CC BY
683
УДК 616.15. - 615.38 О.А. Искакова
АО «Республиканский научный центр неотложной медицинской помощи», г. Астана
ПРИМЕНЕНИЕ ГЕЛЕВОЙ ТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ИММУНОГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ КРОВИ
Аннотация
Статья содержит сведения о гелевой технологии, используемой для иммуногематологических исследований крови, принципах гелевого теста, характеристику идентификационных карт. Здесь же описывается клиническая значимость и преимущества гелевой технологии, а также представлены результаты некоторых исследований. Предназначено для специалистов, занимающихся иммуногематологическими исследованиями в трансфузиологии, трансплантологии, гематологии, иммунологии.
Ключевые слова: иммуногематология, гелевые технологии, стандартизация гемагглютинации.
Введение. Гелевая технология была предложена Y.Lapierre в 1989г. - основана на агглютинации эритроцитов в агаровом геле «сефадекс», помещенных в микропробирки и внедрена с целью стандартизации реакций гемагглютинации с получением достоверных результатов.
Обычно иммуногематологические исследования, основанные на реакции гемагглютинации, проводятся в жидкофазных системах. Ложные, слабые или отрицательные результаты непрямого антиглобулинового теста, за счет нейтрализации антиглобулинового реагента следами сыворотки (вследствие недостаточно эффективного отмывания эритроцитов), могут стать причиной ошибок и неверно интерпретированы, особенно неопытным персоналом.
Гелевая технология использует комбинацию методов агглютинации и гель-фильтрации.
Тесты включают в себя: определение группы крови, Rh-фактора, фенотипа эритроцитов, антиглобулино-вый тест, скрининг и идентификацию антител, тесты на совместимость и некоторые другие.
Для исследований пригодны как образцы цельной крови (взятые в чистую, сухую пробирку), так и образцы крови, взятые на консервантах и стабилизаторах. Также пригодна артериальная, капиллярная и пуповинная (без отмывания) кровь.
Характеристика идентификационных карт. Идентификационные карты (ID-карты) представляют собой пластиковые карточки, в которые встроено по шесть микропробирок. В пяти пробирках содержится смесь геля со специфическими моноклональными антителами и антиглобулиновым реагентом, предназначены для определения группы крови по системе АВ0 и Rh-принадлежности эритроцитов доноров и реципиентов (включая слабые варианты антигенов), а также для типирования других антигенов эритроцитов.
Каждая карточка имеет шестую контрольную пробирку, содержащую нейтральный гель без антител (otl).
Маркировка пробирок в ID-карте осуществляется по выявляемым антигенам, например: А-В-АВ-D-CDE-rtl или С-с-Е-е-K-oti.
Идентификационные карты для выявления антител к антигенам эритроцитов имеют некоторые отличия, например, карты "Coombs / Enzyme Test": в трех пробирках, расположенных слева, содержится гель, содержащий антитела к глобулинам человека (моноспецифические анти-IgD или полиспецифические - к иммуноглобулинам различных классов) - реакция Кумбса. В следующих трех пробирках содержится только нейтральный гель, предназначенный для выявления антител к антигенам эритроцитов в солевой среде.
Принцип гелевого теста. Для проведения тестов обычно используются три вида геля:
1) нейтральный, не содержащий специфических антител (применяется для поиска и идентификации антител солевым и ферментативным методами, на холодо-вой стадии пробы на совместимость крови донора и реципиента);
2) специфический, содержащий антитела (монокло-нальные или поликлональные) к антигенам эритроцитов крови человека (применяется для типирования антигенов эритроцитов систем АВ0, Rh, Kell и т.д.);
3) антиглобулиновый, содержащий антитела (полиспецифические или моноспецифические) к иммуноглобулинам человека и компонентам системы комплемента (применяется для прямого и непрямого антиглобулино-вого теста, т.е. реакции Кумбса, при поиске и идентификации ауто- и аллоиммунных антител, пробе на совместимость крови донора и реципиента).
Исследуемые или стандартные эритроциты и исследуемая сыворотка (плазма) помещаются в соответствующие микропробирки, где происходит реакция агглютинации, затем идентификационные карты центрифугируются для разделения результатов реакции. При этом неагглютинированные эритроциты свободно проходят между частицами геля и образуют на дне микропробирки компактный осадок красного цвета - отрицательный результат; агглютинированные располагаются на поверхности или в толще геля (в зависимости от размеров агглютинатов) - положительный результат.
В зависимости от силы реакции агглютинации в ге-левой среде принята следующая оценка полученных результатов:
• сильно-положительный (++++) - образовавшиеся агглютинаты эритроцитов задержались на поверхности геля;
• положительный (+++) - агглютинаты располагаются в верхней трети столбика геля;
• слабо-положительный (++) - агглютинаты фиксированы в верхних двух третях геля;
• очень слабо-положительный (+) - агглютинаты располагаются в нижней трети геля;
• отрицательный (-) - эритроциты формируют на дне микропробирки компактный осадок.
Размер частиц геля, специальный подбор монокло-нальных или поликлональных антител позволяет достичь наилучших результатов чувствительности и специфичности, а его прозрачность делает считывание результатов более надежным и позволяет интерпретировать самые сложные диагностические случаи.
Клиническая значимость. Принцип безопасности трансфузий эритросодержащих гемокомпонентов воз-
можно осуществлять за счёт выявления предшествующей сенсибилизации. Это достигается обязательным для всех реципиентов скринингом нерегулярных анти-эритроцитарных антител имеющее клиническое значение, способные вызывать in vivo разрушение эритроцитов, имеющих на мембране соответствующий антиген. Присутствие которых, вызывает возникновение пост-трансфузионной гемолитической реакции и осложнения, гемолитической болезни новорожденных или укорочение времени выживания перелитых эритроцитов. При отсутствии антител (отрицательный результат скрининга) эритросодержащие среды выбирают только с учётом группы крови по системе АВ0 и Rh(D) принадлежности. Положительный результат скрининга говорит об «опасном» реципиенте, которому трансфузии гемокомпонен-тов осуществляют только по индивидуальному подбору с обязательным исключением антигена, к которому выявлена сенсибилизация. В таких случаях целесообразно выполнять типирование эритроцитов реципиента по антигенам С,с,Е,е системы Rh, антигену К системы Kell и другим для точных рекомендаций по выбору гемоком-понентов для трансфузий. Это относится также к реципиентам, которым планируются многократные трансфузии гемокомпонентов (пациенты гематологических, онкологических стационаров, гемодиализа, реципиенты органов и тканей). Таким реципиентам индивидуальный подбор проводится не только с учётом выявления предшествующей сенсибилизации, но и с обязательным фенотипированием эритроцитов.
Для исследования вышеуказанных антигенов эритроцитов и антител к ним используются различные методы, наиболее чувствительным и специфичным из которых является гелевый тест.
Основные преимущества использования геле-вой технологии:
• Высокая чувствительность и специфичность тестов, что позволяет проводить диагностику слабых вариантов антигенов и антител (включая А2, А3; Du, DVI);
• Единственный метод выявления посттрансфузи-онных и посттрансплантационных «химер»;
• Объективизация, стандартизация и возможность фотодокументации результатов исследований для сохранения их в архиве или использования для учебных пособий;
• Автоматизации выполнения исследований и компьютерной обработки результатов;
• Удобство и простота в исследовании, повышение безопасности персонала: отсутствие этапов отмывания эритроцитов; исследование крови, заготовленной на консервантах и стабилизаторах без искажения результатов; сокращение времени на проведение полного иммуногематологического исследования в 2-5 раз; снижение риска заражения персонала инфекциями, передающимися через кровь;
• Возможность использования небольших количеств крови - актуально при использование в педиатрии - неона-
Определение резус-принадлежности (D, CDE)
тологии, когда получение достаточных количеств материала (необходимых для других методик) затруднено;
Оборудование и реактивы.
• Ю-карты для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител;
• Ю-центрифуга для центрифугирования карт;
• термостат на +37°С;
• штатив для пробирок и карт;
• пробирки вместимостью 5 и 10 мл;
• пипетки полуавтоматические одноканальные (10, 25, 50 мкл);
• перчатки резиновые хирургические;
• раствор для разведения 1 (раствор бромелина);
• раствор для разведения 2 (раствор низкой ионной силы - LISS, РНИС);
• 0,9% раствор хлорида натрия;
• стандартные типированные эритроциты человека для выявления антител и проведения перекрестной реакции.
Таблица 1.
Результаты исследования антигенов группы крови
Выявляемые антигены Заключение
А В АВ D CDE
+ + + + + АВ Rh+
+ + + - - АВ Rh-
+ - + + + А Rh+
+ - + - - А Rh-
- + + + + В Rh+
- + + - - В Rh-
- - - + + 0 Rh+
- - - - - 0 Rh-
Примечание: Специфичность исследования подтверждается по отрицательному результату в пробирке с контролем Ю-карты.
Таблица 2.
Группа крови Результаты исследования с сыворотками
анти-А анти-В анти-АВ
0 (1) - - -
А1 (II) ++++ - ++++
А2 (II) ++++ - ++++
А3 (II) ++/+++ - ++/++++
Ах (II)* -/++ - +/++
В (II) - ++++ ++++
В3 (III) - +/+++ +/+++
Вх (III)* - -/++ -/++
А1В (IV) ++++ ++++ ++++
А2В (IV) +++/++++ ++++ ++++
Примечание: * - определение очень слабых вариантов антигенов А и В требует дальнейших исследований.
Таблица 3.
Резус-принадлежность Результаты исследования с сыворотками
D-положительная ++++ ++++
D-отрицательная - -
D-отрицательная, С Е-положительная* -
Слабоположительная (Du) От ± до +++ от +++ до ++++
Примечание: * - Положительная реакция с сывороткой анти^Е при отрицательной реакции с сывороткой анти-D свидетельствует о наличии антигенов С, Е и требует дальнейшего типирования с использованием Ю-карт: С-с-Е-е-К-сИ или С-С«-с-Е-е-К
Ю-карточки
А-В-Лв-й-йСЕ- Контроль - для определения групп крови АВО^Н. Каждая микропробирка (1-5) содержит специфические моноклональнные антитела, 6 - контроль содержит нейтральный гель.
АВ°' АВ02 IBI АВОЗ 1АВ1 RH 1 IDI IWl СИ
L Bio-Rad 1 1 470401 J
Ю-карточки
А-В-й-Контроль-Нейтр-Нейтр - для определения групп крови АВО^Н перекрестным методом. Микропробирка 1 содержит анти - А, 2 - анти-В, 3 - Анти-О, 4 - контрольная, 5 и 6 -нейтральный гель.
ABOl lAI AB02 IBI RH1 I СИ IDI 1 Neutr. Neutr.
L Bio-Rad 1 470428 j
Ю-карточки
Кумбс + нейтральные - для скрининга антиэритроци-тарных антител (непрямая реакция Кумбса и ферментный тест).
Первые три микропробирки содержат гель с анти-глобулиновой сывороткой для проведения реакции Кумбса в растворе низкой ионной силы (РНИС). Последние три - нейтральный гель для выполнения солевой или ферментативной реакции с папаином
AHG | AHG | AHG Neutr. Neutr. Neutr.
I 1 1 1 1 1 Bio-Rad 470419
Ю-карточки
Кумбс анти - !дО, анти - !дО, C3d (АГС) - прямая реакция Кумбса. Микропробирки содержат гель с антигло-булиновой сывороткой для проведения реакции Кумбса в растворе низкой ионной силы (РНИС).
Выводы. Гелевый тест является простым, воспроизводимым, быстрым и очень чувствительным методом, позволяющим сразу выявлять слабые варианты антигенов эритроцитов. Тест оценивается только макроскопически. После короткого обучения персонала, выполнения теста, сводятся к минимуму затрат рабочего времени и ошибок, встречающиеся при традиционных методиках.
Гелевый тест позволяет стандартизировать лабораторные методики, дать объективную оценку результатов реакции гемагглютинации. Тесты позволяют перепроверять полученные данные, для контроля, так как могут быть фотокопированы для сохранения их в архиве. Для теста используется небольшое количество сыворотки или эритроцитов, что чрезвычайно важно для педиатрических клиник.
Использование гелевой системы позволяет снизить риск заражения персонала даже при работе с потенциально инфицированными образцами.
Отсутствие этапов отмывания эритроцитов при выполнении непрямого антиглобулинового теста позволяет более эффективно использовать рабочее время.
Литература:
1. Жибурт Е.Б. Трансфузиология. Издательский дом "Питер", - 2002. - 345с.
2. Минеева Н.В. Группы крови человека. Основы иммуногематологии. - Санкт-Петербург. - 2004.
3. БготНоу 1.М. Гелевая технология в серологии групп крови // Вестник службы крови России. - №1, январь - 1998. - С. 23-24.
4. Волкова О.Я. Применение гелевой технологии «Скангель» для иммуногематологических исследований крови доноров и реципиентов гемокомпонентов. Методические рекомендации. - Санкт-Петербург. - 2008. -65с.
Т^жырым
КАННЫН, ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯЛЬЩ ЗЕРТТЕУЛЕР1 YШIН ГЕЛД1К ТЕХНОЛОГИЯНЫ КОЛДАНУ
О.А. Искакова
АК «Республикалык жедел медициналык кемек корсету гылыми орталыгы», Астана к-
Макала канды иммуногематологиялык зерттеу Yшiн колданылатын гелдiк технология, гелдiк сынактама туралы мэлiметтердi жэне сэйкестендiру карталарыныц сипаттамасын ^сынады. М^нда гелдiк технологияныц клиникалык мацыздылыгы мен артыкшылыктары, сонымен катар бiркатар зерттеулердiн нэтижелерi карастырылган. Аталмыш ж^мыс трансфузиология, трансплантология, гематология, иммуногология салаларында иммуногематологиялык зерттеулермен айналысатын мамандарга арналады.
Негiзгi сездер: иммуногематология, гелдк технологиялар, гемагглютинацияны стандарттау.
Summary
GEL TECHNOLOGIES FOR THE IMMUNE HEMATOLOGICAL BLOOD TESTING
O.A. Iskakova
JSC «Republican Research Center for Emergency Care», Astana
The article elaborates on use of gel technologies at immunohematology blood studies, principles of gel tests, and characteristics of identification cards. Next, the article continues with describing clinical importance and advantages of gel technology, as well as presents a number of research results. This is a recommended reading for specialists practicing immunohematology studies in transfusiology, transplantology, hematology and immunology.
Key words: the immunohematology, gel technologies, gemagglyutination standartizing.
УДК 612.014.482.4-017.1
С.Е. Узбекова, Б.А. Жетписбаев, А.К. Мусайнова, Д.Е. Узбеков, Г.С. Шалгимбаева
Государственный медицинский университет города Семей
ВЛИЯНИЕ ИМУНОФАНА НА НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЕ ФАГОЦИТАРНОЕ ЗВЕНО ИММУНИТЕТА ОРГАНИЗМА, ОБЛУЧЕННОГО ФРАКЦИОНИРОВАННОЙ ДОЗОЙ В ОТДАЛЕННОМ ПЕРИОДЕ
Аннотация
В статье отражены результаты влияния имунофана на показатели фагоцитарного фактора иммунной системы у необлученных животных и в отдаленном периоде после после фракционированного гамма-облучения. В результате экспериментов были получены данные, что у интактных животных под влиянием имунофана фагоцитоз достоверно повышается с 36±2,4 до 42,6±1,5, а фагоцитарное число - в 1,6 раза. При этом имунофан в 3 раза повышает НСТ-тест. Под воздействием имунофана в отдаленном периоде после облучения происходит нормализация фагоцитарных факторов неспецифической резистентности организма.
Ключевые слова: фракционированное гамма-излучение, иммунная система, иммунопротекторы, отдаленные последствия облучения.
Реализация восстановительных процессов в организме облегчается при фракционированном облучении и при уменьшении мощности дозы, однако, во всех случаях восстановление не может быть абсолютным, некоторая доля повреждений может оставаться необратимой и участвовать в формировании отдаленных последствий. Поэтому поиск эффективных препаратов для профилактики отдаленных последствий радиационных поражений продолжает оставаться актуальной проблемой современной медицины.
Цель исследования
Целью нашего исследования явилась оценка влияния имунофана на фагоцитарное звено иммунитета интактного организма, а также в отдаленном периоде после фракционированного гамма-облучения.
Материалы и методы исследования. Животных подвергали в течение 3 недель облучению гамма лучами Со60 на радиотерапевтической установке «ЛУЧ-1», суммарная доза облучения составила 6 Гр. Контрольными для данной группы служили интактные животные (п=10). До и через 90 дней после облучения и проведенного курса имунофаном (в течение 10 дней по общепринятой схеме) у всех животных определяли показатели фагоцитарного фактора иммунной системы.
Полученные цифровые данные обрабатывались общепринятыми методами вариационной статистики по методике Е.В. Монцевичюте-Эрингене с вычислением критериев Стьюдента с оценкой степени достоверности различий между сравниваемыми группами. Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием программы Microsoft Excel 2000.
Результаты исследования и их обсуждение
Нами было исследовано влияние имунофана на неспецифическое фагоцитарное звено иммунной системы необлученных животных. Результаты представлены в таблице 1.
Из таблицы 1 видно, что у интактных животных под влиянием имунофана фагоцитоз достоверно повышается с 36±2,4 до 42,6±1,5, а фагоцитарное число - в 1,6 раза. При этом имунофан в 3 раза повышает НСТ-тест.
В дальнейшем нами изучалось влияние имунофана на неспецифическое фагоцитарное звено иммунной системы облученных фракционированной дозой животных в отдаленном периоде (таблица 2).
Из таблицы 2 мы видим, что под воздействием иму-нофана происходит достоверное снижение НСТ-теста до 2,4±0,2 (P<0,05), фагоцитоза до 24,8±3,9, а фагоцитарное число снижается до нормы.
