CC BY
37
Конкурс молодых ученых
УДК 611 - 018: 616 - 018 - 006 - 091.8 Н.П. Мельникова
ПРИМЕНЕНИЕ
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДИК ДЛЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ ТКАНЕЙ
Дальневосточный государственный медицинский университет, г. Хабаровск
Согласно современным представлениям о патогенезе, морфологические проявления болезни опережают появление функциональных и клинических изменений. С этой точки зрения особый интерес приобретает проблема прогнозирования изменений на клеточном и тканевом уровнях на разных этапах развития болезни. Выявление и правильная оценка морфологических изменений в различные периоды роста клеточных популяций позволяет уточнить диагноз, определить прогноз заболевания и на основании этого выбрать правильную тактику лечения больного.
Качество прогнозирования в медицине и биологии, как и в любой другой области, во многом определяется количеством учитываемых факторов. Вместе с тем само понятие прогноза подразумевает вероятностную интерпретацию, поэтому применение новых, более эффективных и современных методов для прогнозирования поведения клеточных популяций является оправданным и необходимым. Одним из таких методов являются им-муногистохимические исследования (ИГХИ).
Как метод исследования иммуногистохимия появилась более 50 лет назад, однако ее широкое применение для проведения научно-исследовательских работ и диагностических исследований началось около 20 лет назад. Это связано, в первую очередь, с прогрессом биологических технологий и созданием высокоспецифичных и в то же время относительно недорогих моноклональных антител, что позволило выявлять и делать доступными для визуального исследования в световом микроскопе антигены отдельных клеток и тканей [8].
В настоящем исследовании предпринята попытка оценить прогноз поведения различных клеточных популяций как в неизмененных тканях, так и при злокачественных новообразованиях с использованием иммуногистохимических методов.
Материалы и методы
Работа проведена с использованием гистологического материала 68 лабораторных белых крыс, а также биопсийного материала опухолей 54 больных, проходивших лечение в 1998-2000 гг. в Перинатальном центре, Детской краевой больнице №2, Дорожной клинической больнице г. Хабаровска.
В проведенных экспериментах исследовали отдаленные изменения в миокарде лабораторных белых крыс после введения вазоактивных пептидов — ангиотензина II и эндотелина-1, созданных в лаборатории синтеза пептидов Кардиологического центра РАМН (г. Москва). Пептиды вводили внутрибрюшинно новорожденным белым крысам со 2 по 6 сутки после рождения: ангиотензин — в дозе 100 мкг/кг массы тела, эндотелии — 50 мкг/кг. Контролем служили крысята, которым вводили эквиобъемное количество 0,9% раствора хлорида натрия. Эвтаназию проводили методом декапита-ции на 21 сутки после рождения, т.е. через 14 дней после прекращения экспериментального воздействия. Сердце после извлечения из грудной полости фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, проводили по батарее восходящих спиртов и заливали в парафин по стандартной технологии, после чего изготавливали поперечные срезы органа толщиной 5-7 мкм.
После депарафинирования проводили имму-ногистохимическое окрашивание непрямым стрептавидин-биотиновым методом с использованием диаминодибензидина и пероксидазной реакции для визуализации исследуемых антигенов. В качестве первичных иммунных сывороток применяли моноклональные антитела к ви-ментину и десмину фирмы ДАКО (США). Ви-ментин — белок промежуточных филаментов, эк-спрессирующийся в тканях мезенхимального происхождения. В миокарде он находится в цитоплазме клеток соединительной ткани — фиброб-ластов и фиброцитов, в перицитах, гладких мио-цитах и эндотелии сосудов (рис. 1). Десмин — белок промежуточных филаментов, который экс-прессируется в мышечных клетках. В миокарде он содержится в цитоплазме кардиомиоцитов и гладких миоцитов сосудов (рис. 2). Окраска зон локализации этих двух белков позволяет оценить соотношение клеток стромы и паренхимы в миокарде. Кроме того с использованием антител к ядерному антигену пролиферирующих клеток вычисляли количество ядер, синтезирующих ДНК (рис. 3).
Исследование проведено с использованием светового микроскопа МИКМЕД-2. Индекс меченых ядер (ИМЯ) вычисляли в процентном отношении к общему числу ядер кардиомиоцитов. Показатели рассчитывали раздельно в 5 отделах миокарда — левом и правом желудочках, левом и правом предсердиях, межжелудочковой перегородке. Для определения размеров кардиомиоцитов и количества белка в них проводили щелочную диссоциацию миокарда левого желудочка, после чего мазки изолированных кардиомиоцитов окрашивали 0,03% раствором амидочерного Б. Оптическую плотность и площадь кардиомиоцитов оценивали с помощью компьютерного анализатора изображений "МЕКОС-Ц".
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием компьютерной программы Statistica 5.0. Достоверность полученных изменений оценивали с помощью t-кри-терия Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
Показаниями для проведения иммуногистохи-мического исследования клинического материала были трудности в постановке диагноза при изучении препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином. Первичный отбор таких случаев проводился врачами-патологоанатомами Перинатального центра, Детской краевой больницы №2, Дорожной клинической больницы г. Хабаровска.
Клинический материал, полученный при биопсиях, фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина, после чего готовили парафиновые срезы по стандартной технологии. Иммунофеноти-пирование опухолей проводили с использованием моноклональных антител фирмы ДАКО (США). Ниже приведен перечень антител, использованных для исследования опухолей.
— антитела к СД-45 (к общему лейкоцитарному антигену),
Ш шш ,
Рис. 1. Миокард 21-суточной крысы Окраска МКАТ к виментину, докраска гематоксилином. В коричневый цвет окрашена цитоплазма клеток соедикителъ-
нои ткани.
Рис. 2. Миокард 21-суточной крысы Окраска МКАТ к десмину, докраска гематоксилином, коричневый цвет окрашена цитоплазма кардиомиоцитов.
Рис. 3. Миокард 21-суточной крысы
Окраска МКАТ к РСИА, докраска гематоксилином. В коричневый цвет окрашено ядро кардиомиоцита, синтезирующего ДНК.
— антитела к СД-43 (к Т-лимфоцитам),
— антитела к СД-20 (к В-лимфоцитам),
— антитела к виментину,
— антитела к десмину,
— антитела к пан-цитокератину (белку промежуточных филаментов, экспрессирующемуся в эпителиальных тканях),
— антитела к эпителиальному мембранному антигену (ЕМА) (белку промежуточных филаментов, экспрессирующемуся в эпителиальных тканях),
— антитела к нейрон-специфической енолазе (белку клеток нейро-эндокринного происхождения),
— антитела к белку Ю-67 (экспрессируется ДНК-синтезирующими ядрами),
— антитела к НМВ-45 (белку меланосом),
— антитела к СД-30 (белку клеток Березовского-Штернберга и Ходжкина при лимфогранулематозе),
— антитела к РСЫА,
— антитела к к-легким цепям иммуноглобулинов,
— антитела к А-легким цепям иммуноглобулинов.
Результаты и обсуждение
На ранних этапах постнатального развития сердце представляет уникальную клеточную популяцию, сочетающую процессы пролиферации и дифферен-цировки. Согласно мнению большинства исследователей, процессы синтеза ДНК и клеточного деления в миокарде крыс ограничены первыми тремя неделями после рождения. В этом временном интервале количество пролиферирующих клеток постепенно снижается во всех отделах миокарда и достигает минимального значения, сопоставимого с таковым у взрослых животных. Вместе с тем синтез ДНК отмечается и у половозрелых крыс, весьма редко наблюдается даже полноценное митоти-ческое деление кардиомиоцитов [9].
Выбор исследуемых веществ был обусловлен следующими факторами. Ангиотензин и эндотелии являются эндогенными вазоактивными пептидами. В организме млекопитающих и в миокарде существуют высокоспецифичные системы их рецепции и метаболизма. В кардиомиоцитах обнаружены ген и мРНК-ангиотензина, непосредственно на кардиомиоцитах и на фибробластах сердца локализуются 2 типа рецепторов к ангиотен-зину. Эндотелии синтезируется в эндотелии сосудов, в том числе сосудов сердца. В миокарде имеются 3 типа рецепторов к нему.
В культуре кардиомиоцитов ангиотензин стимулирует синтез ДНК и белка. Эндотелии обладает митогенным действием в большом числе клеточных популяций, например, в коре надпочечников, в гладких миоцитах сосудов, эндотелии сосудов и др. Эндогенные ангиотензиновая и эндо-телиновая системы вовлечены в развитие таких патологических состояний сердечно-сосудистой системы, как инфаркт миокарда, кардиогенный шок, хроническая ишемическая болезнь сердца, гипертоническая болезнь. Кроме того, на основе фармакодинамики эндогенных пептидов созданы и широко применяются в практической медицине блокаторы рецепторов ангиотензина и блокаторы ангиотензин-превращающего фермента. Антагонисты эндотелиновой системы проходят этап доклинических испытаний и, по мнению исследователей, являются перспективными фармакологическими препаратами [11, 14].
В ранее проведенных экспериментах сотрудниками нашей лаборатории выявлена способность ряда нейропептидов активировать синтез ДНК в
Влияние пятикратного введения вазоактивных пептидов новорожденным крысам на морфометрические показатели миокарда 21-суточных животных
Показатель Группа животных
контроль ангиотен-зин-П эндоте-лин-1
Площадь кардиомиоцита, мкм2 1655,75 ±55,56 1866,22 ±76,0* 1942,87 ±114,2*
Интегральная оптическая плотность кардиомиоцита, усл.ед. 60,39 ±3,68 66,61 ±3,15 81,27 ±6,97*
ИМЯ, РС^, %
Левое предсердие 3,62 ±0,53 3,4 ±0,94 4,54 ±0,72
Правое предсердие 2,97 ±0,76 4,41 ±0,95 4,48 ±0,92
Левый желудочек 6,11 ±0,3 4,98 ±0,45 6,87 ±0,95
Межжелудочковая перегородка 6,05 ±0,58 4,68 ±0,34 7,46 +0,81
Правый желудочек 5,58 ±0,42 4,04 ±0,58 5,39 ±0,95
Количество виментин-позитивных клеток, %
Левое предсердие 39,86 ±2,9 38,3 ±4,91 52,51 ±2,34*
Правое предсердие 36,34 ±4,25 41,73 ±1,62 52,44 ±6,53*
Левый желудочек 48,97 ±2,44 53,22 ±2,65 55,85 ±1,61*
Межжелудочковая перегородка 45,65 ±0,96 48,23 ±2,69 55,41 ±1,99*
Правый желудочек 48,49 ±2,06 50,12 ±2,49 61,5 ±2,24*
Примечание. * — р<0,05 по отношению к контролю.
миокарде новорожденных крыс [4, 5, 6, 10]. Вместе с тем вопрос об отдаленных последствиях введения этих веществ остается открытым.
Результаты экспериментального воздействия введения ангиотензина и эндотелина представлены в таблице. У животных контрольной группы ИМЯ кардиомиоцитов колебался в различных отделах миокарда от 6,11+0,30% в миокарде левого желудочка до 2,47±0,76% в миокарде правого предсердия. Введение вазоактивных пептидов не вызвало статистически значимых изменений ИМЯ ни в одной из исследованных зон миокарда.
Исследование числа клеток соединительной ткани выявило следующие закономерности. В контрольной группе крыс количество клеток соединительной ткани максимальным было в миокарде желудочков и меньше — в миокарде предсердий. Сравнение возрастных особенностей количества клеток стромы в миокарде сопоставимо с данными литературы, полученными другими методами [2].
Пятикратное введение ангиотензина II новорожденным крысам в дозе 100 мкг/кг массы тела не привело к статистически достоверным изменениям числа виментин-позитивных клеток в миокарде 21-суточных животных. Повторные инъекции эндотелина-1 в дозе 50 мкг/кг способствовали достоверному возрастанию числа клеток соединительной ткани в 5 отделах миокарда (таблица). Кроме того, введение как ангиотензина, так и эндотелина способствовало достоверному увели-
чению площади кардиомиоцитов. При окраске раствором амидочерного Б интегральная оптическая плотность кардиомиоцитов под влиянием введения эндотелина-1 статистически значимо возрастала, что свидетельствует о возрастании общего клеточного белка.
Таким образом, ангиотензин II и эндотелии-1 при введении новорожденным животным активируют синтез ДНК, а через 14 дней после прекращения экспериментального воздействия отмечается метаморфоза реакции — увеличивается площадь кардиомиоцитов. При введении эндотелина возрастает еще и содержание белка в кардиомиоцитах, а также количество клеток соединительной ткани.
Одним из возможных объяснений полученных результатов может быть возрастание плоидности кардиомиоцитов, что ведет к увеличению их размеров и количества белка. Кроме того нельзя исключить амплификации отдельных генов, ответственных за белок-синтетические процессы. Полученные морфологические изменения миокарда крыс могут объясняться функциональными изменениями в сердечно-сосудистой системе под влиянием введения изучаемых пептидов. Так, известно, что основным фактором, стимулирующим гипертрофию миокарда, является возрастание гемодинамической нагрузки на сердце [13], а инъекции эндотелина-1, по силе сосудосуживающего действия в 10 раз превышающего ангиотензин II, привели к изменению большего числа параметров [13, 14].
Исследование клинического материала проводилось по нескольким направлениям. Наиболее часто отмечались затруднения в установлении гистогенеза опухоли (32 случая из 54).
В педиатрической онкологии наибольшие трудности возникают при дифференциальной диагностике так называемых мелко-кругло-синеклеточных опухолей [7]. Для таких заболеваний, как лимфо-мы и нейробластомы, характерно сходство пато-гистологической картины и локализация в средостении и забрюшинном пространстве [8]. Вместе с тем, тактика лечения и прогноз различны: для нейрогенных опухолей показано оперативное лечение, а для лимфосарком — консервативная химиотерапия.
Дифференциальная диагностика строилась на применении двух групп МКАТ — к лимфоидным клеткам (общий лейкоцитарный антиген, СД-43 и СД-20), а также ИБЕ — маркера клеток нейроэн-докринного происхождения. Дополнительным критерием служила окраска МКАТ к виментину, которая была положительной при лимфомах и отрицательной — при нейробластомах.
Согласно общепринятым нормам, в педиатрической онкологии необходимо проводить ИГХИ во всех случаях без исключения [8]. Это определяется особенностями опухолевого роста у детей: преобладанием лимфопролиферативных заболеваний, малой частотой развития рака, более частым развитием опухолей мягких тканей и дизонтогенети-ческих опухолей, сочетающих в себе ткани различного происхождения. Наиболее наглядно эти особенности проявляются при нефробластоме, или
Рш 1 )пшс шаллый компонент в нефробластоме
Окраска МКАТ к цитокератину, докраска гематоксилином. Эпителиальные клетки окрашены в коричневый цвет.
Рис. 5. Мышечные волокна в нефробластоме Окраска МКАТ к десмину, докраска гематоксилином. Ми-оциты окрашены в коричневый цвет.
Рис. 6. Лейкоциты в нефробластоме Окраска МКАТ к общему лейкоцитарному антигену. Единичные лейкоциты окрашены в коричневый цвет.
опухоли Вильмса, развивающейся из остатка ме-танефрогенной ткани. В ее составе выявляются эпителиальный компонент (рис. 4), мышечные волокна (рис. 5), соединительная ткань (рис. 7), единичные лейкоциты (рис. 6). В классических
Рис. 7. Мезенхималъный компонент в нефробластоме
Окраска МКАТ к виментину. Цитоплазма клеток окрашена ) коричневый цвет.
Рис. 8. Метастаз нейробластомы в лимфатический узел Окраска МКАТ к нейрон-специфической енолазе, докраска гематоксилином. Цитоплазма опухолевых клеток окрашена в коричневый цвет.
Рис. 9. Лейкоциты в лимфатическом узле при метастазе нейробластомы Окраска МКАТ к общему лейкоцитарному антигену, докраска гематоксилином. Цитоплазма лейкоцитов окрашена в коричневый цвет. Большую часть лимфоузла занимают клетки опухоли.
случаях, когда эти компоненты выражены в равной степени, диагноз затруднений не вызывает, однако случаях преобладания железистого эпите-
лия такую опухоль трудно отличить от железистого рака, а когда развита мышечная ткань — от рабдо-миосаркомы. Применение ИГХИ позволяет визуализировать различные тканевые компоненты этой опухоли и, тем самым, правильно поставить диагноз, определить тактику лечения и прогноз.
Метод установления происхождения злокачественных клеток лежит и в основе выявления метастазов в лимфатических узлах (рис. 8, 9). Особое значение имеет обнаружение микрометастазов — небольшого числа клеток, зачастую даже единичных, что практически невозможно при рутинном гистологическом исследовании. Наличие метастазов в регионарных или отдаленных лимфоузлах во многом предопределяет агрессивность развития опухолевого процесса, а также пятилетнюю выживаемость, и является важнейшим прогностическим критерием продолжительности жизни пациентов. ИГХИ метастазов в лимфатических узлах проводилось нами в 18 случаях. Метастазы рака молочной железы и легких выявлялись с помощью МКАТ к цитокератину, меланомы — с использованием МКАТ к НМВ-45, нейробластомы - МКАТ к ШЕ [1].
У взрослых выяснение гистогенеза опухолевых клеток чаще всего проводилось при дифференциальной диагностике лимфомы и низкодифферен-цированного рака. Особенно демонстративным представляется клинический случай больной И., 43 лет, проходившей лечение в Дорожной клинической больнице.
Рентгенологически и пальпаторно у нее определялась опухоль в желудке. Цитологическое исследование выявило в мазке большое количество лимфоцитов. При гистологическом исследовании гастробиопсии диагноз был сформулирован следующим образом: "низкодифференцированный рак желудка", а ИГХИ этого материала выявило лим-фому. В данном случае от правильности диагноза зависела тактика лечения больной: при раке желудка — хирургическое удаление опухоли, при лимфоме — только химиотерапия.
По результатам ИГХИ был проведен курс химиотерапии, опухоль перестала пальпироваться, рентгенологически не определялась. Дважды с интервалом в 6 мес. были проведены контрольные гастробиопсии. В гистологических препаратах выявлялись склеротические процессы без признаков злокачественного роста.
Этот клинический случай убедительно подтверждает высокую эффективность и практическую значимость ИГХИ для правильной диагностики, лечения и прогноза опухолевых заболеваний.
Общепринятым является положение о необходимости проведения ИГХИ при заболеваниях лимфатических узлов [1, 8]. Такие исследования проведены нами у 18 больных.
Одной из наиболее значительных трудностей при исследовании лимфоузлов является определение характера поражения — добро- или злокачественное. Маркер, применив который можно было бы с полной уверенностью заключить, имеет в данном случае место лимфома или реактивная гипер-
плазия лимфатического узла, в настоящее время отсутствует. С достаточно большой точностью характер лимфаденопатии можно определить по ряду ИГХ-критериев.
Так, при определении клональности клеток лимфатического узла с использованием МКАТ к Т- и В-лимфоцитам в случаях доброкачественного поражения в лимфоузле выявляются и Т- и В-клет-ки, а при лимфосаркомах — только один вид лимфоцитов.
Кроме того, моно- или поликлональность можно установить и по характеру экспрессии иммуноглобулинов. При поликлональности клеток в лимфоузле выявляются плазматические клетки, синтезирующие как к-, так и Х-цепи иммуноглобулинов, при моноклональности — только один вид.
Для установления качества опухоли также может оказаться полезным исследование пролифера-тивной активности с использованием МКАТ к белку Ki-67. Если пролиферирующие клетки, как это и должно быть в норме, локализуются в герминативных центрах лимфатических фолликулов, это, скорее всего, соответствует доброкачественному поражению. Если же отмечается активация пролиферации в различных отделах без определенной структурированности, это может свидетельствовать о злокачественном поражении. Кроме того, исследование пролиферативной активности с применением МКАТ к белку Ki-67 имеет прогностическое значение при раке молочной железы, легких, предстательной железы, саркоме матки.
Для диагностики и прогнозирования лимфосар-ком определенное значение также имеет иммуно-гистохимическое выявление антиапоптозного фактора bel-2, который присутствует при лимфоме и отсутствует при доброкачественной гиперплазии лимфоузлов. Этот белок получил свое название именно из-за присутствия в лимфосаркомах (bcl-2 — В Cell Lymphoma).
Заключение
Результаты проведенного исследования позволяют сделать вывод о том, что применение имму-ногистохимии дает возможность прогнозировать развитие клеточных популяций. Например, в такой гетерогенной по клеточному составу популяции, как миокард (по данным Г.Б. Большаковой [2], в нем представлены 11 видов клеток), ИГХИ позволяет оценить соотношение стромального и паренхиматозного компонентов при действии вазоактивных пептидов ангиотензина II и эндотелина-1 на миокард новорожденных белых крыс.
С одной стороны, такое воздействие может происходить при заболеваниях матери и ребенка (преждевременные роды, фетоплацентарная недостаточность, эклампсия и т.д.), когда нарушается баланс пептидергической системы. С другой стороны, именно на ранних этапах постнатально-го развития миокард наиболее чувствителен к воздействию экзо- и эндогенных повреждающих факторов, что определяется особенностями морфогенеза сердца. Например, внутриутробная гипок-
сия приводит к гипертрофии миокарда, уменьшение числа крысят в помете активирует процессы синтеза ДНК и белка в миокарде.
Вместе с тем, согласно концепции компенсаторного резерва сердца В.Я. Бродского [3], способность сердца адаптироваться к возрастающей нагрузке при таких заболеваниях, как приобретенные и врожденные пороки, ишемическая болезнь, гипертоническая болезнь, определяется характером морфогенеза сердца в раннем онтогенезе. Иными словами, создание хороших условий для его роста и развития в детстве способствует полноценной адаптации у взрослых. Увеличение количества клеток соединительной ткани при введении эндотелина-1, на наш взгляд, может создавать предпосылки для неадекватного развития миокарда и потенциальные возможности для последующего кардиосклероза.
Прогностическая значимость ИГХИ в популяции опухолевых клеток определяется возможностью установления гистогенеза опухоли, определения ее характера (добро- или злокачественная), а также выявлением микрометастазов лимфоузлах. Интересен тот факт, что ретроспективный имму-ногистохимический анализ архивного материала 20 тыс. низкодифференцированных новообразований, выполненный в 1994 г. C.R. Taylor et al. [15] в университете Южной Калифорнии, показал, что первоначальный гистогенетический морфологический диагноз оказался ошибочным в 50% случаев. Поэтому использование ИГХИ в совокупности с клиническими и базисными морфологическими методами исследования дает возможность более правильно диагностировать заболевание в сложных случаях и, тем самым, правильно выбрать тактику лечения и сформулировать прогноз течения заболевания.
В настоящее время в медицине применяется иммуногистохимическое выявление и других прогностических факторов. В качестве примеров можно привести оценку степени васкуляризации опухоли, обнаружение гена лекарственной устойчивости (c-erb) в злокачественных клетках, характеристику рецепторного статуса при гормонально зависимых опухолях молочной железы, матки, яичников, предстательной железы и т.д.
Таким образом, развитие и внедрение иммуно-гистохимических методов исследования позволяет выполнять морфологическое исследование на качественно новом уровне, что дает возможность не только проводить более раннюю и точную диагностику, но и прогнозировать дальнейшее поведение гетерогенных клеточных популяций. Это создает предпосылки для принятия своевременных профилактических мероприятий и корректировки тактики лечения применительно к конкретному больному с учетом индивидуальных особенностей патогенеза и морфогенеза заболевания.
Литература
1. Белянин В.Л., Цыплаков Д.Э. Диагностика реактивных гиперплазий лимфатических узлов. СПб. - Казань, 1999. 328 с.
2. Большакова Г.Б. Межтканевые взаимоотношения в развитии сердца. М.: Наука, 1991. 88 с.
3. Бродский В.Я. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1995. №5. С.454-459.
4. Мельникова Н.П., Сазонова E.H., Лебедько O.A. и др. // Тез. докл. VIII Российско-японского симпозиума. Благовещенс, 2000. С.452.
5. Мельникова Н.П., Тимошин С.С., Мурзина Н.Б. и др. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2000. №12. С.693-695.
6. Мельникова Н.П., Тимошин С.С., Цыганков В.И. и др. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2000. №6. С.623-625.
7. Мельникова Н.П., Цыганков В.И., Ладнюк П.Б. и др. //Акт. вопр. экстренной детской хирургии. Перспективы развития: Мат-лы краевой науч.-пракг. конф., посвященной 15-летию Детской краевой больницы №2. Хабаровск, 2001. С.171-173.
8. Петров C.B., Киясов А.П. Иммуногистохи-мическая диагностика опухолей человека. Казань, 1998. 166 с.
9. Румянцев П.П. Кардиомиоциты в процессах репродукции, дифференцировки и регенерации. Л.: Наука, 1982. 288 с.
10. Сазонова Е.Н., Сазонов О.А., Лебедько О.А. и др. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2000. №12. С.623-626.
11. Ernesto L. Schiffrin. // Hypertension. 1999. No.34. P.876-881.
12. Kaburagi S., Hasegawa K., Morimoto T. et al. // Circulation. 1999. No.2. P.292-298.
13. Ponicke K., Heinroth-Hoffman I., Becker K., Brodde O.E. // Br. J. Pharmacol. 1997. Vol.121, No.l. P.118-124.
14. Rossi G.P., Sacchetto A., Cesari M., Pessina A.C. // Cardiovasc. Res. 1999. Vol.43, No.2. P.300-307.
15. Taylor C.R., Cote R.J. Imunomicroscopy: a diagnostic tool for the sergical pathologist. W.B. Saunders, 1994.
16. Yamasaki T., Komuro I., Zou Y., Yasaki Y. // Hypertens. Res. 1999. Vol.22, No.2. P.lll-119.
□ □□
