов своим участием в ковалентных изменениях. На сегодняшний день охарактеризованы только два семейства фолдаз: протеиндисульфидизоме-разы и PPfebi. Однако в некоторых сообщениях предполагается, что РР^ы обладают шаперон-подобными функциями in vitro и in vivo [40, 41]. Интересно, что шаперон-подобная активность и эффективная активность сворачивания развернутых белков требуют дополнительных дискретных доменов. Однако MF3, как и VaFKBP17, состоит из одного домена. Поэтому одна из гипотез предполагает, что VaFKBP17 обладает ша-перон-подобной активностью, которая включает связывание субстрата (Р-1,3-1,4-глюкшазы) с его
Рис. 1. ПААГ-эле^офореграмма ф! - маркер, 1 - растворимая фракция, 2 - нерастворимая фракция, 3 - фермент после рефолдинга в буфере Трис-HCl + KCl, 4 - фермент после рефол-
динга в буфере с PPI MF3 0,55 мг/мл)
Рис. 2. Относительная активность эндохитиназы после проведения рефолдинга в буферах
с разными добавками
гидрофобным активным карманом. В этом ва- восстанавливают активность фермента, транс-рианте гидрофобные поверхности РР1азы вза- формируя белок в нативную форму [41, 42]. имодействуют с промежуточными продуктами Аналогичный вариант шаперон-подобной ак-неправильной укладки Р-1,3-1,4-глюканазы и тивности возможен и в случае взаимодействия
растительной эндохитиназы и РР1азы MF3, имеющей высокую степень гомологии с РР1^ами FKBP-типа, а именно, PaFKBP-25 (JQ0140) из Pseudomonas aeruginosa.
Эндохитиназа D. capensis обладает двухдо-менной структурой, состоящей из каталитического и хитин-связывающего доменов, соединенных протяженным линкером. Анализ 3D-CTpyKiypbi фермента, проведенный нами ранее [13], показал, что помимо наличия цистеинов в позициях С191, С231 и С286, обеспечивающих термодинамическую стабильность структуры на финальных этапах сворачивания белковой глобулы, существуют также и аминокислотные остатки на поверхности эндохитиназы, которые предположительно могут обеспечивать агрегацию белка за счет гидрофобных взаимодействий при сверхэкспрессии эндо-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Clark E.D.B. // Curr. Opm. Biotechnol. 2001. Vol. 12. P. 202.
2. Baneyx F. // Curr. Opin. Biotechnol. 1999. Vol. 10. P. 411.
3. Baneyx F., Mujacic M. // Nat. Biotechnol. 2004. Vol. 22. P. 1399.
4. Prasad S., Khadatare P.B., Roy I. // Appl. Environ. Microbiol. 2011. Vol. 77. P. 4603.
5. Li M., Su Z.-G., Janson J.-C. // Protein Expr. Purif. 2004. Vol. 33. P. 1.
6. Sakono M., Kawashima Y., Ichinose H., Maruyama T., Kamiya N., Goto M. // Biotechnol. Prog. 2004. Vol. 20. P. 1783.
7. Nara T.Y., Togashi H., Sekikawa C., Kawakami M., Yaginuma N., Sakaguchi K. // Colloids Surf. B Biointerfaces. 2009. Vol. 68. P. 68.
8. Zhi W., Landry S.J., Gierasch L.M., Srere P.A. // Protein Sci. 1992. Vol. 1. P. 522.
9. Eiberle M.K., Jungbauer A. // Biotechnol. J. 2010. Vol. 5. P. 547.
10. Sharapova O., Yurkova M., Fedorov A. // Protein Eng. Des. Sel. 2016; Vol. 29 (2). P. 57 (DOI: 10.1093/protein/ gzv060).
11. Hashemzadeh M., Mohammadi M., Ghaleh H., Sharti M., Choopani A., Panda A. // Protein Pept. Lett. 2021; Vol. 28 (2). P. 122 (DOI: 10.2174/0929 866527999200729182831).
12. Yamaguchi H., Miyazaki M. // Biomolecules. 2014. Vol. 20 (1). P. 235 (DOI: 10.3390/biom4010235).
13. Sinelnikov I.G., Siedhoff N.E., Chulkin A.M., Zorov I.N., Schwaneberg U., Davari M.D., Sin-itsyna O.A., Shcherbakova L.A., Sinitsyn A.P., Rozhkova A.M. // Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2021. Vol. 9 (DOI: 10.3389/ fbioe.2021.728501).
14. Kim Y.E., Hipp M.S, Bracher A., Hayer-Hartl M., Ulrich F. // Annu. Rev. Biochem. 2013. Vol. 82. P. 323.
15. Gottesman S., Wickner S., Maurizi M.R., Be-
хитиназы. Препятствуя этим взаимодействиям, РР1аза MF3 может обеспечивать более высокую растворимость активной растительной хитиназы при рефолдинге.
Таким образом, применение микробного ре-комбинантного белка MF3 в рефолдинге растительной эндохитиназы В. capensis в соотношении 2:1 (эндо-хитиназа : MF3) позволило увеличить выход активной формы фермента на 92% относительно контрольного буфера для ре-фолдинга, что можно объяснить наличием ша-перон-подобной активностти у MF3, являющейся РР1азой FKBP-типa. Полученный результат имеет также прикладное значение, позволяющее использовать микробный белок MF3 в рефолдинге гидрофобных белков вместо различных химических добавок.
als C.R., Clipstone N.A., Ho S.N., Crabtree G.R., Zamir I., Zhang J., Lazar M.A. // Genes Dev. 1997. Vol. 11. P. 815.
16. Amrein K.E., Takacs B., Stieger M., Molnos J., Flint N.A., Burn P. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. Vol. 92 (4). P. 1048.
17. Nishihara K., Kanemori M., Kitagawa M., Yanagi H., Yura T. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. Vol. 64 (5). P. 1694.
18. Hoffmann J., Linke K., Graf P., Lilie H., Jakob U. // https:/pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14685279/ EMBO J. 2004. Vol. 14 (1). P. 160 (DOI: 10.1038/sj.emboj.760001).
19. de Crouy-Chanel A, Kohiyama M, Richarme G. // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270 (39). P. 22669 (DOI: 10.1074/ jbc.270.39.22669).
20. Fenton W.A., Horwich A.L. // Q. Rev. Biophys. 2003. Vol. 36 (02). P. 229.
21. Mayer M., Bukau B. // Cell. Mol. Life Sci. 2005. Vol. 62 (6). P. 670.
22. Voulgaridou G.-P., Mantso T., Chlichlia K., Panayiotidis M.I., Pappa A. // PLoS One. 2013. Vol. 8 (2). e56582 (DOI: 0.1371/journal.pone.0056582).
23. Dangi A.K., Rishi P., Tewari R. // Protein J. 2016. Vol. 35 (1). P. 72.
24. Maruyama T, Furutani M. // Front Biosci. 2000. Vol. 5. P. 821 (DOI: 10.2741/maruyama).
25. Zhang X.C., Wang W.D., Wang J.S., Pan J.C. // FEBS Lett. 2013. Vol. 587 (6). P. 666 (DOI: 10.1016/j.febs-let.2013.01.028).
26. Liu C.P., Zhou Q.M., Fan D.J., Zhou J.M. // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2010. Vol. 42 (6). P. 890 (DOI: 10.1016/j. biocel.2010.01.019).
27. Ou W.B., Luo W., Park Y.D., Zhou H.M. // Protein Sci. 2001. Vol. 10 (11). P. 2346 (DOI: 10.1110/ps.23301).
28. Geon-A. J., Jong M.L., Gyuyou N., Dong S.K., So-Hyun K., Sun-Hee A., In-Soo K. // Protein Expression and Purification. 2015. Vol. 110. P. 130.
29. Shumilina D., Krämer R., Klocke E. // Phyto-pathol. Pol. 2006. Vol. 41. P. 39.
30. Шумилина Д.В., Джавахия ВТ. // Агро XXI. 2007. С. 12.
31. Isaki L., Beers R., Wu H.C. // J. Bacteriol., 1990. Vol. 172. P. 6512.
32. Popletaeva S., Statsyuk N., Voinova T., Arslanova L., Zernov A., Bonartsev A, Bonartseva G. Dzha-vakhiya V. // AIMS Microbiology. 2018. Vol. 4 (1). P. 192.
33. Yamaguchi S., Yamamoto E., Mannen T., Nagamune T., Nagamune T. //. Protein Biotechnol. J. 2013. Vol. 8. P. 17 (DOI: 10.1002/biot.201200025).
34. Wang Y., Van Oosterwijk N., Ali A.M., Adawy A., Anindya A.L., Dömling A.S.S., et al. // Sci. Rep. 2017. Vol. 7. P. 9355 (DOI: 10.1038/s41598-017-09687-z).
35. Hsu S.C., Lockwood J.L. // Applied Microbiology. Amer. Soc. Microbiol. 1975. Vol. 29 (3). P. 422.
36. Margoutidis G. et al. // ACS Sustainable Chemistry and Engineering. Amer. Chem. Soc. 2018. Vol. 6 (2). P. 1662.
37. Moghadam M. et al. // Varastegan Institute for Medical Sciences. 2015. Vol. 4 (1). P. 19.
38. Xia Y. et al. // International Journal of Biological Macromolecules. 2007. Vol. 40 (5). P. 437.
39. Bastings M.M.C. et al. // BMC Biotechnology. BioMed Central. 2008. Vol. 8 (1). P. 76.
40. Martino L. et al. // FEBS. 2009. Vol. 276. P. 4529.
41. Hartl F.U. et al. // Nature. 2011. Vol. 475. P. 324.
42. DeCenzo MI et al. // Protein Eng. 1996. Vol. 9. P. 173.
43. Galat A., Riviere S. // Peptidil-prolyl cys/trans isomerases. Oxford University Press. Oxford, New-York, Tokyo, 1998. 117 p.
Информация об авторах
Александра Михайловна Рожкова - ст. науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «^^вдаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. хим. наук (amrojkova@yahoo.com);
Юрий Андреевич Денисенко - науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Ф^зд^ентальные основы биотехнологии» РАН, канд. хим. наук (mailto:zcbm1@yandex.ru denisenkoyura@mail.ru);
Игорь Геннадьевич Синельников - мл. науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «^^вдаментальные основы биотехнологии» РАН, аспирант (sinelnikovi@Hstru);
Иван Никитич Зоров - вед. науч. сотр. химического факультета МГУ имени МЛ. Ломоносова, канд. хим. наук (inzorov@mail.ru);
Денис Валерьевич Ерохин - науч. сотр. отдела молекулярной биологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии» (erokhin.denis.v@gmail.com);
Виталий Георгиевич Джавахия - вед. науч. сотр. отдела молекулярной биологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии», канд. биол. наук (dzhavakhiya@yahoo. com).
Соблюдение этических стандартов
В данной работе отсутствуют исследования человека и животных. Вклад авторов
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Статья поступила в редакцию 30.10.2023; одобрена после рецензирования 12.11.2023; принята к публикации 14.11.2023.
