CC BY
56
УДК 611.018.63
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРНЫХ ПРОЯВЛЕНИЙ РЕАКЦИИ ТКАНЕЙ МИОКАРДА В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДИАБЕТА
Л.Г.Прошина, Н.П.Федорова, М.В.Григорьева, Л.М.Антонова, О.С.Быкова, А.В.Замышляев
Институт медицинского образования НовГУ, Lidiya.Proshina@novsu.ru
Исследованы структурные и иммуноцитохимические особенности тканей миокарда в экспериментальных моделях аллоксанового диабета. Выявлено, что экспериментальный диабет вызывает реактивную перестройку тканей миокарда, которая носит адаптивный и компенсаторный характер.
Ключевые слова: миокард, аллоксановый диабет, адаптация
The structural and immunocytochemical features of myocardium tissues in experimental models of alloxan diabetes are investigated. It is found out that the experimental diabetes causes the responsive reorganization of myocardium tissues which has adaptive and compensatory character.
Keywords: myocardium, alloxan diabetes, adaptation
Значимость сахарного диабета состоит в том, что это заболевание приводит к ранней инвалидиза-ции и летальности [1,2]. Сахарный диабет оказывает влияние на процессы регенерации и репарации, а также негативное воздействие на сосудистую систему. Гипоинсулинемия приводит к выраженным нарушениям обмена веществ, что вызывает структурные и функциональные нарушения на всех уровнях целостной системы организма, в частности на тканевом и клеточном. В настоящее время уделяется внимание изучению морфофункциональных изменений тканевых, клеточных и субклеточных компонентов миокарда, осуществляющих структурно-метаболические, адаптационные и регенераторные процессы в сердце, а также обеспечивающие эффективное функционирование сердечно-сосудистой системы [3,4]. Однако недостаточны и неоднозначны сведения о структурных изменениях тканей миокарда при диабете. Именно структурные и иммуноцитохими-ческие особенности тканей миокарда при экспериментальном диабете и стали предметом настоящего исследования.
Материалы и методы исследования
Эксперименты проведены в соответствии с «Этическими правилами проведения работ с экспериментальными животными» на крысах — самцах инбредной линии Wistar — весом 150-250 г. Возраст животных 3-4 месяца. Сформировано две группы животных: интактные (50 крыс) и с экспериментальным сахарным диабетом (85 крыс). Модель экспериментального диабета (ЭД) формировали путем внутрибрюшинного введения аллоксана в дозе 20 мг/100 г веса животных выводили из эксперимента на 10, 14 и 21 сутки. Для подтверждения развития ЭД исследовали гистологические препараты хвостового отдела поджелудочной железы, окрашенные гематоксилином и эозином, а также альдегид-фуксином. Определяли содержание глюкозы в сыворотке крови глюкозооксидантным методом. Радио-иммунным методом проводили определение имму-
но-реактивного инсулина (ИРИ) в плазме крови. Оценивали глюкозо-инсулиновый индекс (ГИИ) — отношение концентрации глюкозы в ммоль/л к концентрации ИРИ в мкЕд/мл. Учитывали динамику массы животных в ходе эксперимента. Определяли процент летальности.
В работе использованы морфологические и иммуногистохимические методы. Для оценки содержания коллагена выполнялось иммуногистохи-мическое (ИГХ) исследование парафиновых срезов миокарда толщиной 5 мкм, применялся иммунопе-роксидазный метод с использованием аффинно-очищенных кроличьих поликлональных первичных антител к антигенам коллагена I и III типов. Оценка результатов проводилась в 10 произвольно выбранных полях зрения при 200-кратном увеличении отдельно по зонам: интерстициальной (различались эндомизиальный и перимизиальный коллаген) и пе-риваскулярной по разработанной нами полуколиче-ственной (в баллах) шкале. Для определения содержания сократительных белков в миокарде использовали моноклональные антитела к тубулину, десми-ну, миозину и тропонину (фирма «Sigma», США), вторичные антитела, конъюгированные с пероксида-зой хрена (фирма «Boehringer Manheim», Германия). Для определения содержания сократительных белков в миокарде использовали моноклональные антитела к десмину и миозину («Sigma»), вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена («Boehringer Manheim»).
Результаты и их обсуждение
Гистологическое исследование поджелудочной железы крыс, которым вводили аллоксан, позволило выявить значительные структурные изменения и в эндокринном, и в экзокринном ее аппаратах. Центрально расположенные клетки островка Лангерганса претерпевают деструктивные изменения. Повреждение островковой ткани сводилось к значительному уменьшению числа и объемной плотности панкреатических островков (ОПО)
(табл.1), их деформации, появлению в них зон некроза. Реакция на инсулин-содержащие В-клетки с альдегид-фуксином практически отсутствовала, что указывало на угнетение диабетогенным агентом биосинтеза гормона. На препаратах, окрашенных гематоксилином-эозином, заметны явления гипер-хромии ядер и деформации клеток, визуально снижается плотность капилляров островка, изменяется микроциркуляторное русло, что соответствует данным работ И.И.Дедова [2].
Таблица 1
Динамика структурных изменений эндокринной части поджелудочной железы крыс на фоне экспериментального аллоксанового диабета (Ы±ш)
Серии эксперимента п Ш00мм2 ОПО, усл.ед.
Интактные 50 58,5±1,3 0,32±0,13
ЭД, 10 суток 28 37,9±1,1* 0,12±0,009*
ЭД, 14 суток 27 36,2±0,7* 0,11±0,008*
ЭД, 21 суток 30 37,5±0,7* 0,11±0,007*
Примечание: * p < 0,05 относительно интактных.
В течение первой недели после введения аллоксана у крыс визуально нарастало потребление воды, усиливался диурез, изменялись показатели глюкозы, ИРИ и ГИИ. Уровень глюкозы в крови поднимался до 19,40±0,18 ммоль/л, что в 4,5 раза выше значений у интактных крыс (4,29±0,44 ммоль/л). ГИИ существенно превышал «единицу» (табл. 2).
Таблица 2
Показатели углеводного обмена в плазме крови крыс на фоне экспериментального аллоксанового диабета (Ы±ш)
Серии эксперимента Глюкоза, ммоль/л ИРИ, мкЕд/мл ГИИ
Интактные 4,29±0,44 16,23±0,44 0,27±0,01
ЭД, 10 суток 19,4±0,18* 0,91±0,06* 22,50±1,41*
ЭД, 14 суток 18,37±0,25* 2,36±1,17* 8,35±0,73*
ЭД, 21 суток 18,31±0,23* 2,37±0,17* 8,17±0,61*
Примечание: * р < 0,05 относительно интактных.
Максимальный уровень летальности во всех экспериментальных группах с диабетом был отмечен на 3-5 сутки. Этот период соответствует развитию острой формы диабета, которая обычно приводит к гибели животных [2]. У оставшихся диабетических крыс развивалась хроническая форма с разной степенью проявления симптомов заболевания. В целом летальность на протяжении эксперимента составляла от 31% до 38%. Потеря массы составила от 2,3±0,3% на 10-е сутки до 8,9±0,6% на 21-е сутки после введения аллоксана.
Дополнительным критерием развития гипоксии миокарда служили гистологические препараты,
окрашенные по методике Ли в собственной модификации (рис.1). Кардиомиоциты (КМЦ), испытывающие гипоксию в миокарде на фоне ЭД окрашиваются в более яркий красный цвет (фуксинофиль-ны).
б)
Рис.1. Миокард сердца: а) контрольной крысы, х400; б) крысы с экспериментальной ишемией, х200; окраска по Ли (ГОФП)
На гистологических препаратах сердец животных с ЭД выявлялась гетерогенность популяции КМЦ. На гистологических препарата визуализируются гипертрофированные, частично или полностью деструктивные клетки, поперечная исчерченность в которых (на светооптическом уровне) не просматривалась. Наблюдалась значительная вакуолизация саркоплазмы. Отмечалась неравномерная интенсивность окраски КМЦ. Ядра имели неправильную форму, располагались как в центре кардиомиоцитов, так и на периферии. Встречались поля с истонченными и извитыми, деструктивно измененными функциональными мышечными волокнами. На фоне развития сахарного диабета наблюдался выраженный межмышечный отек, содержание аморфного вещества составило 16,7±0,5%, что в 2,4 раза превышало контрольные значения. Количество коллагеновых волокон возрастало в 2,8 раза по сравнению с контрольной группой животных, паренхиматозно-стромальный индекс (ПСИ) снизился в 3,5 раза (рис.2).
90 80 70 л 60 I— о
2 50
I©
о
40
30
20
10
0
■ контроль нЭД
КМЦ
коллаген
Рис.2. Объемная плотность кардиомиоцитов и коллагена в миокарде крыс в условиях ЭД
На фоне экспериментального диабета отмечено возрастание коллагена III типа (рис.3).
5
4.5 4
3.5
3
Ф
^2,5
2
1,5
1
0,5
0
нконтроль
ыэд
Коллаген I типа Коллаген III типа
Рис.3. Соотношение коллагена I и III типов миокарда в контроле и при ЭД, выявленного методом иммунодиагностики
С целью определения функциональных (сократительных) возможностей кардиомиоцитов и вклада в них типа сократительных белков было проведено определение соотношения видов белков в составе мио-цитов (табл.3).
Таблица 3
Сократительные белки кардиомиоцитов крыс в условиях ЭД (М±т)
Условия Десмин, усл.ед. Миозин, усл.ед.
эксперимента
Контроль, n = 50 12,4±0,3 7,9±0,2
ЭД (14 сут.), n = 85 15,6±0,2* 8,3±0,4
Примечание: * р < 0,05 относительно интактных.
В миокарде животных с ЭД наблюдалось повышение содержания белка цитоскелета десмина в среднем на 18%. Увеличение экспрессии сократительного белка миозина на 10% свидетельствует о
гипертрофических изменениях значительной части кардиомиоцитов, которые отмечали на 14-е сутки.
Повышение синтеза ряда цитоскелетных белков, очевидно, связано с адаптивной и компенсаторной перестройкой кардиомиоцитов в ответ на повышенную нагрузку. Однако длительное повышение синтеза белков со временем приводит к патологическим изменениям. Повышение уровня экспрессии изоформ десмина, белка промежуточных филаментов, у животных на ранних стадиях патологии приводит к увеличению жесткости и прочности миофиламентов, испытывающих повышенную механическую нагрузку. По мере накопления этого белков в клетке происходит повышение вязкости саркоплазмы, окружающей рабочие актомиозиновые структуры. В результате этого процесс продвижения миозиновых филамен-тов относительно актиновых затрудняется, и эффективность сокращения падает.
Применение иммуногистохимических методов исследования тканей миокарда позволило отметить превалирование содержания коллагена III типа в межклеточном веществе при ЭД.
Заключение
Методом иммунодиагностики на основе моно-и поликлональных антител выявлено присутствие коллагенов I и III типов в миокарде крыс как компонентов межклеточного матрикса в условиях нормы и патологии. При экспериментальном диабете возрастает содержание коллагена, с превалированием в 2,8 раза коллагена III типа. При ЭД отмечено увеличение содержания белков цитоскелета и сократительных белков кардиомиоцитов десмина и миозина.
Работа выполнена в рамках реализации федеральной целевой программы «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 гг.
1. Балаболкин М.И. Диабетология. М., 2000. С.672.
2. Дедов И.И., Никонова Т.В., Смирнова С.А. и др. Роль ци-токинов в регуляции иммунного ответа и механизмы гибели В-клеток при различных вариантах течения сахарного диабета I типа // Проблемы эндокринологии. 2005. Т.51. №3. С.3-7.
3. Александров А.А. Диабетическое сердце: схватка за митохондрии // CONSILIUM-MEDICUM. 2003. Т.05. №9. С.509-513.
4. Аметов А.С., Сокарева Е.В., Гиляревския С.Р., Дикова Т.Е. Диастолическая дисфункция левого желудочка у больных сахарным диабетом 2 типа // Сахарный диабет. 2008. №1. С.40-44.
Bibliography (Transliterated)
1. Balabolkin M.I. Diabetologija. M., 2000. S.672.
2. Dedov I.I., Nikonova T.V., Smirnova S.A. i dr. Rol' citokinov v reguljacii immunnogo otveta i mehanizmy gibeli V-kletok pri razlichnyh variantah techenija sahar-nogo diabeta I tipa // Problemy jendokrinologii. 2005. T.51. №3. S. 3-7.
3. Aleksandrov A.A. Diabeticheskoe serdce: shvatka za mito-hondrii // CONSILIUM-MEDICUM. 2003. T.05. №9. S.509-513.
4. Ametov A.S., Sokareva E.V., Giljarevskija S.R., Dikova T.E. Diastolicheskaja disfunkcija levogo zheludochka u bol'nyh saharnym diabetom 2 tipa // Saharnyj diabet. 2008. №1. S.40-44.
