CC BY
7© Коллектив авторов, 2016 Вопросы онкологии, 2016. Том 62, № 1
УДК616.345-006;61:575
А.А. Евдокимов1, н.А. нетесова1, н.А. Сметанникова1, М.А. Абдурашитов1, А.Т. Акишев1, Е.С. давидович1, Ю.д. ермолаев2, А.Б. Карпов2, А.Э. Сазонов2, р.М. тахауов2,
С.Х. дегтярев1
Применение метода GLAD-ПЦP анализа для выявления сайтов метилирования в регуляторных областях генов-онкосупрессоров ЕЬМ01
и ЕSR1 при колоректальном раке
1 ФБуН «государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Новосибирская область,
р.п. кольцово
Фгуп «северский биофизический научный центр» ФМБА россии, г. северск, томская область
Аберрантное метилирование регуляторных областей генов-онкосупрессоров показано для многих онкологических заболеваний. Разработанный нами ранее метод GLAD-ПЦР анализа был применен для выявления сайтов R(5mC)GY, возникающих при аберрантном метилировании регуляторных областей генов ELMO1 и ESR1 в препаратах ДНК клеточной линии SW837 и тканей опухоли толстой кишки. Отобрано по 4 сайта для каждого гена и установлено, что в ДнК линии SW837 наиболее метилированными являются сайт GCGC в первом экзоне гена ELMO1 и сайт GCGT в промоторе гена ESR1. Сайт GCGT в промоторе гена ESR1 слабо метилирован в нормальных тканях и метилирован в большинстве опухолевых тканей. сайт GCGC в первом экзоне гена ELMO1 неметилирован в ДнК нормальных тканей и метилирован в 60% образцов опухолевых ДНК. Обсуждаются возможности применения GLAD-ПЦР анализа препаратов внеклеточной ДНК крови пациентов для диагностики колоректаль-ного рака.
Ключевые слова: метилирование ДНК, гены-онкосупрессоры, колоректальный рак, ПЦР
Метилирование ДНК играет важную роль в развитии онкологических заболеваний. На ранних стадиях канцерогенеза происходит метилирование de novo регуляторных областей ряда генов, что приводит к выключению их экспрессии, тогда как в здоровой ткани данные области неметилированы и соответствующие гены активны [6]. Такое ненормальное (аберрантное) метилирование было показано для целого ряда генов-онкосупрессоров в опухолевых тканях [2,6], причем, набор этих генов отличается в различных опухолях [11]. В частности, для коло-ректального рака показано наличие аберратного метилирования более 50 генов [5,8,9,12,15].
У млекопитающих метилирование ДНК de novo, включая и аберрантное метилирование, осуществляют ДНК-метилтрансферазы Dnmt3a и Dnmt3b, которые узнают сайт 5'-RCGY-3' и модифицируют внутренний CG-динуклеотид с образованием последовательности 5'-R(5mC)GY-3' в обеих цепях ДНК [7], где R - A или G, Y - T или C, 5mC - 5-метилцитозин. В дальнейшем, метилирование вновь образованных модифицированных сайтов поддерживается в ходе репликации ДНК с помощью ДНК-метилтрансферазы Dnmt1. Недавно обнаруженная метилзависимая сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза GlaI узнает и расщепляет именно сайт R(5mC)^GY [13], что делает ее удобным инструментом для выявления метилированных de novo сайтов в ДНК человека. Ранее на основе фермента GlaI нами был разработан метод GLAD-ПЦР анализа, позволяющий выявлять наличие молекул ДНК с сайтом R(5mC)GY в заданном положении генома человека даже в условиях избытка других молекул ДНК, где этот сайт неметилирован [3].
Целью данной работы явилось изучение возможности использования GLAD-ПЦР анализа для определения аберрантного метилирования сайтов R(5mC)GY в регуляторных областях генов ELMO1 и ESR1 в препаратах ДНК из опухолевых тканей при колоректальном раке.
Материалы и методы
Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из образцов ткани опухоли толстой кишки и здоровой ткани больных колоректальным раком. Во всех случаях злокачественного новообразования диагноз был подтвержден морфологически (аденокарцинома различной степени дифференцировки). По стадии заболевания больные распределялись следующим образом: 2 больных (номера пациентов 1 и 76) имели I стадию заболевания (T1N0M0), 3 пациента (номера 16, 20 и 37) - II стадию (T2N0M0), 6 больных (номера пациентов 2, 19, 31, 50, 54 и 56) - III стадию (T1-4N1-2M0) и у 4 больных был диагностирован генерализованный колоректальный рак (наличие отдалённых метастазов (М1 при любых вариантах размера опухоли
Рис. 1. Анализ статуса метилирования сайтов RCGY (а) - фрагмент нуклеотидной последовательности регуляторной области гена ELM01. Показаны сайты RCGY участки связывания геномного праймера, зонда и З'-концевого тетрануклеотида в гибридных праймерах; (б) - кривые накопления флуоресценции в ходе ПЦР в режиме реального времени с использованием различных гибридных праймеров. Заглавными буквами "GCCG" на рисунках обозначен З'-концевой тетрануклеотид гибридного праймера, соответствующего точке гидролиза ДНК по наиболее метилированному сайту; (в) и (г) - аналогичные данные для гена ESR1. Цифры перед нуклеотидной последовательностью и после нее - координаты по версии генома
человека GRCh38.p2 из базы данных GenBank.
(Т) и наличия или отсутствия метастатического поражения регионарных лимфатических узлов (Ы)) ( пациенты номер 25, 51, 59 и 75). У всех доноров биологического материала было получено информированное согласие на участие в исследовании.
Образцы ткани опухолей (п=15), полученные при выполнении оперативного вмешательства, помещались в пробирку, содержащую раствор RNA-later и хранились в течение суток в холодильнике при температуре +4°С, затем переносились в морозильную камеру и хранились при температуре -20°С. В качестве контрольных образцов использовались фрагменты здоровой ткани толстой кишки (п=5), которые брались на значительном удалении от опухолевого очага, на линии резекции. Процедура консервации и хранения образцов здоровой ткани была аналогична описанной для опухолевой ткани.
Выделение ДНК. Выделение и очистку ДНК из опухолевых и здоровых тканей, а также ДНК клеток аденокар-циномы ободочной кишки человека линии SW837, использованной для выявления перспективных для GLAD-ПЦP анализа сайтов R(5mC)GY, проводили методом фенол-хлороформной экстракции [4].
Для GLAD-ПЦP анализа [3] использовали по 45 нг препаратов ДНК и следующие праймеры и зонды:
ELMO1g GGGTCGCCGGAGCTCTGA;
ELMO1z FAM-AACCCTTGCCGCTGCTGTCCTGC-ВЩ1;
ELMO1h1 CCTGCTCTTTCATCGGСCA; ELMO1h2 CCTGCTCTTTCATCGGСGG;
ELMO1h3 CCTGCTCTTTCATCGGСCG; ELMO1h4 CCTGCTCTTTCATCGGCCT;
ESR1g CGCAGGGCAGAAGGCTCAGAA;
ESR1z FAM-TGCTCTTTTTCCAGGTGGCCCGCC-BHQ1;
ESR1h1 CCTGCTCTTTCATCGGTCG; ESR1h2 CCTGCTCTTTCATCGGCTG;
ESR1h3 CCTGCTCTTTCATCGGTGT; ESR1h4 CCT-GCTCTTTCATCGGTTC,
где g - геномный праймер; z - флуоресцентно-меченный зонд; hl, h2, h3 h4 - гибридные праймеры. Анализ данных и их статистическая обработка осуществлялись с помощью программ «Bio-Rad CFX Manager v.2.1».
результаты и обсуждение
описание исследуемых фрагментов Днк.
На рис. 1 представлены координаты регулятор-ных участков генов ELMO1 и ESR1, выбранных для исследования. В случае гена ELMO1 изучаемый участок представляет собой фрагмент CpG-островка в районе первого экзона длиной 154 нуклеотида, тогда как в гене ESR1 определяли метилирование сайтов RCGY в участке CpG-островка длиной 183 нуклеотида в промоторной области. Как представлено на рисунке, исследуемые участки содержат по 4 сайта RCGY, которые могут подвергаться модификации в случае аберрантного метилирования и расщепляться затем ферментом GlaI.
Выявление сайтов R(5mC)GY, перспективных для GLAD-пцр анализа. GLAD-ПЦР анализ сайтов R(5mC)GY проводится в три этапа. Сначала ферментом GlaI расщепляются посередине все имеющиеся в ДНК сайты R(5mC) GY с образованием тупых концов. Затем ко всем полученным фрагментам ДНК подшивается уникальный адаптер, после чего ставится ПЦр с праймера, соответствующего этому адаптеру, и второго праймера, комплементарного изучаемому фрагменту ДНК. В результате при наличии огромного количества разных фрагментов, полученных после гидролиза ДНК и последующей сшивки, ПЦр идет преимущественно с того фрагмента, который расположен рядом с целевым сайтом R(5mC)GY. Использование зонда, также имеющего уникальную структуру, позволяет еще больше повысить специфичность реакции.
В первой части работы проводили выявление сайтов R(5mC)GY в пределах выбранных участков регуляторных областей генов-онкосу-прессоров с целью отбора наиболее метилированных сайтов для дальнейшего GLAD-ПЦР анализа клинических образцов. Для поиска таких сайтов использовали препарат ДНК из клеточной линии SW837. Для каждого из восьми сайтов RCGY, присутствующих в изучаемых фрагментах регуляторных участков генов ELMO1 и ESR1, использовали соответствующий гибридный праймер.
Структура гибридного праймера для каждого эксперимента указана в методах. Гибридный
праймер представляет собой последовательность ДНК 5'-CCTGCTCTTTCATCGGYNN-3', где 5'-концевая 15-тинуклеотидная часть праймера соответствует универсальному олигонуклеотид-ному адаптеру, а тетрануклеотидная часть на З'-конце (выделена подчеркиванием) комплементарна геномной последовательности в точке гидролиза ДНК метилзависимой эндонуклеазой GlaI. Данная структура предполагает существование 32 вариантов гибридных праймеров, соответствующих различным концевым последовательностям, получаемых после гидролиза GlaI всех возможных вариантов последовательности
На рис. 1 представлены результаты GLAD-ПЦР анализа восьми сайтов R(5mC)GY на изучаемых регуляторных участках генов ЕЬМ01 и ESR1. В том и другом случае GLAD-ПЦР анализ показывает метилирование трех сайтов RCGY, расположенных один за другим рядом с последовательностью зонда. При этом, однако, для обоих генов наибольшая степень метилирования наблюдается в третьем по счету сайте от положения зонда (на рисунке его концевая те-трануклеотидная последовательность приведена прописными буквами). Соответственно, в дальнейшей работе проводили GLAD-ПЦР анализ сайта GCGC в положении 37448622 на седьмой хромосоме (первый экзон гена ЕЬМ01) и сайта GCGT в положении 151807784 на шестой хромосоме (промотор гена ESR1).
GLAD-ПЦP анализ сайтов метилирования в препаратах Днк из образцов тканей. Исследовали ДНК из образцов операционного материала опухолей (п=15) и нормальной слизистой кишечника (п=5) больных колоректальным раком. GLAD-ПЦР анализ двух установленных сайтов GCGC и GCGT в регуляторных участках генов ЕЬМ01 и ESR1 осуществляли с использованием препаратов ДНК из образцов тканей, выделенных, как описано в методическом разделе.
GLAD-ПЦР анализ двух выбранных сайтов проводили в трех повторах, в каждом из которых анализируемый образец ДНК содержал 103 копий гена ЕЬМ01 или ESRL В табл. 1 представлены полученные результаты GLAD-ПЦР анализа в виде средних значений числа циклов амплификации (Cq) с указанием величин отклонений; а на рис. 2 — в виде диаграммы.
В таблице в случае сайта GCGT в промоторе гена ESR1 значения Cq для четырех препаратов ДНК из здоровых тканей варьируют от 25,75 до 26,76, и у одного препарата эта величина составляет 31,53. Таким образом, данный сайт слабо метилирован в четырех образцах нормальных тканей и практически неметилирован в образце 56Х Из рис. 2 следует, что в препаратах ДНК из опухолевых тканей величина Cq меньше, чем
Рис.2 Число циклов амплификации Cq для ДНК исследованной группы тканей. По оси абсцисс - номера образцов ("Ш" - норма, "Т" -опухоль), по оси ординат - средние значения Cq по результатам трех повторов с указанием разброса данных. Пунктирными линиями обозначены минимальные значения Cq,полученные для нормальных тканей.
Таблица 1.
Число циклов амплификации (Ся) с указанием среднеквадратичных отклонений (полученопо результатам GLAD-ПЦР анализа)
Ген Тип ткани Номера образцов
56 75 76 59 54 1 2 16 19 20 25 31 37 50 51
ESR1 Норма 31,53 ±1,54 25,75 ±0,30 27,08 ±0,07 26,36 ±0,30 26,76 ±0,34
Опухоль 26,76 ±0,30 23,51 ±0,17 24,06 ±0,17 24,41 ±0,54 22,87 ±0,37 24,8 ±0,35 24,67 ±0,10 23,68 ±0,82 25,35 ±0,49 24,44 ±1,12 25,78 ±0,89 27,55 ±0,33 25,05 ±0,11 24,93 ±0,08 25,45 ±0,16
ELM01 Норма >34 31,35 ±0,40 29,34 ±0,08 >34 31,34 ±2,00
Опухоль 27,21 ±0,40 24,52 ±0,05 23,67 ±0,17 24,26 ±0,06 23,14 ±0,02 32,37 ±1,56 29,51 ±1,20 24,84 ±0,22 >34 31,44 ±1,11 >34 26,03 ±0,27 25,79 ±0,26 33,6 ±1,10 26,5 ±1,01
в нормальных тканях, т.е. в большинстве изученных образцов сайт GCGT в промоторе гена ESR1 более метилирован в опухолевых тканях, чем в здоровых.
Результаты GLAD-ПЦP анализа сайта GCGC в первом экзоне гена ELMO1 показывают (рис. 2), что для здоровых тканей полученные значения Cq близки к 30 или больше этой величины, что соответствует отсутствию метилирования этого сайта. Схожие величины Cq были получены для шести препаратов опухолевых тканей 1Т, 2Т, 19Т, 20Т, 25Т и 50Т. В то же время, для остальных девяти опухолевых тканей Cq варьирует от 23,14 до 27,21, что соответствует заметному метилированию изучаемого сайта GCGC в препаратах ДНК.
Существенное метилирование указанных сайтов в обоих генах наблюдается в опухолевых тканях шести образцов под номерами 16, 37, 54, 59, 75 и 76. Значительное метилирование одного из генов наблюдается еще в шести образцах опухолевых тканей под номерами 1, 2, 31, 50, 51, 56 (рис. 2). Эти 12 образцов представляют все четыре стадии заболевания, что соответствует данным литературы о статусе метилировании регуляторных областей генов-онкосупрессоров при развитии и прогрессировании опухоли [2,6].
Перспективы применения GLAD-ПЦP анализа для диагностики
Полученные результаты показывают, что GLAD-ПЦР анализ позволяет выявить сайты R(5mC)GY, возникающие при аберрантном метилировании регуляторных областей генов-онко-супрессоров в опухолевых тканях и клеточной линии SW837. Сайт GCGT в промоторе гена ESR1 слабо метилирован в здоровых тканях, однако в большинстве опухолевых тканей наблюдается увеличение его метилирования. Сайт GCGC в первом экзоне гена ELMO1 неметили-рован в здоровых тканях и метилирован в 60% образцов опухолевых тканей.
В настоящее время существуют методы определения аберрантно метилированной внеклеточной ДНК в крови пациентов на основе бисульфит-ной конверсии ДНК [10, 14]. Однако, эти методы трудоемки и часто дают ошибочные результаты, в связи с чем они практически не используются. Применение СЛАР-П1ЦР анализа позволяет определить наличие аберрантно метилированной внеклеточной ДНК существенно более простым и надежным методом, заключающимся, по сути, в последовательной обработке ДНК двумя ферментами и проведении последующей ПЦР в режиме
реального времени. В дальнейшем планируется продолжить работу с образцами тканей для выявления сайтов аберрантного метилирования, пригодных для GLAD-ПЦР анализа, в регуля-торных районах других генов-онкосупрессоров. Из набора проверенных сайтов будут отобраны те из них, метилирование которых наблюдается в наибольшем количестве образцов опухолевых тканей при условии отсутствия их метилирования в здоровых тканях. Сформировав панель таких сайтов, можно будет перейти к GLAD-ПЦР анализу препаратов внеклеточной ДНК из крови пациентов с целью разработки относительно простого и доступного метода лабораторной диагностики колоректального рака.
По результатам работ оформлен патент «Способ определения метилирования сайтов PuCGPy регуляторных областей генов-онкомаркеров коло-ректального рака методом GLAD-ПЦР-анализа и олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые зонды для осуществления указанного способа», приоритет от 16.07.15 N 2015129314.
работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки российской Федерации по Соглашению № 14.604.21.0102 от 05.08.2014 г. (уникальный идентификатор RFMEFI60414X0102), заключенному в рамках Федеральной целевой программы «исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса россии на 2014-2020 годы».
ЛИТЕРАТУРА
1. Абдурашитов М.А., Чернухин В.А., Томилов В.Н. и др. Рестрикционный анализ ДНК человека - новые возможности в ДНК-диагностике // Мед. генетика. 2007.- Т. 6. - № 8. - С. 29-36.
2. Киселева Н.П., Лихтенштейн А.В. В кн.: Канцерогенез / Под ред. Д.Г. Заридзе. М., - 2004.
3. Кузнецов В.В., Акишев А.Г., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Способ определения нуклеотидной последовательности Pu(5mC)Py в заданном положении протяженной ДНК // Патент РФ № 2525710. - 2013.
4. Смит К., Клко С., Кантор Ч. Анализ генома. Методы / Под ред. К. Дейвиса. М., - 1990.
5. Caiazza F., Ryan E.J., Doherty G. et al. Estrogen receptors and their implications in colorectal carcinogenesis // Front. Oncol. - 2015. - Vol. 5. - P. 19.
6. de Caseres I.I., Cairus P. Methylated DNA sequences for early cancer detection, molecular classification and chemotherapy response prediction // Clin. Transl. Oncol. - 2007. - Vol. 9. - N 7. - P. 429-437.
7. Handa V., Jeltsch A. Profound sequence preference of Dnmt3a and Dnmt3b mammalian DNA methyl-transferases shape the human epigenome // J. Mol. Biol. - 2005. - Vol. 348. - N 5. - P. 1103-1112.
8. Kibriya M.G., Raza M., Jasmine F. et al. A genome-wide DNA methylation study in colorectal carcinoma // BMC Med. Genomics. - 2011. - Vol. 4. - P. 50.
9. LaPointe L.C., Pedersen S.K., Dunne R. et al. Discovery and validation of molecular biomarkers for colorectal adenomas and cancer with application to blood testing // PLoS One. - 2012. - Vol. 7:e29059.
10. Lao V.V., Grady W.M. Epigenetics and colorectal cancer // Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. - 2011. - Vol. 8. - P. 686-700.
11. Mishra D.K., Chen Z., Wu Y et al. Global methylation pattern of genes in androgen-sensitive and andro-gen-independent prostate cancer cells // Mol. Cancer Ther. - 2010. - Vol. 9. - N 1. - P. 33-45.
12. Mitchell S.M., Ross J.P., Drew H.R. et al. A panel of genes methylated with high frequency in colorectal cancer // BMC Cancer. - 2014. - Vol. 14. - P. 54.
13. Tarasova G. V., Nayakshina T.N., Degtyarev S. Kh. Substrate specificity of new methyl-directed DNA endonucle-ase Glal // BMC Mol. Biol. - 2008. - Vol. 9:7.
14. Umer M., Herceg Z. Deciphering the epigenetic code: an overview of DNA methylation analysis methods // Antioxid. Redox. Signal. - 2013. - Vol. 18. - P. 1972-1986.
15. Yagi K., Akagi K., Hayashi H. et al. Three DNA methylation epigenotypes in human colorectal cancer // Clin. Cancer Res. - 2010. - Vol. 16. - N 1. - P. 21-33.
Поступила в редакцию 17.09.2015 г.
AA.Evdokimov1, NA.Netesova1, N.A.Smetannikova1, MA.Abdurashitov1, A.G.Akishev1, E.S.Davydovich1, Yu.D.Ermolaev2, A.B.Karpov2, A.E.Sazonov2, R.M.Takhauov2, S.Kh.Degtyarev1
Application of GLAD-PCR analysis for the methylation sites detection in the regulatory areas of tumor-suppressor genes ELMO1 and ESR1 in colorectal cancer
1State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector"
2Seversk Biophysical Research Centre Tomsk region
Aberrant methylation of regulation regions of tumor-suppressor genes is showed for many cancer diseases. In course of this modification an enzyme DNMT3 methylates RCGY sites in CpG-islands of regulation regions producing R(5mC)GY sites. Earlier we developed GLAD-PCR assay to determine R(5mC)GY site in a definite position of human genome. In this work we have applied GLAD-PCR assay to determine R(5mC)GY sites in regulation regions of ESR1 and ELMO1 tumor-suppressor genes. We have studied a fragment of first exon of ELMO1 gene and a part of ESR1 promoter region in DNA preparations from malignant cell line SW837 and colorectal tumor samples. We have checked four sites in each region and found two highly methylated sites: GCGC in first exon of ELMO1 gene and GCGT in promoter region of ESR1 gene. Site GCGT is weakly methylated in healthy tissues and more methylated in the most of colorectal samples. Site GCGC is not methylated in healthy tissues and significantly methylated in 60% of colorectal samples. A possibility to use GLAD-PCR assay for cancer diagnostics is discussed.
Key words: DNA methylation, tumor-suppressor genes, colorectal cancer, PCR
