CC BY
251
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 616.15-097.34:577.21.08
СЛУЧАЙ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНА СИСТЕМЫ РЕЗУСА"" 15-ГО ТИПА
Головкина Л.Л., Стремоухова А.Г., Пушкина Т.Д., Оловникова Н.И.
ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, 125167, Москва
Резюме. Описан случай выявления редкого варианта антигена D системы Резус^^ 15-го типа у беременной женщины. Показано, что серологические методы определения резус-фактора не всегда позволяют идентифицировать истинную резус-принадлежность человека. Молекулярные методы исследования резус-принадлежности дают однозначный результат.
Ключевые слова: антиген D; слабый вариант антигена D; резус-принадлежность; резус-фактор; серологические тесты; молекулярный метод.
DETECTION OF TYPE 15 RH-DWEAK SYSTEM ANTIGEN
Golovkina L.L., Stremoukhova A.G., Pushkina T.D., Olovnikova N.I.
Hematological Research Center, 125167, Moscow, Russia
Summary. A rare variant of antigen D (type 15 Rh-Dweak system) was detected in a pregnant woman. Serological methods for detection of Rh factor do not always identify the actual Rh appurtenance of the individual. Molecular methods of Rh appurtenance identification give an unambiguous result.
Key words: antigen D; antigen D weak variant; Rh appurtenance; Rh factor; serological tests; molecular methods.
Высокая иммуногенная активность эритроци-тарного антигена D системы Резус определяет его важную клиническую значимость. В лабораториях иммуногематологии определение резус-принадлежности людей обычно выполняют серологическими методиками с применением моноклональных реагентов цоликлонов, содержащих полные или неполные антитела. Однако результаты серологических исследований не всегда можно трактовать однозначно вследствие существования многочисленных разновидностей антигена D, наличия как слабых его вариантов со сниженным количеством антигенных детерминант на эритроцитах, так и парциальных - с отсутствием части антигенных детерминант. Только молекулярные методы исследования позволяют однозначно определять генотип человека, в описываемом случае - генотип системы Резус. В научно-клинической лаборатории трансфузиологической иммуногематологии Гематологического научного центра (ГНЦ, Москва) впервые в практике отечественной трансфузиологической иммуногематоло-гии начали использовать метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для типирования генов, кодирующих синтез антигенов эритроцитарных систем прямо или опосредованно. Необходимость внедрения генотипи-рования обусловлена как проблемами определения групповой (в широком смысле слова) принадлежности больных с заболеваниями системы крови, так и тем, что в научно-клиническую лабораторию транс-фузиологической иммуногематологии ГНЦ часто обращаются граждане при неоднозначности определе-
Для корреспонденции:
Головкина Лариса Леонидовна, доктор медицинских наук, заведующая научно-клинической лабораторией трансфузиологической иммуногематологии ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России,
Адрес: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4а. Телефон: +7 (495) 614-92-71. E-mail: largol@mail.ru.
Corresponding author:
GolovkinaLarisa, MD, PhD, DSc (largol@mail.ru).
ния группы крови системы Резус в иных медицинских учреждениях Москвы. Частота подобных ситуаций составляет в среднем 1,5% от общего количества исследований определения резус-фенотипа, выполняемых в лаборатории, что соответствует частоте слабого варианта антигена D в популяции.
В научно-клиническую лабораторию трансфузиологической иммуногематологии ГНЦ обратилась пациентка Л. со сроком беременности 26 нед для уточнения резус-принадлежности. Со слов пациентки, по данным разных лабораторий Москвы у нее выявляли то положительный, то отрицательный резус-фактор.
Для исследования были взяты стандартные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты, эритроциты и ДНК из лейкоцитов периферической крови беременной пациентки Л.
Определение групповой принадлежности проводили по системам АВО и Резус в реакции агглютинации на плоскости цоликлонами соответствующей специфичности ^М-класса, определение антигена D - в реакции солевой агглютинации в планшетах с полными моноклональными антителами анти^ (Эритро-тест™-Цоликлон анти^ Супер) двух серий, непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба Кумбса) с неполными моноклональными антителами анти^ четырех серий (ЭритротестТМ-Цоликлон анти^) в пробирках и в геле ("BюRad", США). Активным компонентом реактива ЭритротестТМ-Цоликлон анти^ является смесь четырех моноклональных антител анти^, направленных к разным эпитопам антигена D (6.5, 6.3, 6.2). Для постановки непрямого антиглобули-нового теста применяли отдельные моноклональные антитела человека G7 и G47, принадлежащие к классу IgG1 и направленные к эпитопам 6.3 и 6.2 антигена D соответственно и входящие в состав ЭритротестаТМ-Цоликлон анти^ [1]. Антиглобулиновую сыворотку пяти серий применяли для выявления агглютинации после инкубации исследуемых эритроцитов и анти-D-антител. Все реактивы произведены фирмой ООО «Гематолог» (Москва).
Результаты серологических реакций и молекулярных методов определения антигена Э
у пациентки Л.
Реактив
Метод
исследуемые
Эритроциты
D- (контроль)
D+ (контроль)
Цоликлон анти-D Супер (IgM)
На плоскости В планшете
Отрицательные Отрицательные
Отрицательные Отрицательные
Положительные
Положительные, разведение 1:16 000
Анти-D (IgM) В геле Отрицательные Отрицательные 4+
Цоликлон В пробирке Отрицательные Отрицательные Положительные ко 2-й секунде
анти-D (IgG) В геле 2+ Отрицательные 4+
МА G7 В пробирке Отрицательные Отрицательные Положительные к 1-й секунде
(IgG1) В геле 3+ Отрицательные 4+
МА G47 В пробирке Отрицательные Отрицательные Положительные к 1-й секунде
(IgG1) В геле 3+ Отрицательные 4+
RH-TYPE ПЦР D+ D- D+
Weak ПЦР Dweak 15-го НД НД
D-TYPE типа
Примечание. не проводили).
МА - моноклональное антитело человека; НД - нет данных (исследования
Применяли метод ПЦР с праймерами для выявления обычных (RH-TYPE, LOT 1112RH) и слабых вариантов антигена D (Weak D-TYPE, LOT 1202 WD) производства фирмы "BAG" (Германия) по программе производителя. ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови на колонках фирмы "Protrans" (Германия) по инструкции производителя.
Определение групповой принадлежности по системам АВО и резус на плоскости показало наличие группы крови B(III) ccdEe. Антиген D не был выявлен в реакции солевой агглютинации, в гелевых картах с использованием полных анти^-антител, в непрямом антиглобулиновом тесте в пробирках при использовании цоликлона анти-D класса IgG. В непрямом антиглобулиновом тесте, выполненном в гелевых картах с тем же цоликлоном анти-D, идентифицирован положительный результат на 2+ (см. таблицу). Для повышения чувствительности метода применяли отдельные, наиболее активные в отношении выявления антигена Dweak моноклональ-ные антитела G7 и G47 IgGl-подкласса, входящие в состав цоликлона анти-D. При постановке реакции в пробирках с этими антителами получили отрицательный результат, при постановке антиглобулиновой пробы в гелевых картах реакция становилась положительной (3+). Генотипирование с праймерами RH-TYPE показало присутствие антигена D - ^DEe, с праймерами Weak D-TYPE - Dwe3k 15-го типа. Таким образом, генотип системы Резус пациентки Л. идентифицирован как cc Dwe3k 15-го типа Ee, т.е. молекулярный метод точно идентифицировал резус-принадлежность пациентки и вариант антигена D. Молекулярные методы определения антигенов эритроцитарных систем можно рекомендовать для разрешения неоднозначностей серологических методов исследования.
В настоящее время идентифицировано более 100 вариантов антигена D, часть которых представлена парциальными антигенами, а часть - слабыми вариантами. Слабый D-антиген, обозначаемый как Du или Dweak, был впервые описан F. Stratton [2] в 1946 г.
и отличается пониженной экспрессией нормального D-антигена на поверхности эритроцитов [3]. Антиген D представляет собой белковую молекулу, состоящую из 417 аминокислот, уложенных в 12 трансмембранных цепей с 6 экстрацеллюлярными петлями. Появление слабых вариантов антигена D может быть обусловлено аминокислотными заменами в трансмембранной или внутриклеточной частях белковой молекулы, возникающих вследствие нуклео-тидных замен в гене RHD. Различают 57 типов антигена Dweak Тип 15 слабого D-антигена возникает при замене одного нуклеотида G на A в позиции 845 экзона 6 гена RHD, что приводит к замене Cly на Asp в позиции 282 белковой молекулы трансмембранной части антигена [4].
Точное определение резус-принадлежности доноров и реципиентов имеет большое значение в трансфузиологии. Доноры с наличием антигена Dweak должны рассматриваться как резус-положительные, так как переливание их эритроцитов резус-отрицательным больным может спровоцировать образование анти^-антител. Тактика выбора донорских эритроцитов для переливания реципиентам с вариантами Dweak зависит от типа выявляемого антигена и его иммуногенности. Есть сообщения, что у реципиентов со слабыми вариантами антигена D, в частности с антигеном Dweak 15-го типа, вырабатывались анти^-антитела после трансфузий D-положительных эритроцитов [3]. Тактика выбора эритроцитов доноров реципиентам со слабыми или парциальными вариантами антигена D подробно описана в статье Н.И. Оловниковой [1].
Таким образом, для того чтобы обследуемая пациентка Л. была отнесена к резус-отрицательным лицам и получила донорские резус-отрицательные эритроциты при трансфузиях, моноклональный реагент для определения резус-принадлежности не должен выявлять антиген Dweak 15-го типа. Наоборот, реагент цоликлон для определения резус-принадлежности доноров обязан выявлять эту разновидность антигена D.
ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]
1. Оловникова Н.И., Митерев Г.Ю. Современная стратегия определения резус-принадлежности крови: проблема Du фенотипа в трансфузиологической и акушерской практике. Справочник заведующего КДЛ. 2010; 4: 5-16.
[Olovnikova N.I., Miterev G.Yu. Modern strategy for determining the Rh blood supplies: the problem Du phenotype transfusiological and obstetric practice. Spravochnik zaveduyushchego KDL. 2010; 4: 5-16]. (in Russian)
2. Stratton F.A. A new Rh allelomorphism. Nature. 1946; 158: 25-8.
3. Christiansen M., Samuelsen B., Morbjerg T., Bredahl C., Grunnet N. Correlation between serology and genetics of weak D types in Denmark. Transfusuion. 2008; 48(1): 187-93.
4. Wagner F.F., Gassner C., Muller T.H., Schonitzer D., Schunter F., Flegel W.A. Molecular basis of weak D phenotypes. Blood. 1999; 93(1): 385-93.
Поступила 09.04.14 Recweived 09.04.14
