CC BY
9
протяжении последних 25 лет он возглавлял секцию гигиены детей и подростков Московского отделения Всесоюзного общества гигиенистов и санитарных врачей, был почетным членом Чехословацкого медицинского общества им. Пур-кинье, Научного общества гигиенистов Болгарии, Венгерского медицинского общества Жозе-фа Федора.
% Сергей Михайлович Громбах был талантливым, широко эрудированным человеком, при-
знанным исследователем пушкинского наследия, ученым с высокими нравственными принципами, преданно и беззаветно служившим советской науке.
Литература
1. Громбах С. М. Гигиена детей и подростков как отрасль гигиенической науки.— М., 1965. — Вып. 1.
2. Громбах С. М. Гигиена детей и подростков в СССР за 50 лет. — М., 1970. — Вып. 2.
Поступила 31.10.88
Методы исследования
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1989 УДК 614.777:015.91-074:543.426
Г. Н. Красовский, В. И. Жуков, Л. А. Бондаренко, Т. С. Дергачева
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА БИОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ В САНИТАРНО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
НИИ общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина, Москва; Харьковский медицинский институт
В последние годы биохемилюминесценция (БХЛ) привлекает все более пристальное внимание представителей медицины. В Советском Союзе начальным этапом в исследовании сверхслабого свечения явилось создание в конце 60-х годов установки для его регистрации [1].
Энергия спонтанного сверхслабого свечения образуется за счет неферментативного сзободно-радикального процесса окисления липидов орга-нов и тканей организма. Как известно, низкий ^ уровень БХЛ обусловлен тем, что процессам неферментативного окисления противопоставлена совокупность тканевых биоантиокислителей. Установлена прямая зависимость между уровнем окислительных процессов в органах и тканях и концентрацией в них свободных радикалов. Физиологическому состоянию метаболизма соответствует определенный уровень свободнорадикаль-ного окисления липидов и соответственно определенный уровень БХЛ [4]. Отклонения во внутреннем состоянии биологических объектов вызывают нарушения стационарности и изменения интенсивности свечения [6].
Цель настоящей работы — обоснование приме-нения метода БХЛ в санитарно-токсикологиче-ских исследованиях при установлении безвредных уровней содержания химических веществ в воде водоемов. Для изучения использованы два класса химических соединений: органические — простые полиэфиры (полиэтиленоксид мол. м. 400, полиоксипропилентриол мол. м. 500, по-лиоксиэтиленоксипропилендиолы мол. м. 1500 и 2500) и неорганические — сильные окислители
(персульфаты калия и аммония). Изучено влияние этих соединений на организм теплокровных животных в соответствии с «Методическими указаниями по разработке и научному обоснованию предельно допустимых концентраций вредных веществ в воде водоемов» [5].
В остром опыте на белых крысах и мышах определяли интенсивность сверхслабого свечения внутренних органов и тканей при пероральном введении простых полиэфиров марок Л-402, Л-503, Л-1502 и Л-2502 в летальных и сублетальных дозах. На этом этапе выполнены 2 серии исследований. В I серии определяли уровни интенсивности БХЛ органов и тканей белых крыс, выживших после однократного введения веществ. Сыворотку крови, гомогенаты печени, почек, надпочечников, сердца и селезенки изучали на 16-й день эксперимента. Во II серии исследовали интенсивность сверхслабого свечения органов и сыворотки белых мышей в динамике через 1, 3, 6, 9 и 12 ч после затравки заведомо смертельными дозами простых полиэфиров. 12 ч — среднее время гибели животных в остром опыте (ЁТ50). Интенсивность БХЛ индуцировали 3 % перекисью водорода [7]. Вызываемый ею первый максимум подъема кривой отражает содержание в системе гидроперекисей, перекисей и супероксидов; второй максимум связан с концентрацией антиокси-дантов [3]. Результаты оценивали по величине интенсивности свечения (вспышки) в момент добавления перекиси и кинетики протекания реакции [2].
Для изучения динамики БХЛ при тех же усло-
2*
- 35 —
1000-
500:
Ю
15
20
Рис. 1. Динамика интенсивности БХЛ органов белых крыс
в остром опыте под воздействием сублетальных доз. По оси абсцисс — время наблюдения, сут: по оси ординат — интенсивность БХЛ. имп/с. / — печень; 2 — почки; 3 — надпочечники; 1" — 3"—контроль соответствующих органов.
виях затравки регистрировали интенсивность свечения, начиная с первых суток после введения соединений. Установлено, что в первые 2 сут уровень свечения был несколько выше, что, вероятно, связано со стрессорной реакцией организма на химический раздражитель; затем он понижался и оставался стабильным на протяжении 16—18 сут. Восстановление уровня свечения органов и тканей подопытных животных до показателей контрольной группы наступало спустя 24—29 дней от начала воздействия (рис. 1).
Хемилюминограммы контрольных животных, которым вводили воду, имели более медленный и невысокий первый подъем при наличии второго. Это может свидетельствовать о том, что в системе содержится незначительное количество как перекисных соединений, так и антиокислителей, которое находится в равновесии. У подопытных
4500-,
1000-
500-
Рис. 2. Динамика интенсивности БХЛ печени и сыроротки крови- в остром опыте под воздействием абсолютно смертельных доз.
По оси абсцисс — время наблюдения, ч; по оси ординат — интенсивность БХЛ, имп/с. 1 — печень; 2 — сыворотка крови; 3 — контроль печени; 4 — контроль сыворотки.
животных хемилюминограмма имела крутой и высокий подъем, второго максимума свечения не обнаружено. Этот факт дает основание сделать предположение о воздействии простых полиэфиров на биомембраны и накоплении в организме перекисных соединений, которые приводят к истощению антиоксидаитной системы. Результаты острого опыта позволили целенаправленно включить в программу подострого определение тех по- 4 казателей, которые характеризуют состояние биомембран, антиокислительной системы и окислительно-восстановительных процессов в организме.
Во II серии опытов животных (белые мыши) подвергали затравке полиоксипропилентриолом мол. м. 500 в заведомо смертельной дозе и изучали интенсивность БХЛ печени и сыворотки крови в динамике на протяжении 12 ч (рис. 2). Как в го-могенате печени, так и в сыворотке подъем второй кривой на хемилюминограмме отмечался только в первый час опыта. Это, по-видимому, может свидетельствовать о расходовании антиокис- ф лителей на «гашение» перекисей в биологических ^ субстратах, об их малом количестве и срыве компенсаторных механизмов. Параллельно со снижением интенсивности БХЛ нарастала тяжесть клинических симптомов отравления, животные погибали спустя 10—15 ч от момента затравки. Таким образом, по интенсивности свечения и характеру кривой можно судить о тяжести и исходе отравления химическими соединениями. Следовательно, в данном эксперименте интенсивность БХЛ находилась в прямой зависимости от дозы и времени воздействия веществ на организм животных.
На последующих этапах исследований оценивали интенсивность БХЛ органов и тканей животных, подвергавшихся в подостром опыте затравке ■ простыми полиэфирами марок Л-402, Л-503, щ Л-703, Л-1502, Л-2502 в дозах, соответствующих 1/100, 1/1000 и 1/10 000 ЬО50. Все соединения в той или иной степени вызывали увеличение интенсивности свечения субстратов, уровень которой зависел от дозы вещества и вида полиэфира (табл. 1). Так, Л-703 обусловил самый высокий уровень интенсивности свечения во всех органах и тканях при воздействии дозы, соответствующей 1/100 ЬОбо. На основании результатов клинических, биохимических, физиологических, гистологических и гистохимических исследований эта доза была недействующей, а по БХЛ таковой является 1/10 000 ЬВбо. Л-703 значительно увеличивал интенсивность свечения тканей селезенки по срав- ^ нению с другими полиэфирами, что позволяет вы- Щ сказать предположение о его влиянии на иммунную систему.
Интенсивность БХЛ под влиянием остальных соединений была несколько ниже. Для каждого органа характерна своя хемилюминограмма. Усиление интенсивности сверхслабого свечения находилось в прямой зависимости от накопления в организме продуктов перекисного окисления ли-
Таблица 1
Ин тенсивность БХЛ (в имп/с) органов и тканей белых крыс в подостром опыте (60-е сутки; М±т)
Вещество Доза от Ь050 Печень Почки Сердце Надпочечники Селезенка Головной мозг Сыворотка крови
Контроль 0 820+30 650+25 720+35 400+20 300±15 370±35 280±20
Л-703 Л-503 Л-402 Л-1502 Л-2502 1/100 1/1000 1/10000' 1/100 1/1000 1/10 000 1/100 1/1000 1/100 1/1000 1/100 1/1000 1860±44 1057 ±31 790±37 1223±55 923±30 830±25 1112+28 853+12 1123± 19 811±14 1 Ю0=Ь24 805± 19 1680+28 905+22 664 ±34 1106±42 964±38 670±32 990+31 672±28 !056±34 72£± 18 1022+16 682±28 1140±£0 802±32 756±28 896±41 857± 15 737±28 872± 16 700±23 903±42 782+15 915±53 688±34 1282±25 708± 19 420±32 805±11 580 ±29 416± 17 1060± 19 426± 14 780± 15 480±32 829±45 415±41 884±17 851 ± 12 312±18 436+19 350±33 17+15 Г05±25 328± 19 480±32 315±33 526±54 312±23 680± 18 460±25 402±23 620±51 495±30 390±27 530±26 395+41 615±33 405±28 605±37 365±22 638+12 550±17 265±40 582 ±23 350±14 300±15 560±21 269±30 608±43 293+44 590±56 295+38
4
пидов, перекисей, гидроперекисей, свободных радикалов, диеновых конъюгатов, малонового ди-альдегида.
Поставленный опыт позволил обнаружить изменения в органах животных под воздействием простых полиэфиров в дозах, значительно более низких по сравнению с данными санитарно-токси-кологических исследований, и определить пороговые и недействующие дозы на порядок ниже, что повышает надежность установленных безвредных уровней содержания веществ в воде водоемов. Метод БХЛ дал возможность выявить наиболее повреждаемые органы при воздействии соединений: для Л-402, Л-503, Л-1502 и Л-2502 это печень, почки и надпочечники, а для Л-703 также и селезенка.
В настоящее время при проведении токсиколо-го-гигиенических исследований все чаще возникает необходимость точной индикации проникновения веществ через неповрежденную кожу на производстве и в быту. Оценка кожно-резорбтивного действия веществ осуществлена на морских свинках и белых крысах.
В I серии опытов изучено кожно-резорбтивное действие простых полиэфиров на морских свинках при аппликациях 20 % растворов в течение 30 сут. На всем протяжении исследований регистрировали как местные проявления, так и признаки общетоксического действия. Опытная группа по внешнему виду и поведению не отличалась от контрольной. На 10, 20 и 30-е сутки эксперимента определяли количество эритроцитов, уровень гемоглобина, сульфгидрильных групп, активность каталазы, пероксидазы, церулоплазмина, холин-эстеразы, щелочной фосфатазы, аланиновой и ас-парагиновой трансамипаз в крови (наиболее чувствительные тесты при пероральном воздействии простых полиэфиров в подостром опыте). Изменения по этим показателям у животных опытных групп были обнаружены только на 30-е сутки опыта. В те же сроки исследовали интенсивность БХЛ сыворотки крови, которая, начиная с 10-х суток, увеличивалась на протяжении всего эксперимента (табл. 2). Интенсивность свечения сыворотки находилась в прямой зависимости от сте-
Таблица 2
Динамика биохимических показателей сыворотки крови у морских свинок при кожно-резорбтивном действии простых
полиэфиров (30-е сутки; М±т)
Показатель Контроль Л-503 Л-402 Л-1 502 Л-2502 Л-703
БН-группы, ед. эк-
стинкции 4,12+0,28 6,25±0, 5* 6,7±0,3* 6,6±0,2* 6,9+0, 1 * 6,0±0,1*
Эритроциты, 1012/л 4,80±0,64 2,4±0,4* 2,0±0,7* 1,8±0,6* 2,2±0,4* 2,8±0,3*
Гемоглобин, мг % 13,6±0,56 7,4±0,9* 2,3±0,6* 5,3±2,8* 6,8±2,4* 4,4+0,6*
Каталаза, ед. эк-
стинкции 4,35±0,87 9,3±1,8* 8,4±0,7* 9, 7± 1, 7* 9,2±2,9* 8,7±1,3*
Церулоплазмин, ед.
ЭКСТИ11КЦИИ 155±24,36 398±38* 440 ±60* 428±44* 450±58* 280+15*
Холинэстераза, ед.
ЭКСТИНКЦИИ 0,76±0,04 1,8±0,1* 1,3±0,1 * 1,3±0,1* 1,3±0,1* 1,2+0, 1*
Примечание. Здесь и в табл. 3 и 4 звездочка — различия статистически достоверны.
Таблица 3
Интенсивность свечения (в имп/с) органов и тканей при воздействии сильных окислителей на кожу (М±от)
Контроль Персульфат калия Персульфат аммония
Объект исследования срок исследования, сутки
7-е 15-е 7-с 15-е 7-е 15-е
Сердце Печень Почки Надпочечники Мозг Сыворотка Моча 430+30 720+70 1320±282 783±79 413± 18 553±69 630±39 490±20 670+80 1370±160* 1530± 130* 1750±323 1750± 120* 1930+ 107* 1340+ 110* 820±70 1210±170* 1860±210* 1400± 170* 1580± 190* 1550+230 1470± 145* 1145±106* 1420± 124* 910± 120 1430=Ь 115* 1630+ 180*
Примечание. Прочерк — исследование не проводилось.
пени токсичности и времени воздействия изученных химических соединений.
Полученные данные позволяют говорить о нарушении стационарности биомембран, которое приводит к усилению интенсивности БХЛ органов и тканей. По интенсивности вспышки и изменению формы кривой свечения можно судить об эффекте проникновения, степени и характере токсического действия химических веществ. Изменение интенсивности БХЛ регистрировалось уже на 10-е сутки опыта, тогда как с помощью других тестов — только на 30-е, что указывает на его высокую чувствительность.
Во II серии опытов изучен эффект проникновения через кожу сильных неорганических окислителей — персульфатов калия и аммония. Уже на 7-е сутки опыта отмечалось усиление интенсивности БХЛ сыворотки крови и мочи, а на 15-е—и гомогенатов внутренних органов белых крыс, в большей степени тех, которые участвуют в дето-ксикации ядов (табл. 3). Как видно из табл. 3, и в этом опыте интенсивность свечения зависела от времени воздействия и токсичности соединений.
В III серии опытов кожно-резорбтивное действие изучено на белых крысах, хвосты которых погружали в 20 % растворы простых полиэфиров на 6 ч (в контроле — в водопроводную воду). Установлено, что уже через час после экспозиции интенсивность БХЛ сыворотки крови увеличивается
по сравнению с контролем. Интенсивность свечения нарастала на протяжении 4 ч, в дальнейшем до 6 ч наблюдался относительно стационарный уровень ее, и к 12 ч она возвращалась к уровню контроля. Наибольшая интенсивность БХЛ сыворотки зарегистрирована у животных, подвергших- # ся воздействию Л-703 и Л-503, меньшая — Л-402, ^ Л-1502 и Л-2502 (табл. 4). Опыт показал, что БХЛ сыворотки крови может быть использована как экспресс-тест для установления эффекта проникновения веществ через неповрежденную кожу и оценки степени их токсичности.
Таким образом, применение метода БХЛ в са-нитарно-токсикологических исследованиях, во-первых, характеризует состояние свободноради-кального перекисного окисления липидов и является универсальным тестом, отражающим состояние биомембран при воздействии на организм вредных факторов; во-вторых, обеспечивает высокую точность и оперативность определения степени токсичности, пороговых, подпороговых и не-^ действующих доз при пероральном и кожно-ре-?^ зорбтивном путях поступления в организм; в-третьих, дает возможность с большей точностью по-*' дойти к выбору адекватных методов при проведении подострых и хронических токсикологических экспериментов, более глубоко судить о характере и особенностях биологического действия химических соединений. Метод БХЛ может быть
Таблица 4
Интенсивность БХЛ (в имп/с) сыворотки крови белых крыс при изучении кожно-резорбтивного действия соединений
(М±т)
Время наблюдения, ч
Вещество 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 *
Л-402 Л-503 Л-1502 Л-2502 Л-703 560±23* 640±17* 530±22* 495±12* 660±20* 890±32* 825±35* 780±31 * 760±16* 840±27* 1020±40* 920±41* 860+38* 856+42* 952±33* 1050+33* 1200±63* 995±50* 930±43* 1205±38* Ю80±30* 1220±53* 1085±44* 1060±28* 1275±45* 800+21* 1250±48* 1110±60* 1110±56* 1287+65* 650+19* 1С00±40* 798±32* 480±26* 1200±70* 650±19* 802±38* 470±28 502±15* 902±58* 485±24* 520±30* 460±17 470±32 760±39* t 450±30* 440+60* 455±33 440±21 690±47*
Контроль 435±15 480±20 470+13 455+16 425± 18 490±32 440+19 440±23 480±14 420±15
использован как экспресс-тест для выявления наиболее повреждаемых органов, проникающей способности веществ через неповрежденную кожу и степени их токсичности. Впервые этот метод проверен и использован в санитарно-токсикологиче-ских исследованиях при гигиеническом нормировании химических веществ в воде водоемов.
Литература
© Л. Е. ИЗОРИЯ. л. г. ПИЛЬДУС, 1989 УДК 614.777:547.558.1]-074:543.42
/
щ
Фосфамин относится к эффективным фосфор-органическим поверхностно-активным веществам, широко применяемым в быту и промышленности. Он представляет собой диэтаноламиновую соль 2-этилгексилового эфира метилфосфоновой кислоты. ПДК фосфамина в воде водоемов 0,02 мг/л.
В литературе мы не нашли сведений о методах определения фосфамина в воде водоемов. В нашу задачу входила разработка экстракционно-спект-рофотометрического метода определения фосфамина в воде водоемов с чувствительностью 0,01 мг/л и специфичного в присутствии ортофос-, фатов и некоторых фосфорорганических пестици-%дов.
Фосфамин минерализовали персульфатом аммония до ортофосфата по методике, описанной в литературе [2, 3]. Последний определяли в виде синего гетерополикомплекса, образующегося при взаимодействии ортофосфата с молибдатом аммония и аскорбиновой кислотой.
Для повышения эффективности определения фосфамина в воде использовали метод жидкост-но-жидкостной экстракции гексаном после под-кисления.
Подготовка пробы воды [4] включает фильтрацию через бумажный фильтр (объем пробы воды 1 л), подкисление серной кислотой до рН 1,7—1,8 >и добавление хлористого натрия (360 г) через специальную ввронку для порошков. После этого проводят экстракцию гексаном трижды (в течение 15, 3 и 3 мин) порциями по 50 мл. Объединенный гексановый экстракт (общий объем около 130 мл) концентрируют в фарфоровом тигле вместимостью 25 мл путем выпаривания на водяной бане (температура 68°С, контроль контактным термометром). По мере испарения гексана (не досуха!) в тигель доливают через воронку новые
2. Владимиров 10. А., Арчаков А. М. Перекисиое окисление липидов в биологических мембранах.— М., 1972.
3. Воскресенский О. Н., Левицкий А. П. // Вопр. мед. химии,— 1970, —Т. 16, № 6.— С. 563—583.
4. Журавлев А. М.// Журн. общей биол. — 1973. — № 34. —С. 581—593.
5. Методические указания по разработке и научному обоснованию предельно допустимых концентраций вредных веществ в воде водоемов.— М., 1976.
6. Тарусов Б. Н. // Первичные и начальные процессы биологического действия реакции.— М., 1972.— С. 50—54.
7. Туровец Л. Г., Владимиров 10. A. 11 Гиг, и сан. — 1975, —№ 10, —С. 60—62,
Поступила 10.10.88
порции гексанового экстракта. Последние порции растворителя (~1 мл) испаряются при комнатной температуре под тягой после удаления тигля из водяной бани. Сухой остаток с экстрагированным фосфамином растворяют в дистиллированной воде (4,5 мл) при нагревании тигля в водяной бане (температура 68°С) в течение 5 мин. Охлажденный раствор переносят в колориметрическую пробирку (4 мл). Тигель ополаскивают 1мл дистиллированной воды по стенкам с помощью микропипетки и переносят раствор в ту же пробирку (общий объем в пробирке 5 мл). В каждую пробирку приливают по 2 мл 0,25 М раствора персульфата аммония и нагревают 15 мин з кипящей водяной бане. После охлаждения в токе холодной воды приливают по 2 мл 0,25 М раствора мочевины к вновь нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин, охлаждают в токе холодной воды, прибавляют по 1 мл 2 % раствора молибдата аммония в 10 н. серной кислоте и 2 % раствора аскорбиновой кислоты. Содержимое пробирок перемешивают, нагревают в кипящей водяной бане в течение 2 мин.
После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре СФ-16 (или СФ-46) при длине волны 800 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.
По полученным значениям оптической плотности находят содержание фосфамина в анализируемом объеме воды (х) по формуле:
х = -^Гмг/я,
где а — количество вещества, найденное по гра-дуировочному графику, мкг; и — объем пробы воды, взятый на анализ, мл; /г — поправочный коэффициент, учитывающий полноту извлечения фосфамина из воды при экстракции.
1. Владимиров Ю. А., Литвин Ф. Ф. // Биофизика, — 1959. — Т. 4, № 4. — С. 601—604.
С
«77. Е. Изория, Л. Г. Пильдус
ЭКСТРАКЦИОННО-СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОСФАМИНА В ВОДЕ ВОДОЕМОВ
НИИ гигиены, токсикологии и профпатологии Минздрава СССР, Волгоград
