CC BY
9
УДК 576.851.48 + 576.851.142].07813
ПРИМЕНЕНИЕ ИНФРАКРАСНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ДЛЯ УСКОРЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ESCHERICHIA COLI И AEROBACTER AEROGENES
В. И. Бугрова, В. И. Гриднев Научно-исследовательский институт гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана, Москва
Для дифференциации Escherichia coli и Aerobacter aerogenes применяют общепринятые в санитарной бактериологии тесты (сбраживание лактозы с образованием кислоты и газа, индолообразование, пробу с метиловым красным, реакцию на ацетилметилкарбинол и цитратный тест, основанный на неодинаковой способности кишечных палочек к усвоению солей лимонной кислоты (как единственного источника углерода), требующие не менее 5 суток.
Для сокращения сроков дифференциации предпринята попытка использования инфракрасной спектроскопии. Этот метод широко распространен в ряде зарубежных стран. Принцип его заключается в поглощении инфракрасных лучей органическими соединениями или их компонентами. Поглощение выражается в виде записи спектрограмм на бумаге, которые содержат характеристические полосы поглощения органических веществ, лежащие всегда в строго определенных интервалах длин волн инфракрасного излучения.
Запись спектрограмм призводили на отечественном инфракрасном двухлучевом спектрофотометре ИКС-14 в диапазоне длин волн от 5 до 10 мк. Такая длина волн обеспечивается применением призмы из NaCl. Условия работы прибора: усиление 1, 2, ширина щели от 0,032 до 0,522 мм, скорость движения бумаги 6 мм/мин, скорость развертки спектра 0,55 мк/мин.
Всего изучено 6 штаммов кишечных полочек из Института контроля медицинских биологических препаратов им. А. Ф. Тарасевича Е. coli 675 и A. aerogenes 59/9. Остальные культуры были выделены при исследовании воды и определены по указанным выше тестам.
Культуры кишечных палочек изучены в препаратах из целых клеток и экстрактах. Для получения препаратов из целых микробных клеток колонии кишечных палочек снимали с мембранного фильтра после инкубации на среде Эндо в течение 10 часов при 37° и затем высевали секторами на обычный мясо-пептонный агар с рН 7,2. Посев выдерживали при 37° в течение 10—16 часов. Выросшие культуры в количестве 1 петли эмульгировали в 2—3 каплях стерильной водопроводной воды и наносили на пластинку из AgCl. Препарат подсушивали в термостате и записывали на приборе ИКС-14. Изучено 30 препаратов в повторяющихся спектрограммах A. aerogenes и 22 препарата Е. coli.
Спектрограммы культур кишечных палочек имели своеобразную конфигурацию, состояли из 5 глубоких полос поглощения: 6, 6,5, 7, 8,1 и 9—10 мк, по общему виду (характеру) сходных между собой (рис. 1).
При внимательном изучении 2 последних полос в области поглощения от 8,1 до 9—10 мк обнаружено различие. Наблюдалась разная интенсивность поглощения характеристической полосы в области 9—10 мк.
Более глубокая полоса поглощения характеризовала A. aerogenes. Разница в интенсивности поглощения 2 последних полос у Е. coli равнялась 2%, а у A. aerogenes — 6—7%. Известно, что глубина полос может зависеть не только от концентрации изучаемого вещества, но и толщины препарата — фактора, который должен строго контролироваться. Для того чтобы исключить предположение о влиянии толщины препара-
та на глубину полосы поглощения у А. аеи^епеэ (в области 9—10 мк), эту полосу постоянно сравнивали с полосой поглощения протеина, равной 6,4—6,5 мк (внутренний стандарт).
Судя по литературным данным, область поглощения полисахарида (гликогена) соответствует 9—10 мк. Исследователями установлено также, что у А. аеп^епев, растущих при 37°, количество гликогена достигает предела между 16 и 24 часами инкубации; после этого происходит его уменьшение (32—48 часов), и он составляет 48% сухого веса бактерии. При 15—20° синтез гликогена идет замедленно и достигает макси-
70
а ¡с
\
i 6 ч S 9 W 3 б 7 в 9 10 йлина волн /в мк)
Рис. 1. Культуры кишечных палочек.
/ — Е. coli; 2 — А. aerogenes.
^ f г з i 5 в 7 s 9 ton 13 п Алина Волн (в МП)
Рис. 2. Водно-ацетоновый экстракт. Обозначения те же, что и на рис. I.
мума ко 2—3-му дню. У Е. coli в среднем вырабатывалось очень мало гликогена, и он не всегда синтезировался хорошо при низкой температуре. Поэтому мы культивировали кишечные палочки на МПА в оптимальных условиях со строгим соблюдением определенного режима выращивания (температура, длительность инкубации и состав питательной среды).
Одновременно с изучением целых клеток кишечных палочек записывали спектры экстрактов, полученные из микробных клеток тех же культур.
Были приготовлены водно-ацетоновые экстракты с предварительным разрушением микробных клеток в гомогенизаторе и экстракты трихлор-уксусной кислотой при 4—6° в течение 3 часов, в которых клетки были неразрушенными. Всего изучено 42 экстракта А. aerogenes и 45 экстрактов Е. coli, а при обработке трихлоруксусной кислотой по 10—15 экстрактов каждого вида.
Характер спектрограмм экстрактов кишечных палочек в интервале длин волн от 2 до 15 мк значительно сложнее. В этом интервале инфракрасного излучения лежат полосы поглощения различных химических компонентов микробной клетки (полипептиды, аминокислоты, полисахариды, жирные кислоты и др.). Спектрограммы водно-ацетоновых экстрактов А. aerogenes 59/9 и Е. coli 675 характеризуются наличием 4 глубоких широких полос 3, 6,4, 7,2—8 и 9,3 мк. В интервале 10,7—15 мк имеются слабые полосы, которые, по данным Стивенсона, Левина и др., обычно появляются и более ярко выражены при большом содержании углеводов в микробной клетке, как в данном случае у А. aerogenes (рис.2).
Широкая полоса (9—10 мк) характеризует наличие полисахарида (гликогена).
Спектрограмма Е. coli в отличие от спектрограммы А. aerogenes имеет менее широкие полосы, конфигурация спектрограммы в целом отличается, так как концы полос заострены, а характеристическая полоса 9—10 мк значительно уже и с левой стороны ступенчатая. Слабые полосы (от 10,7 до 15 мк) мало рельефны или почти сглажены по срав-
5 Гигиена и санитария, № 7
65
нению с А. аегс^епеэ, что вполне согласуется с данными спектрограмм целых микробных клеток культур кишечных палочек (рис. 2), а также с литературными источниками (Стивенсон, Левин и др.), указывающими на повышенное содержание полисахарида (гликогена) в клетках А. ае-п^епев.
Более четко показана разница количественного содержания полисахарида (гликогена) на спектрограммах экстрактов целых клеток кишечных палочек, обработанных трихлоруксусной кислотой (рис. 3).
10 | W
I 60
I £ 80
Рис. 4. Гликоген очищенный
<J
г.
? 3 5 6 у 1 9 tonn 1U5 длина бонны 10 мн)
Рис. 3. Экстракт трихлоруксусной кислоты.
Обозначения те же, что н на рис. 1.
70
100
Л
7 Я Q 1П 1117111LH
Алина волн ß г мн)
Спектрограммы в целом имеют иную конфигурацию, чем водно-ацетоновые, по-видимому, из-за экстракции дополнительных ингредиентов и в иных количествах, но различие в интенсивности поглощения полос, ответственных за полисахариды (9—10 мк), остается в тех же соотношениях.
После поглощения инфракрасного излучения 9—10 мк интенсивнее у А. aerogenes, чем у Е. coli; вследствие этого и конфигурация спектрограмм экстрактов трихлоруксусной кислотой в диапазоне длин волн от 8 до 11 мк отличается у взятых для изучения штаммов того и другого вида.
Для подтверждения данных об области поглощения полисахарида (гликогена) нами был записан препарат химически чистого гликогена (рис. 4). В представленной спектрограмме глубокая полоса поглощения химически чистого гликогена располагается в области длин волн от 9 до 10 мк, т. е. соответствует области поглощения последней полосы (9—10 мк) спектрограмм кишечных палочек. По-видимому, это область поглощения химических связей бактериальных полисахаридов.
Разница количественного содержания полисахаридов во взятых для исследования штаммах А. aerogenes и Е. coli позволила легко дифференцировать эти 2 вида. Возможно, что другие штаммы этих 2 видов или их вариантов дадут иные результаты. Это покажут дальнейшие исследования.
Весь процесс дифференциации при исследовании целых клеток продолжался 24—28 часов. Подобное ускорение определения видов микроорганизмов представляет интерес как одна из многих возможностей применения метода инфракрасной спектроскопии в области микробиологии.
Получение экстрактов гораздо сложнее и требует более длительного времени, но позволяет выявить большее количество компонентов микробной клетки, представляющих научный интерес и требующих тщательного и глубокого изучения микробиологами-спектроскопистами совместно с цитологами-биохимиками.
Выводы
1. Применение инфракрасной спектроскопии в микробиологии, как установлено на модели кишечных палочек Escherichia coli и Aerobacter aerogenes, раскрывает перспективы ускоренной дифференциации отдельных видов целых микробных клеток или их экстрактов.
2. Получение экстрактов микробных культур с использованием различных экстрагентов может служить моделью для изучения с помощью инфракрасной спектроскопии отдельных компонентов микробной клетки.
• Поступила 17/IX 19ij5 г.
УДК 612.744.211:611.976
ОБ ИЗМЕРЕНИИ СИЛЫ СЖАТИЯ КИСТИ ИА ЖИДКОСТНОМ И ПРУЖИННОМ ДИНАМОМЕТРАХ
Доктор мед. наук В. В. Розенблат, Н. В. Осипович Свердловский научно-исследовательский институт гигиены труда и профпатологии
Физиологи труда и гигиенисты в последние 10—12 лет довольно широко практикуют исследование статической выносливости и силы кисти на портативном жидкостном динамометре с открытой манометрической системой, представленном в двух модификациях — с использованием ртутного и водяного манометра (В. В. Розенблат, 1953, 1962)
Приборы с манометрической системой открытого типа нужны в основном только тогда, когда требуется графическая регистрация выполняемого усилия. В остальных случаях (в частности, при массовых обследованиях на производстве, где выносливость определяют по секундомеру) можно пользоваться практически более удобными манометрами закрытого типа. Для этого целесообразен, например, технический манометр с круговой шкалой, который впервые предложил Сеске1ег (1939), использовавший воздушную передачу. Еще более точные результаты дает передача через несжимаемую жидкость. Мы и другие авторы (Г. И. Оксенгендлер, 1959) применяли обычный технический манометр со спиралью Бурдона; к нему присоединяется баллон-датчик, вся система заполнена водой.
Опыт показал, что для баллона емкостью 50—60 мл (от аппарата Рива-Роччи) лучше всего подходят манометры на 2,5 кг/см2 типов ОВМ, МТК-ЮО (у обоих диаметр шкалы равен 100 мм) или МТ-60 (диаметр шкалы 60 мм). Цена деления шкалы у манометров составляет 0,2 кг/см2. Практически удобно, сохраняя установившуюся при работе с жидкостными динамометрами традицию и уточняя шкалу, градуировать прибор в сантиметрах ртутного столба. Невысокий класс точности (2,5—4%) доступных манометров позволяет приближенно принять 1 кг/см2 соответствующим 75 см рт. ст. и использовать имеющиеся деления шкалы как деления через 15 см рт. ст., введя внутри этих интервалов более дробные деления. Удобство подобного варианта жидкостного динамометра (мы именуем его моделью ДЖ-3) обеспечивает успешное применение его во всех случаях, когда не требуется запись мышечных напряжений на кимографе. Для исследований на производстве эта модель наиболее предпочтительна.
1 Строго говоря, динамометр следовало бы называть манометрическим. Однако в авторском свидетельстве его квалифицировали как портативный жидкостный дина-
мометр, в связи с чем мы сохраняем название «жидкостный».
5*
67
