CC BY
58
УДК 616.33-006.6: 616.428-033.2-076.1-076.3-079
МОРФОМЕТРИЧЕСКОЕ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГИОНАРНЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ ПРИ РАКЕ ЖЕЛУДКА
Дмитрий Эдуардович Цыплаков', Антон Борисович Бажанов2*
'Казанский государственный медицинский университет, г. Казань, Россия;
2Городская клиническая больница №7, г. Казань, Россия
Реферат DOI: 10.17750/KMJ2015-971
Цель. Количественный анализ и иммуногистохимическое фенотипирование структурных и клеточных элементов лимфатических узлов, регионарных к раку желудка, при отсутствии и наличии в них метастазов.
Методы. Изучены регионарные лимфатические узлы, полученные во время операций по поводу рака желудка от 48 больных (31 мужчины и 17 женщин, средний возраст которых составил 60,9 года). Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по ван Гизону, азур-П-эозином, пиронином по Браше. Затем проводили морфометрический анализ структурных и клеточных элементов лимфатического узла. Для иммуногистохимичес-ких реакций использовали набор моноклональных антител против CD45, CD3, CD4, CD8, CD10, CD20, CD30, BLA-36, Х- и к-цепей иммуноглобулинов (Ig), CD56, миелопероксидазы, CD68, лизоцима, а1-антихимотрипсина, CD35, S100, Ki-67, CD31, коллагена IV типа, виментина, десмина. Сравнительное исследование проводили в следующих группах: (1) контроль, (2) лимфатические узлы без метастазов, (3) лимфатические узлы с метастазами различного объёма.
Результаты. При развитии рака желудка в регионарных лимфатических узлах обнаруживались паракорти-кальная и фолликулярная гиперплазия, синусный гистиоцитоз, а также микроциркуляторные расстройства и фибропластические процессы. Паракортикальная гиперплазия иммуногистохимически характеризовалась следующим фенотипом: CD45, CD3, CD4, CD8, CD10, CD30, CD56, S100, CD31, Ki-67. При гиперпластической фолликулярной реакции преимущественно экспрессировались CD45, CD20, BLA-36, CD10, CD30, CD35, Х- и к-цепи Ig, Ki-67. Реакция синусов сопровождалась увеличением общей клеточности с преобладанием CD68(+), а^ антихимотрипсин(+) и лизоцим(+) клеток. При появлении метастазов на фоне уменьшения площади паракорти-кальной зоны происходило снижение экспрессии CD3, CD4, CD8, CD10, CD56, Ki-67. Синусы были опустошены и бедны клеточными элементами, зачастую с явлениями лимфостаза или склероза. Иммуногистохимически в них определялась умеренная реакция с моноклональными антителами против а^антихимотрипсина, низкая — против лизоцима, миелопероксидазы, высокая — против виментина. При этом сохранялась фолликулярная гиперплазия с высоким содержанием CD20(+) В-клеток, BLA-36(+) активированных лимфоцитов и Ig(+) антителообра-зующих плазмоцитов. Параллельно прогрессировали микроциркуляторные расстройства и фибропластические процессы.
Вывод. В регионарных лимфатических узлах при развитии рака желудка меняются соотношение площадей структурных компонентов, клеточный состав и иммуногистохимический фенотип, при этом есть существенные различия между интактными и поражёнными лимфатическими узлами; уменьшение площади паракортикаль-ной зоны и синусов со снижением экспрессии Т-, NK-клеточных и макрофагальных маркёров на фоне сохранения фолликулярной гиперплазии с высоким содержанием активированных В-лимфоцитов и антителообразующих плазматических клеток может способствовать приживлению в лимфатических узлах метастазов и дальнейшей генерализации опухолевого процесса.
Ключевые слова: рак желудка, регионарные лимфатические узлы, морфометрия, иммуногистохимия.
MORPHOMETRIC AND IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDY OF REGIONAL LYMPH NODES IN GASTRIC CANCER
D.E. Tsyplakov', A.B. Bazhanov2
'Kazan State Medical University, Kazan, Russia;
2City Clinical Hospital №7, Kazan, Russia
Aim. To perform quantitative analysis and immunohistochemical phenotyping of regional lymph nodes structural and cellular elements in gastric cancer in the absence and the presence of metastases.
Methods. The regional lymph nodes obtained during surgery for gastric cancer from 48 patients (31 men and 17 women, mean age 60.9 years) were studied. Histological sections were stained with haematoxylin and eosin, van Gieson stain, azure-II-eosin, pyronin by Brashe. Then morphometric analysis of lymph nodes structural and cellular elements was performed. A set of monoclonal antibodies against CD45, CD3, CD4, CD8, CD10, CD20, CD30, BLA-36, immunoglobulin (Ig) Х-and к-chains, CD56, myeloperoxidase, CD68, lysozyme, a1-antichymotrypsin, CD35, S100, Ki-67, CD31, collagen type IV, vimentin, desmin was used for immunohistochemical reactions. Comparative study was performed in the following groups: (1) control group; (2) lymph nodes without metastases; (3) lymph nodes with metastases of different size.
Results. Paracortical and follicular hyperplasia, sinus histiocytosis, microcirculatory disorders and fibroplastic processes were found in regional lymph nodes in gastric cancer development. Paracortical hyperplasia was characterized by following immunohistochemical phenotype: CD 45, CD 3, CD 4, CD 8, CD 10, CD 30, CD 56, S 100, CD 31, Ki-67. CD45, CD20, BLA-36, CD10, CD30, CD35, Ig Х- and к-chains, Ki-67 were mainly expressed in follicular hyperplastic reaction. The sinus reaction was accompanied by total cellularity increase with a predominance of CD68(+), at-antichymotrypsin(+) and lysozyme(+) cells. Expression of CD3, CD4, CD8, CD10, CD56, Ki-67 decreased amid the paracortical zone area reduce in metastases development. Sinuses were devastated and poor with cellular elements, often with lymphostasis or sclerosis signs. Imunohistochemically there was moderate reaction with monoclonal antibodies against a^antichymotrypsin, low —
Адрес для переписки: anton-bazhanov@yandex.ru
against lysozyme, myeloperoxidase, and high — against vimentin. Wherein follicular hyperplasia with high levels of CD20(+) B-cells, BLA-36(+) activated lymphocytes and Ig(+) antibody producing plasma cells persisted. At the same time microcirculatory disorders and fibroplastic processes progressed.
Conclusion. Structural components area ratio, cellular composition and immunohistochemical phenotype change in the regional lymph nodes in gastric cancer development, with significant differences between intact and affected lymph nodes; paracortical zone and sinuses area reduction with T-, NK-cells and macrophage markers expression decrease amid the preservation of follicular hyperplasia with high level of activated B lymphocytes and antibody producing plasma cells can promote metastases engrafment in lymph nodes and further cancer generalization.
Keywords: gastric cancer, regional lymph nodes, morphometry, immunohistochemistry.
Рак желудка, согласно последним статистическим данным [3], продолжает занимать одно из первых мест по заболеваемости и смертности. При этом прогноз во многом зависит от адекватности лимфаденэкто-мии, поскольку проблема лимфогенного метастазирования является ключевой в достижении оптимальных результатов хирургического лечения [2].
В то же время изучение метастатического процесса при раке желудка приводит к достаточно противоречивым выводам. Так, одни авторы [12] утверждают, что существуют выраженные различия между поражён-
ными и интактными лимфатическими узлами, тогда как другие [13] доказывают, что определённых изменений в структуру лимфатического узла метастаз не вносит. Подобные противоречия обусловлены, прежде всего, отсутствием комплексного методического подхода. Мы считаем, что для объективной оценки состояния лимфатических узлов необходимо их морфометрическое исследование с параллельным использованием широкой панели моноклональных антител (МКАТ).
Целью настоящей работы явились количественный анализ и иммуногистохимичес-
Таблица ¡
Характеристика первых антител
Антиген Клон Специфичность Рабочее разведение OnpMa-npOH3BOflH-Te^b
CD45 MS355-R Все лейкоциты 1:200 Thermo
CD3 SP7 Т-лимфоциты 1:15 Lab Vision
CD4 MS1528-S Т-хелперы/индукторы 1:50 Thermo
CD8 MS457-s Т-киллеры/супрессоры 1:50 Thermo
CD20 L26 В-лимфоциты 1:250 Lab Vision
CD10 56C6 Иммунобласты 1:50 Dako
CD30 BER-H2 Активированные лимфоциты 1:50 Cell Marque
BLA-36 А27-42 Активированные В-лимфоциты 1:50 BioGenex
Х- и к-цепи иммуно- Поликлональные, Антителообразующие плазматические 1:600 Dako
глобулинов (Ig) код HP6054 L1C1 клетки
CD56 56C04 ЫК-клетки 1:100 Thermo
Миелопероксидаза Поликлональные, код RB-373-A Гранулоциты 1:800 Dako
CD68 PGM1 Все макрофаги 1:200 BioGenex
Лизоцим Поликлональные, код PU 024-UP Свободные макрофаги моноцитарного происхождения 1:100 Diagnostic Biosystems
а1-Антихимотрипсин A022 Фиксированные макрофаги — гистиоциты синусов 1:200 Dako
CD35 E11 Дендритные ретикулярные клетки 1:50 Diagnostic Biosystems
S100 E2144 Интердигитирующие ретикулярные клетки 1:300 Spring
Ki-67 B56 Пролиферирующие клетки 1:50 Pharmingen
CD31 9611 Эндотелий сосудов 1:20 BioGenex
Коллаген IV типа PHM-12 + CTV22 Базальные мембраны 1:150 Lab Vision
Виментин V9 Фибробласты, соединительная ткань 1:300 Lab Vision
Десмин D33 Гладкомышечные клетки 1:400 BioGenex
Таблица 2
П лощади структурных компонентов лимфатических узлов в норме и при метастазировании рака (%, М±ш)
Группа Капсула Трабекулы Кортикальная зона Паракор-тикальная зона Мякотные тяжи Фолликулы Фолликулы с реактивными центрами Синусы
1 4,10±0,84 1,91±0,15 33,94±1,21 6,30±0,40 24,93±1,70 12,13±0,77 2,34±0,22 14,34±0,74
2 4,52±0,22 2,20±0,17 17,95±0,88* 14,73±0,97* 18,02±1,09* 5,08±0,78* 13,25±1,39* 23,89±1,30*
3 7,18±0,44*° 3,58±0,26 22,85±1,64*° 8,80±0,75*° 22,37±1,46° 8,36±0,96*° 12,40±1,28* 14,38±1,29°
Примечание: 1 — контроль (п=30); 2 — лимфатические узлы без метастазов (п=25); 3 — лимфатические узлы с метастазами (п=25); *р <0,05 по сравнению с контролем; °р <0,05 по сравнению по сравнению с группой лимфатических узлов, свободных от метастазов.
кое фенотипирование структурных и клеточных элементов лимфатических узлов, регионарных к раку желудка, при отсутствии и наличии в них метастазов.
Были изучены регионарные лимфатические узлы (144), полученные во время операций по поводу рака желудка от 48 онкологических больных (31 мужчины и 17 женщин, средний возраст которых составил 60,9 года) в соответствии с наличием четырёх основных коллекторов лимфооттока. В качестве контроля послужили лимфатические узлы (30), полученные от 10 практически здоровых лиц тех же возрастных групп, погибших от случайных причин (судебно-медицинские вскрытия).
Лимфатический узел вдоль большой оси разрезали на две части. Одну часть фиксировали в 10% нейтральном формалине по Лилли или жидкости Карнуа и после соответствующей проводки заливали в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по ван Гизону, азур-II-эозином, пиронином по Браше.
Вторая часть была использована для им-муногистохимического исследования [5] в соответствии с алгоритмом, разработанным для фенотипирования структурных и клеточных элементов лимфатического узла [1] (табл. 1). Применяли стандартный биотин-стрептави-дин-пероксидазный метод (DAKO: LSAB® + System-HRP, код K0690) с диаминобензиди-ном в качестве хромогена. Препараты дополнительно окрашивали гематоксилином Майера и заключали в канадский бальзам или специальные среды фирмы DAKO (Ultramount, Faramount, код S302580-2). Характер иммуногистохимических реакций оценивали с учётом интенсивности и процента окрашенных клеток [5].
На гистологических препаратах проводили измерение площадей структурных компонентов лимфатического узла при помощи морфометрической сетки случайного
шага С.Б. Стефанова, а также количественное изучение клеточного состава с использованием морфометрической окулярной сетки Г.Г. Автандилова.
Полученные данные были обработаны статистически с вычислением критерия Стьюдента и величины р. Сравнительное исследование проводили в следующих группах:
1) контроль;
2) лимфатические узлы без метастазов;
3) лимфатические узлы с метастазами различного объёма.
В результате исследования установлено, что в лимфатических узлах, регионарных к раку желудка, имеются выраженные изменения, которые касаются практически всех структурных и клеточных элементов. При этом иммуноморфологические реакции стереотипны и не зависят от пола, возраста больных, гистологического типа первичной опухоли, принадлежности к определённому коллектору лимфооттока, а определяются исключительно отсутствием или наличием метастазов.
Так, ещё до появления клеток опухоли в лимфатических узлах по сравнению с контролем отмечалась тенденция к утолщению капсулы и увеличению числа тра-бекул (табл. 2). Иммуногистохимически в капсульно-трабекулярной основе и внеклеточном матриксе увеличивалась экспрессия виментина, десмина, коллагена IV типа и CD31.
В кортикальной зоне отмечалась выраженная плазматизация (рис. 1): количество зрелых и незрелых плазмоцитов увеличивалось соответственно до 13,428±1,265 и 2,696±0,249% (табл. 3). Иммуногистохимически здесь возрастало число CD20(+) В-клеток, CDЮ(+) иммунобластов, ВЬА-36(+) активированных В-лимфоцитов и, как следствие, анти-^(+) антителообразующих плазматических клеток.
Таблица 3
Клет очный состав структурных компонентов лимфатических узлов в норме и при метастазировании рака
(%, М±m)
Группа Кортикальная зона Паракор-тикальная зона Мякотные тяжи Первичные фолликулы Фолликулы с реактивными центрами Синусы
Ретикулярные клетки 1 15,820±0,704 6,947±0,358 20,590±2,352 10,340±0,722 19,206±0,912 35,820±1,074
2 15,372±0,836 15,184±0,734* 19,252±1,053 17,680±1,198* 25,292±0,973* 43,228±1,350*
3 15,640±0,815 13,924±0,953* 20,736±0,988 13,876±1,078*° 24,796±0,996* 45,472±1,541*
Иммуноблас-ты 1 0,797±0,038 0,683±0,163 0,087±0,014 1,593±0,213 4,283±0,139 0,393±0,088
2 0,792±0,199 1,312±0,308* 1,952±0,356* 1,836±0,238 7,420±0,650* 3,080±0,517*
3 0,796±0,153 0,688±0,160 0,432±0,088*° 0,348±0,081*° 4,596±0,435° 0,758±0,183°
Большие лимфоциты 1 0,687±0,162 0,683±0,162 0,633±0,073 0,353±0,062 3,133±0,106 0,547±0,087
2 0,664±0,109 0,724±0,115 0,616±0,105 1,052±0,148* 1,508±0,155* 0,156±0,045*
3 0,544±0,115 0,552±0,114 0,488±0,107 0,552±0,129° 1,308±0,176*° 0,180±0,065*
Средние лимфоциты 1 33,070±1,555 26,577±0,940 30,720±1,551 27,437±0,776 26,340±1,555 21,637±2,057
2 20,056±1,268* 22,196±1,594* 21,056±1,795* 22,300±1,538* 16,892±1,255* 15,116±0,992*
3 26,784±1,510*° 23,944±1,661 23,860±1,625* 24,876±2,122 21,192±1,272*° 18,216±1,277
Малые лимфоциты 1 46,827±0,671 63,680±0,898 44,200±2,033 58,357±1,574 45,520±0,849 36,957±1,418
2 45,512±1,342 55,240±1,688* 37,716±1,569* 53,064±2,000* 44,108±1,228 30,908±1,037*
3 46,576±1,848 58,780±1,666* 45,092±1,979*° 59,148±2,083° 44,944±1,849 31,664±1,513*
Зрелые плазмоциты 1 1,767±0,211 0,773±0,184 2,780±0,374 0,717±0,185 0,410±0,096 2,043±0,369
2 13,428±1,265* 2,592±0,591* 15,488±1,508* 1,648±0,355* 1,668±0,431* 3,832±0,561*
3 7,408±1,079*° 1,192±0,244° 7,784±1,232*° 0,464±0,134° 0,720±0,146° 2,308±0,384°
Незрелые плазмоциты 1 0,503±0,100 0,207±0,075 0,740±0,113 0,240±0,065 0,113±0,026 0,657±0,104
2 2,696±0,249* 0,476±0,163 2,860±0,263* 0,212±0,070 0,344±0,152 0,824±0,163
3 1,472±0,222*° 0,228±0,069 1,272±0,263° 0,052±0,018*° 0,224±0,064 0,592±0,141
Тучные клетки 1 0,037±0,010 0,017±0,014 0,040±0,010 0,003±0,003 — 0,107±0,027
2 0,096±0,068 0,088±0,030* 0,084±0,034 0,024±0,012 0,016±0,009 0,672±0,252*
3 0,020±0,010 0,008±0,006° 0,008±0,008*° — — 0,064±0,020°
Эозинофилы 1 0,043±0,013 0,010±0,006 0,070±0,020 0,013±0,006 0,010±0,007 0,110±0,021
2 0,080±0,048 0,004±0,004 0,004±0,004* 0,024±0,009 0,032±0,014 0,304±0,096*
3 0,024±0,010 0,004±0,004 0,004±0,004* 0,004±0,004° 0,008±0,006 0,148±0,040
Нейтрофилы 1 0,023±0,011 0,013±0,008 0,043±0,010 0,013±0,006 0,007±0,005 0,043±0,011
2 0,036±0,016 0,016±0,007 0,048±0,020 0,012±0,012 0,012±0,007 0,396±0,180
3 0,044±0,021 0,004±0,004 0,012±0,009* 0,024±0,009 0,016±0,007 0,084±0,020
Макрофаги 1 0,247±0,064 0,310±0,074 0,043±0,014 0,083±0,024 0,617±0,149 1,663±0,256
2 0,480±0,149 1,796±0,284* 0,880±0,220* 0,560±0,120* 1,928±0,269* 1,596±0,338
3 0,552±0,136* 0,596±0,133° 0,176±0,077° 0,252±0,079*° 1,376±0,274* 0,492±0,150*°
Митозы 1 0,180±0,041 0,037±0,011 0,053±0,018 0,503±0,072 0,327±0,055 0,020±0,007
2 0,064±0,019* 0,188±0,059* 0,080±0,040 0,604±0,149 1,060±0,166* 0,068±0,040
3 0,140±0,056 0,080±0,022 0,096±0,050 0,404±0,137 0,976±0,150* 0,044±0,016
Примечание: 1 — контроль (п=30); 2 — лимфатические узлы без метастазов (п=25); 3 — лимфатические узлы с метастазами (п=25); *p <0,05 по сравнению с контролем; °p <0,05 по сравнению с группой лимфатических узлов, свободных от метастазов.
Лимфоидные фолликулы были гипер-плазированы, содержали крупные реактивные центры (рис. 2) — их площадь увеличивалась и достигала 13,25±1,39%. Возрастало по сравнению с контролем содержание им-мунобластов, а также зрелых и незрелых плазмоцитов.
Иммуногистохимически здесь выявлялись CD20(+) В-лимфоциты, расположенные по всей площади фолликула, включая реактивный центр и мантийную зону (рис. 3), CD10(+) иммунобласты, Ю-67(+) пролифери-рующие клетки (преимущественно герминативный центр), BLA-36(+) активированные
Рис. 1. Плазматизация мякотных тяжей. Окраска пи-ронином по Браше. х600
Рис. 2. Гиперплазированный лимфоидный фолликул с крупным реактивным центром. Окраска гематоксилином и эозином. х400
Рис. 3. СБ20(+) В-лимфоциты в лимфоидном фолликуле. LSAB-метод с докраской гематоксилином. х400
Рис. 4. СБ68(+) макрофаги в реактивном центре фолликула. LSAB-метод с докраской гематоксилином. х400
Рис. 5. СБ3(+) Т-клетки в гиперплазированной пара-кортикальной зоне. LSAB-метод с докраской гематоксилином. х400
В-клетки и анти-^(+) плазматические клетки (мантийная зона и интерфолликулярный регион).
Обращало на себя внимание увеличение количества макрофагов в реактивных центрах — до 1,928±0,269%, с выраженной реакцией МКАТ против CD68 (рис. 4). Все клеточные элементы фолликулов были рас-
положены в сети CD35(+) дендритных ретикулярных клеток.
Определённые изменения, которые в целом были сходны с таковыми в кортикальной зоне, наблюдались и в мякотных тяжах. Их площадь несколько уменьшалась за счёт гиперплазии паракортикальной зоны и синусов — до 18,02±1,09%. Здесь отмечалась выраженная плазматизация с увеличением процента как зрелых, так и незрелых плазматических клеток. Содержание данных клеточных форм составляло соответственно 15,488±1,508 и 2,860±0,263%. Кроме того, в мякотных тяжах увеличивалось содержание иммунобластов и макрофагов до 1,952±0,356 и 0,880±0,220% соответственно.
Выраженные изменения по сравнению с контрольной группой выявлялись в пара-кортикальной зоне. Она была резко гипер-плазирована — 14,73±0,97% общей площади среза лимфатического узла. Наблюдалось увеличение числа CD3(+) Т-клеток (рис. 5), за счёт как CD4(+) хелперов/индукторов, так и CD8(+) киллеров/супрессоров.
Возрастало содержание CDЮ(+) иммуно-
Рис. 6. Экспрессия а1-антихимотрипсина в ретикулярных клетках синуса. LSAB-метод с докраской гематоксилином. х400
бластов, CD30(+) активированных лимфоцитов и CD56(+) МК-клеток. Наличие про-лиферативной активности подтверждалось высокой экспрессией Ki-67, а количество митотически делящихся клеток составляло 0,188±0,059%. Имела место тенденция к увеличению количества макрофагов (до 1,796±0,284%), позитивных на CD68 и ли-зоцим. Кроме того, в паракортикальной зоне обнаруживались ретикулярные клетки (15,184±0,734%), большая часть которых, судя по экспрессии 8100, относилась к интерди-гитирующим ретикулоцитам.
Активно реагировали на опухолевый рост синусы лимфатических узлов — их площадь возрастала до 23,89±1,30%. Они в основном были заполнены плотно прилежащими друг к другу ретикулярными клетками, содержание которых достигало 43,228±1,350%. При этом иммуногис-тохимически больше всего выявлялись а^антихимотрипсин(+), CD68(+) и лизо-цим(+) (рис. 6). По сравнению с контролем в синусах возрастала и экспрессия МКАТ против CD3, CD4, CD8, CD10, CD30, CD56, миелопероксидазы, а в ряде случаев — против Ю-67, десмина, виментина и коллагена IV типа. Кроме того, здесь содержались плазматические клетки (3,832±0,561%) с высокой антителообразующей способностью, что выявлялось окрашиванием МКАТ против Х- и к-цепей
Определённым изменениям подвергалось кровеносное микроциркуляторное русло лимфатических узлов. Сосуды были расширены и полнокровны. При использовании МКАТ против коллагена IV типа выявлялись разрыхление и фрагментация базальных мембран. Эндотелий выбухал в просвет сосудов, что видно по иммуногис-тохимической реакции против CD31. 976
Рис. 7. Гиперплазированный фолликул, окружённый метастазами рака. Окраска гематоксилином и эозином. х100
При появлении метастазов в лимфатических узлах увеличивалась площадь капсулы (до 7,18±0,44%) и трабекул (до 3,58±0,26%) с высокой экспрессией в них десмина, вимен-тина, коллагена IV типа и CD31.
Реакция кортикальной зоны и мякот-ных тяжей на появление клеток опухоли при сохранении иммуногистохимического фенотипа проявлялась уменьшением числа плазмоцитов. Однако это снижение было относительным, поскольку по сравнению с контролем их количество оставалось повышенным и составляло 7,408±1,079% (корковое плато) и 7,784±1,232% (мякотные тяжи).
При использовании МКАТ против Х- и к-цепей ^ выявлялась высокая антитело-образующая способность этих клеток. Расположенные в кортикальной зоне лимфоид-ные фолликулы при появлении метастазов не подвергались сколько-нибудь заметным изменениям. Они вплоть до полного замещения лимфатического узла опухолевой тканью оставались гиперплазированными, с наличием больших реактивных центров (рис. 7).
Площадь таких фолликулов составляла 12,40±1,28%. Клеточный состав также практически не менялся. Преобладала фолликулярная реакция со следующим иммуногис-тохимическим фенотипом: CD20, CD10, Ю-67, BLA-36, Х- и к-цепи CD35 (рис. 8), при невысокой экспрессии Т-клеточных и макрофагальных маркёров, особенно CD8.
В отличие от коркового плато и лимфо-идных фолликулов, существенно реагировала на появление метастазов паракорти-кальная зона. Её площадь уменьшалась до 8,80±0,75%. Снижалась экспрессия CD3(+), CD4(+), CD8(+) маркёров. Существенно меньше выявлялось CD30(+) активированных лимфоцитов, CD10(+) иммунобластов
Рис. 8. Высокая пролиферативная активность клеток реактивного центра фолликула. Реакция с моноклональ-ными антителами против К>67. 1£АБметод без докрас-ки гематоксилином. х400
Рис. 10. Экспрессия виментина в синусе вокруг метастаза рака. 1£АВ-метод с докраской гематоксилином. х40
и Ю-67(+) пролиферирующих клеток. Редкой находкой были свободные макрофаги, содержащие лизоцим. Экспрессия Б100, CD20, БЬА-36, Х- и к-цепей ^ в паракорти-кальной зоне при метастазировании не менялась.
Определённым изменениям при появлении метастазов в лимфатических узлах подвергались синусы. Прежде всего, обращало на себя внимание уменьшение их площади — до 14,38±1,29%. Они зачастую были опустошены и бедны клеточными элементами, что иногда сопровождалось лимфостазом. Кроме того, в синусах отмечалось разрастание соединительной ткани с повышением экспрессии виментина (рис. 9, 10). Изменялся и клеточный состав за счёт уменьшения количества иммуно-бластов, макрофагов и нейтрофилов — до 0,758±0,183, 0,492±0,150 и 0,084±0,020% соответственно. При иммуногистохимическом анализе выявлялось снижение экспрессии CD68, лизоцима, миелопероксидазы и, в меньшей степени, а^антихимотрипсина.
Рис. 9. Склероз синусов. Окраска гематоксилином и эозином. х100
Редко встречались CD3(+), CD4(+), CD8(+), CD10(+), CD30(+) и CD56(+) элементы.
Продолжало изменяться параллельно росту опухоли и кровеносное микроцирку-ляторное русло лимфатических узлов. Кроме выраженного полнокровия, отмечался выход эритроцитов за пределы сосудистого русла. Реакция с МКАТ против CD31 выявляла выбухание эндотелия в просвет сосудов и его десквамацию, а с МКАТ против коллагена IV — деструкцию базальных мембран.
Таким образом, при развитии рака желудка в регионарных лимфатических узлах заметно меняются соотношение площадей структурных компонентов, клеточный состав и иммуногистохимический фенотип. До появления метастазов имеют место пара-кортикальная и фолликулярная гиперплазия, синусный гистиоцитоз. Оценивая эти изменения непоражённых лимфатических узлов, следует отметить, что Т-клеточная и макрофагальная реакции способны предотвращать процесс лимфогенного метастази-рования или задерживать его [6]. Напротив, высокая активность В-лимфоцитов с плаз-матизацией может ему способствовать за счёт блокирующего действия гуморальных антител на цитотоксичность клеток-эффекторов [10].
При появлении метастазов на фоне уменьшения площади паракортикальной зоны происходит снижение экспрессии CD3, CD4, CD8, CD10, CD56, Ю-67. В то же время известно, что CD8(+) лимфоциты-киллеры являются основными цитотоксически-ми противоопухолевыми элементами [9], а CD4(+) хелперная субпопуляция необходима для их трансформации [8]. Это, однако, не сказывается на активации В-клеток, по-
скольку в ответ на ряд антигенов они могут пролиферировать и дифференцироваться без помощи Т-хелперов. CD56(+) МК-клетки также обладают опухолелитическими свойствами [14], и уменьшение их количества наряду с CD68(+) и лизоцим(+) макрофагами приводит к падению противоопухолевой цитотоксичности.
Изменения в синусах свидетельствуют о снижении функциональной активности фиксированных и свободных макрофагов, а также эозинофилов и нейтрофилов, что коррелирует с неблагоприятным прогнозом [1]. В то же время сохраняется фолликулярная гиперплазия с высоким содержанием В-клеток, в том числе активированных, и антителообразующих плазмоцитов.
Следует отметить и высокую функциональную активность CD35(+) дендритных ретикулярных клеток, реализующих переработку антигена для В-лимфоцитов [11], и недостаток CD8(+) Т-супрессоров, способных угнетать синтез иммуноглобулинов разных классов [4]. Прогрессирующие микроцир-куляторные расстройства и стромально-со-судистые реакции также во многом определяют приживление в лимфатических узлах опухолевых клеток [7].
ВЫВОДЫ
1. В регионарных лимфатических узлах при развитии рака желудка меняются соотношение площадей структурных компонентов, клеточный состав и иммуногис-тохимический фенотип, при этом есть существенные различия между интакт-ными и поражёнными лимфатическими узлами.
2. Иммуноморфологические реакции лимфатических узлов стереотипны и не зависят от пола, возраста больных, гистологического типа первичной опухоли, принадлежности к определённому коллектору лимфооттока, а определяются исключительно отсутствием или наличием в них метастазов.
3. Уменьшение площади паракортикаль-ной зоны и синусов со снижением экспрессии Т- , МК-клеточных и макрофагальных маркёров при сохранении фолликулярной гиперплазии с высоким содержанием активированных В-лимфоцитов и антитело-образующих плазматических клеток может способствовать приживлению в лимфатических узлах метастазов и дальнейшей генерализации опухолевого процесса.
978
ЛИТЕРАТУРА
1. Белянин В.Л., Цыплаков Д.Э. Диагностика реактивных гиперплазии лимфатических узлов. СПб., Казань. 1999; 328 с. [Belyanin V.L., Tsyplakov D.E. Diagnostika reaktivnykh giperplaziy limfaticheskikh uzlov. (Diagnosis of lymph nodes reactive hyperplasia.) St. Petersburg, Kazan. 1999; 328 p. (In Russ.)]
2. Гуляев А.В., Симбирцев С.А., Лойт А.А. и др. Особенности лимфатического оттока от желудка и характеристика групп регионарных лимфатических узлов. Вестн. хир. им. И.И. Грекова. 2004; (6): 21-25. [Gulyaev A.V., Simbirtsev S.A., Loyt A.A. et al. Features of the stomach lymphatic drainage and regional lymph nodes groups characteristics. Vestnik khirurgii im. I.I Grekova. 2004; (6): 21-25. (In Russ.)]
3. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2012 г. Издательская группа РОНЦ. 2014; 226 с. [Davydov M.I., Aksel' E.M. Statistika zlokachestvennykh novoobrazovaniy v Rossii i stranakh SNG v 2012 g. (Malignant tumors statistics in Russia and the CIS countries in 2012.) Izdatel'skaya gruppa RONTs. 2014; 226 p. (In Russ.)]
4. Йегер Л. Клиническая иммунология и аллергология. В 3 томах. М.: Медицина. 1990; 1: 528 с. [Yeger L. Klinicheskaya immunologiya i allergologiya. V 3 tomakh. (Clinical immunology and allergy. In 3 volumes.) Moscow: Meditsina. 1990; 1: 528 p. (In Russ.)]
5. Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по имму-ногистохимической диагностике опухолей человека. Казань. 2012; 624 с. [Petrov S.V., Raykhlin N.T. Rukovodstvo po immunogistokhimicheskoy diagnostike opukholey cheloveka. (Guidelines for immunohistochemical diagnosis of human tumors.) Kazan. 2012; 624 p. (In Russ.)]
6. Тупицын Н.Н. Субпопуляции иммуноцитов в гистологических срезах рака молочной железы. Вопр. онкол. 1994; (7-12): 314-318. [Tupitsyn N.N. Immunocytes subpopulations in histological sections of breast cancer. Voprosy onkologii. 1994; (7-12): 314-318. (In Russ.)]
7. Цыплаков Д.Э., Зиганшина Л.Е. Роль микроцир-куляторных факторов в метастазировании рака. Вопр. онкол. 1988; (8): 932. [Tsyplakov D.E., Ziganshina L.E. The role of microcirculatory factors in cancer metastasis. Voprosy onkologii. 1988; (8): 932. (In Russ.)]
8. Gerloni M., Zanetti M. CD4 T cells in tumor immunity. Springer Semin. Immunopathol. 2005; 27: 37-48.
9. Fourcade J., Sun Z., Pagliano O. et al. CD8(+) T cells specific for tumor antigens can be rendered dysfunctional by the tumor microenvironment through upregulation of the inhibitory receptors BTLA and PD-1. Cancer Res. 2012; 72: 887-896.
10. Hellstrom K.E., Hellstrom I. Lymphocyte-mediated cytotoxity and blocking serum activity to tumor antigens. Adv. Immunol. 1974; 18: 209-277.
11. Katakai T., Hara T., Lee J.-H. et al. A novel reticular stromal structure in lymph node cortex: an immuno-platform for interactions among dendritic cells, T cells and B cells. Intern. Immunol. 2004; 16: 1133-1142.
12. Kimpton W.C., McKenzie G.A., Muller H.K. et al. Lymphphocyte migration during the development of regional lymph node anergy in experimental tumor growth. Cell. Immunol. 1983; 75: 13-21.
13. Takeuchi H., Suchi T., Suzuki R., Sate T. Histological study of immune parameters of regional lymph nodes of gastric cancer patients. GANN: Jap. J. Cancer Res. 1982; 73: 420-428.
14. Vitale M., Cantoni C., Pietra G. et al. Effect of tumor cells and tumor microenvironment on NKcell function. Eur. J. Immunol. 2014; 44: 1582-1592.
