CC BY
15
ной и городской санитарно-эпидемиологической станции должны быть квалифицированные санитарные врачи, которые смогут решать все вопросы, связанные с проектированием и строительством больниц.
Поступила 17/1II 1956 г.
Ъ "fr i:
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПРИЖИЗНЕННОЙ ОКРАСКИ ТКАНЕЙ ДЛЯ ПРОМЫШЛЕННО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Доцент Е. М. Граменицкий
Из кафедры общей биологии Ленинградского санитарно-гигиенического медицинского
института
В промышленной токсикологии широкое [изменение получил патологогистологи-ческий метод исследования, выявляющий изменения в тканях и клетках и способствующий выяснению механизма действия токсических веществ на организм. Однако анализируя микроскопическую картину, наблюдаемую в гистологических препаратах, следует иметь в виду возможность .наличия артефактов, возникающих в результате сложной гистологической обработки объекта, что иногда может затруднить толкование полученных данных.
Разработанный Д. Н. Насоновым и его сотрудниками (Д. Н. Насонов и В. Я. Александров, 1940) метод прижизненной окраски тканей открывает широкие возможности для изучения структурных изменений, возникающих под влиянием токсических веществ в живой клетке, и уменьшает возможность возникновения артефактов.
Сравнительно .незначительное использование метода 'прижизненной окраски з токсикологии объясняется вероятно, тем, что в основном такого рода исследования выполняются на изолированных клетках. Для промышленной токсикологии больший интерес представляет выявление изменений в морфологии и деятельности всего организма.
Прижизненная окраска тканей в применении к целостному организму является менее разработанной. Между тем такая методика позволяет совместить изучение физиологических и морфологических изменений, возникающих в организме при воздействии исследуемых веществ (П. В Макаров, 1938; Е. В. Гублер, 1949; Н. И. Гре-бекская, 1951; А. А. Савич, 19Е2).
Наиболее пригодным для этой цели является прижизненный краситель — нейтральный красный (В. Я. Александров, 1948).
У позвоночных животных прижизненному микроскопическому исследованию доступен ряд клеток внутренних органов. При любых увеличениях можно изучать нервные клетки спинномозговых ганглиев, симпатической цепочки, сердца. Успешно исследуют при помощи метода прижизненной окраски мышечные и эпителиальные клетки, паренхиматозные клетки печени и эпителий мочевых канальцев почек.
О степени повреждения клеток можно также судить по величине сорбционного уровня прижизненного красителя. Применение колориметрической методики делает доступным для прижизненных исследований любой орган подопытного животного.
Примером использования метода прижизненной окраски являются проведенные нами исследования по изучению токсических свойств азотнокислого свинца.
Отравлению подвергали самцов осенне-зимних лягушек. В качестве прижизненного красителя использовали нейтральный красный. В большинстве опытов 1 % водный раствор красителя инъицировали в полость тела подопытных животных в дозе 0,3—0,5 мг/г. Одновременно с красителем лягушкам вводили в спинной лимфатический мешок различные дозы азотнокислого свинца. Животные контрольной группы получали только нейтральный красный. Примененная дозировка красителя, как показали специальные опыты, безвредна для подопытных животных (Е. М. Граменицкий, 1952).
Микроскопическому исследованию подвергали нервные клетки спинномозговых ганглиев и симпатических стволов, а также клетки печени и почек. Органы исследовали через час после одновременной инъекции
красителя и раствора соли СЕинца. Параллельно регистрировали изменения рефлекторной деятельности у подопытных животных. Всего было поставлено 180 опытов. В течение часа через каждые 10 минут визуально регистрировали рефлексы положения, позу тела, акты прыжка и плавания, роговичный рефлекс, ответную реакцию на механические, электрические и химические раздражения. В конце опыта извлекали и тотчас же микроскопировали исследуемые органы. В опытах использовали постепенно возрастающие дозы азотнокислого свинца от 1 до 10 мг/г.
У контрольных и подопытных животных, которым вводили свинец в дозе, меньшей 3 мг/г, не отмечалось изменений в характере окраски: нейтральный красный откладывался в цитоплазме исследуемых клеток в виде гранул. На рисунке (а) представлена прижизненная окраска контрольного препарата симпатических нервных клеток в конце первого часа
d
Прижизненна» окраска нервных клеток симпатической цепочки лягушки.
а — контроль; б — опыт.
после инъекции красителя. В бесцветной цитоплазме заметны многочисленные гранулы красителя, располагающиеся вокруг ядра. Ядро клетки не окрашено, но о его расположении можно судить по локализации гранул, окружающих его кольцом. По периферии клеток гранулы красителя, как правило, не отмечаются. Гранулярный тип окраски отмечали в клетках и других исследованных органов контрольных животных.
При введении азотнокислого сзинца в дозе 3 мг/г наблюдались изменения в характере прижизненной окраски паренхиматозных клеток печени. Эту дозу можно назвать условнопороговой для исследуемого представителя кЛасса амфибий.
В клетках печени становились заметными хорошо контурированные овальные яркокрасные ядра, цитоплазма приобретала равномерную диффузную, малиновую окраску, количество гранул резко уменьшалось по сравнению с контрольным материалом, т. е. проявлялся комплекс изменений, характеризующий паранекротический тип окраски. Одновременно развивались функциональные нарушения нервной системы, которые первоначально не отражались на характере отложения красителя в цитоплазме нервных клеток.
При увеличении дозировки наступали изменения в характере окраски клеток других органов. Впервые отчетливые изменения прижизненной окраски нервных симпатических клеток наблюдались при дозе свинцовой соли в 7 мг/г. При этой дозе симпатические клетки животных имели отличный от контрольных препаратов характер окраски: цитоплазма приобретала равномерную диффузную, малиновую окраску, ядро клетки становилось отчетливо заметным, так как кариоплазма интенсивно про-
крашивалась, также окрашивалось и ядрышко. Гранулы в цитоплазме отсутствовали. Получающиеся изменения прижизненной окраски были необратимыми (см. рисунок, б и таблицу).
К концу опыта, т. е. через час после одновременного введения раствора соли свинца и красителя, резко нарушалась координация движений, что затрудняло акты прыжка и плавания, терялся установочный рефлекс. Животное не переворачивалось из спинного положения. Рого-вичный рефлекс, а также ответные двигательные реакции задних конечностей на различные раздражения сохранялись.
В этой серии опытов животные погибали в течение ближайших 5—7 часов.
При увеличении дозы азотнокислого свинца до 10 мг/г наступали резкие изменения в окраске и клеток эпителия мочевых канальцев: цитоплазма окрашивалась диффузно, гранулы не возникали, отчетливо прокрашивались ядро и ядрышко. Животные в этой серии опытов погибали в течение Р/г—3 часов.
Результаты изменений прижизненной окраски всех исследуемых клеток, возникающих под влиянием возрастающих доз азотнокислого свинца, представлены в таблице, из которой видно, что в чувствитель-
Прижизненная окраска клеток органов лягушки при одновременном введении нейтрального красного и азотнокислого свинца (средние данные из 50 опытов)
к к к ^ Й £ 3 Я л - Прижизненная окраска
о о 3 я и 3 = £ 5 о о — 3 8 Название клеток гранулы ядро цитоплазма
3 Чувствительные нервные . Симпатические » ... Печеночные...... Канальцев почек .... + + 0 + 0 0 + 0 0 0 + 0
7 Чувствительные нервные Симпатические » ... Печеночные...... Канальцев почек ..... + 0 0 + 0 + + 0 0 +. 4-0
10 Чувствительные нервные Симпатические » ... Печеночные...... Канальцев почек ..... 4-0 0 0 • о + + 0 + + +
ных нервных клетках сохраняется гранулярный характер окраски, несмотря на полное отсутствие рефлекторной возбудимости у подопытных животных. Отсутствие диффузной окраски нельзя объяснить методическими недочетами опыта, так как наличие гранул показывает, что в клетку проникало достаточное количество красителя.
Разбирая вопрос о влиянии азотнокислого свинца на нервную систему, следует предположить, что первоначально под влиянием <5винца возникают функциональные изменения в деятельности нервной системы, которые метод прижизненной окраски не выявляет, и лишь в дальнейшем наступают морфологические изменения в клетках, регистрируемые этим методом.
Во Есех опытах применяли концентрированные растворы свинца, которые местно создавали значительную гипертонию. Можно было предположить, что именно гипертония, а не специфическое влияние свинцовой соли вызывает описанные физиологические и морфологические изменения. Чтобы проверить правильность этого предположения, были поставлены две серии опытов, в которых в спинной лимфатический мешок вводили растворы поваренной соли и азотнокислого натрия в изотонических концентрациях по отношению к применяемому раствору свинцовой соли.
Обе серии опытов показали, что животные, получившие эквивалентные по тоничности раствору свинца дозы ЫаС1 и ЫаЫОз, оставались совершенно нормальными более 9 суток, а в клетках исследуемых органов не изменялся характер прижизненной окраски. Таким образом, сама по себе гипертония не вызывает изменений ни рефлекторной деятельности, ни прижизненной окраски клеток.
Результаты основной серии опытов показывают, что наступавшие изменения являются результатом специфического действия ионов свинца, так как наличие аниона N03 в азотнокислом натрии ни в чем не проявляется.
Метод прижизненной окраски дал возможность выявить, что при свинцовом отравлении наступают морфологические изменения в цитоплазме и ядре клеток различных органов.
Выводы
1. Метод прижизненной окраски организма может быть использован для изучения экспериментальною свинцового отравления, при котором этим методом выявляются морфологические изменения в клетках различных органов.
2. Метод прижизненной окраски в предлагаемой модификации, вероятно, может быть применен для изучения токсических свойств и других промышленных ядов
ЛИТЕРАТУРА
Александров В. Я., Бюлл. зксперим. биол. и мед., 1948, т. 25, в. 3, стр. 233—236. — Г р а м е н и ц к и й Е. М., Бюлл. зксперим. биол. и мед., 1952, т. 34, № 8, стр. 76—78. — Гребен ска я Н. И., Анализ влияния окиси углерода на организм методом прижизненной окраски. Автореферат дисс., Л., 1951. —Губ л ер Е. В.. О прижизненном отложении нейтралрот в ткани мозга и мышцы при кислородном голодании. Реферат дисс., Л., 1949. — М а к а р о в П. В., Архив анат., гистол. ,и эм-бриол., 1938, 19, 1—2, стр. 5—104,—Н а с о н о в Д. Н., Александров В. Я., Реак ция живого вещества на внешние воздействия, М.—Л., 1940. — С а в и ч А. А., Изменение чувствительности к наркотикам в онтогенезе и филогенезе. Автореферат дисс.. Л.. 1952.
Поступила 9/IV 1955 г
-ЙГ #
1 Описанный метод может 'представлять интерес для гигиены, если будет доказано, что изменения в прижизненной окраске наблюдаются при малых дозах ядовитых веществ .в условиях хронического эксперимента. Ред.
