CC BY
122
ПРИМЕНЕНИЕ ФУЛЛЕРЕНОВ В БИОАКТИВНЫХ РАНЕВЫХ
ПОКРЫТИЯХ
Д.Н. Макин (Санкт-Петербургский государственный университет информационных технологий, механики и оптики), Н.Г. Венгерович, М.А. Тюнин (Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова) Научные руководители - к.т.н., доцент М.В. Успенская (Санкт-Петербургский государственный университет информационных технологий, механики и оптики),
д. мед. н., профессор В.А. Попов (Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова)
Исследовано влияние фуллеренов С6о на течение раневого процесса и длительность заживления ран различной этиологии. Разработано и исследовано новое фуллерен-содержащее биоактивное раневое покрытие на основе акрилатного гидрогеля.
Введение
Раневые повреждения можно условно разделить на два вида: первичные и вторичные. Первичные повреждения возникают при механических, термических и других воздействиях. Наиболее тяжелые первичные повреждения наблюдаются при огнестрельных ранениях [1]. Вслед за первичным повреждением в тканях, окружающих рану, возникают реакции воспаления, что проявляется выбросом из клеток ферментов, в том числе протеолитических, накоплением в тканях активных форм кислорода, свободных кислородных радикалов, активацией процессов перекисного окисления липидов и ослаблением антиоксидантной защиты, появлением в зоне повреждения недоокислен-ных продуктов и возникновением вначале местного, а затем и общего ацидоза. Избыточное образование агрессивных продуктов является одной из причин распространения зоны вторичного повреждения тканей, увеличения очага воспаления и осложненного течения раневого процесса. При этом необходимо заметить, что выбор средств, противодействующих вторичному повреждению тканей, таких как сорбенты, антиферментные и антиоксидантные препараты, предельно ограничен.
Использование современных нанотехнологий может существенно изменить подход к лечению ран различной природы. Известно, что производные фуллерена С60 являются нетоксичными соединениями и проявляют антиоксидантную, мембранотроп-ную, иммунотропную, противовирусную, фотодинамическую активность [2], способны индуцировать дифференцировку фибробластов [3], инактивировать протеолитические ферменты [4]. Парентеральное введение комплекса С60/поли-Ы-винилпирролидон (С60/ПВП) не оказывает на организм экспериментальных животных острой токсичности, причем фуллерен С60 в составе комплекса значительно снижает негативные проявления ПВП [5]. Целью данных исследований было определение эффективности местного применения фуллеренов при раневом процессе, а также разработка биоактивного фуллерен-содержащего раневого покрытия.
Материалы и методы исследования
Антиоксидантные свойства водного раствора комплекса фуллерена С60/ПВП исследовали путем определения антирадикальной активности с использованием 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (ДФНГ) [2] и супероксидпродуцирующей активности макрофагов (Мф) методом биохемилюминесценции (БХЛ) [4].
Используя методику с ДФНГ, исследованы водные растворы комплекса С60/ПВП с 0,01%, 0,02% и 0,03% содержанием фуллерена. С помощью метода БХЛ оценивали влияние водных растворов комплекса С60/ПВП и ПВП, каждый в концентрации 1,5%, 3%, 6,5%, 12,5% и 25%, на супероксидпроцуцирующую активность альвеолярных и пе-
ритонеальных макрофагов. Для растворов, содержащих комплекс Сбо/ПВП, это соответствовало 0,0075%, 0,015%, 0,03%, 0,06 и 0,125% содержанию фуллерена. Биохеми-люминесценцию регистрировали на приборе «Хемилюм-1» (Россия) с кюветой, термо-статируемой при 37 ± 0,5°С. После предварительного прогрева хемилюминометра при 37°С в течение 1 часа в измерительную пластиковую одноразовую кювету вносили 0,2 мл суспензии макрофагов, содержащей 1*107 клеток, 0,1 мл раствора люцигенина (100 мкМ/л) и 0,1 мл физиологического раствора с соответствующими дозами тестируемых препаратов (в контроле - 0,1 мл физиологического раствора). Время инкубации составляло 10 мин. Уровень спонтанной БХЛ измеряли в течение 5 мин при постоянном перемешивании. После графической регистрации результатов на компьютере с помощью оригинальной программы вычисляли интенсивность БХЛ (интегральный показатель) и по высоте пика полученных кривых БХЛ отмечали величину максимума интенсивности свечения. Показатели спонтанной БХЛ в контрольной группе (Мф + физиологический раствор) принимали за 100%, а показатели БХЛ, полученные в опытных группах (Мф + препарат), рассчитывали в процентах от контроля.
Для лечения ран различной этиологии нами было разработано трехслойное гидро-гелевое биоактивное фуллерен-содержащее раневое покрытие. В качестве верхнего слоя использовали абсорбент - акрилатный гидрогель с нейтральным рН и абсорбционной емкостью по физиологическому раствору 40 г/г ± 10%, полученный на основе акриловой кислоты и акриламида [7], нанесенный на пористую хлопчатобумажную основу (средний слой), выполняющую каркасную функцию, и нижний, прилежащий к ране желатиновый слой, включающий биоактивные ингредиенты разнонаправленного действия (диоксидин, 8-аминокапроновая кислота, мочевина), и иммобилизованный в его составе комплекс С60/ПВП с 0,1% содержанием фуллерена (рис. 1).
Рис. 1. Гидрогелевое биоактивное раневое покрытие
Исследование эффективности местного применения гидрогелевого биоактивного раневого покрытия проведено на модели глубоких ожогов (20 крыс линии Вистар весом 180-200 г.). На спине крыс под эфирным наркозом с помощью специального устройства моделировали два ожога площадью 1 см2 каждый. В качестве обжигающей поверхности использовали медную пластину размером 1,0 *1,0 см с температурой нагрева 180°С. Ожог наносили контактным способом в течение 10 секунд. Через сутки под эфирным наркозом выполняли некрэктомию ожогового струпа, обработку ран проводили 3% раствором перекиси водорода. Одну рану накрывали гидрогелевым покрыти-
ем (опыт) с 0,1% содержанием в нем фуллерена и биологически активных компонентов (антимикробный, антиферментный, гемостатический и протеолитический препараты), другую - желатиновой губкой без включения фуллерена Сб0, но имеющей в своем составе отмеченные выше биологически активные препараты в аналогичных концентрациях (контроль). Критериями эффективности местного применения Сбо служили скорость (сроки) заживления и гистоморфологическая картина ран на 7, 10, 14, и 20 сутки.
Скорость заживления ран оценивали планиметрическим методом. При контрольных измерениях на рану накладывали стерильную пластинку целлофана и на нее наносили контуры раны. Рисунок переносили на миллиметровую бумагу и подсчитывали площадь раны. Уменьшение площади раневой поверхности в процентном отношении к начальным размерам раны определяли по формуле (Б = (Б - 8п)х100/8), где Бп -величина площади раны при данном измерении, Б - начальная площадь раны.
Для гистоморфологического исследования материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в спиртах, заключали в парафин, серийные срезы окрашивали по Ван-Гизону азур 11-эозином (для определения степени дифференциров-ки соединительной ткани) и оссеином. Препараты изучали методом световой микроскопии. Описание гистоморфологической картины области раневого дефекта проводили в различных топографических зонах, как по горизонтали, так и по вертикали.
Все количественные показатели, полученные в результате исследований, обработаны по методу Фишера и Стьюдента и были статистически достоверными.
Результаты и их обсуждение
Анализ результатов исследования антиоксидантных свойств комплекса Сб0/ПВП с использованием 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (ДФНГ), представленных в табл. 1, показал, что комплекс Сб0/ПВП обладает антирадикальной активностью, которая возрастает пропорционально увеличению его концентрации в растворе.
Концентрация растворов, % Комплекс фуллерен Сб0/ПВП Контроль (ПВП)
0,01% 0,02% 0,03%
Антиоксидантная активность, ммоль/л 1,35 ± 0.04 1,46±0.07 1,84±0.03 0,91±0.05
Таблица 1. Антиоксидантная активность комплекса фуллерена С6о/ПВП
Перитонеальные макрофаги Альвеолярные макрофаги
Концентрация растворов ПВП С60/ПВП ПВП С60/ПВП
1,5% 185,61±0.70 173,72±1,20 117,34±0.90 112,15±2,10
3% 247,79±0.50 76,38±0.80 256,85±1,10 1бб,48±0.80
6,5% 510,2±1,10 213,87±1,70 238,74±0.70 187,37±1,20
12,5% 306,27±0.70 120,15±0.60 173,88±0.90 188,93±0.60
25% 6,41±0.50 9,89±0.20 0,07±0.10 1,85±0.20
Таблица 2. Влияние комплекса С60/ПВП на супероксидпродуцирующую активность тканевых макрофагов (% от контроля)
При изучении влияния комплекса С60/ПВП на супероксидпродуцирующую активность тканевых макрофагов установлено, что фуллерен в составе комплекса проявляет выраженные антиоксидантные свойства в растворах с концентрацией от 0,03% до 0,06 %. Показатели активности при использовании комплекса С60/ПВП в других опытных группах были сравнимы с данными активности растворов с соответствующим содержанием ПВП и приведены в табл. 2.
Под влиянием местного применения на гранулирующих ранах после глубоких ожогов гидрогелевого биоактивного раневого покрытия с 0,1% содержанием фуллерена С60 процент уменьшения площади раневого дефекта к исходной в опытной группе на 7 сутки был равен 65,4% (рис. 2), на 10 сутки - 96,5% (рис. 3), а срок полного заживления ран составил 12 суток. В контрольной серии эти показатели были следующими: на 7 сутки - 36,3%, на 10 сутки - 65,1%, на 14 сутки - 73,8% (рис. 4), срок полного заживления ран составил 20 суток.
Рис. 2. Раневой дефект при применении покрытия с комплексом С6о/ПВП: 7-е сутки
Рис. 3. Раневой дефект при применении покрытия с комплексом С60/ПВП: 10-е сутки
По данным гистоморфологических исследований, в ранах опытной серии на 7 сутки после некрэктомии наблюдали очищение ран от нежизнеспособных тканей, осуще-
ствляемое, главным образом, макрофагами, формирование хорошо васкуляризирован-ной грануляционной ткани и эпителизацию в приграничной зоне, где начиналось подрастание эпителиального клина под струп между фибриноидом и вновь образованной грануляционной тканью. В контрольной группе гистоморфологическая картина на 7 сутки свидетельствовала о более выраженной воспалительной реакции, при этом, как и в опытной группе, происходило очищение раны от нежизнеспособных тканей, однако процессы формирования грануляционной ткани и эпителизации протекали значительно медленнее.
На 10 сутки в опытной группе эпителизация была еще не завершена, эпителий не покрывал дефект полностью, а только наползал с краев в виде эпителиального клина, в грануляционной ткани наблюдалось формирование крупнопетлистой капиллярной сети с преобладанием вертикальных петель, дифференцировка фибробластов, фиброгенез коллагена с превращением, в отличие от контроля, аргирофильных волокон в фуксино-фильные, что свидетельствует о более зрелом характере грануляционной ткани.
Рис. 4. Раневой дефект контрольной группы: 14-е сутки
На 14 сутки в контрольной группе гистоморфологическая картина соответствовала стадии пролиферации и созревания грануляционной ткани, а эпителий покрывал только края раны.
Анализ течения раневого процесса при местном лечении глубоких ожогов фулле-рен-содержащим раневым покрытием с 0,1% содержанием фуллерена показал, что при его использовании наблюдается интенсификация репаративных процессов, более раннее завершение воспалительного процесса, увеличение скорости эпителизации и уменьшение сроков заживления ран по сравнению с контролем.
Установлено, что под действием гидрогелевого биоактивного раневого покрытия заживление гранулирующих ран после глубоких ожогов происходит не менее чем в 1,5 раза быстрее (срок полного заживления составил 12-14 суток, а в контроле - 20 суток, т. е. на 8 суток дольше). Под действием раневого покрытия, содержащего С60 вместе с другими биологически активными ингредиентами, а в качестве абсорбента - гидрогель на основе акриламида и акриловой кислоты (с рН 7,0-7,5), наблюдали более раннее завершение воспалительного процесса, отчетливую стимуляцию роста грануляционной ткани и усиление процессов краевой эпителизации.
Усиление репаративных процессов под действием комплекса фуллерена Сб0/ПВП, с нашей точки зрения, связано с антиоксидантной активностью препарата, которая пре-
дотвращает повреждение клеток и тканей продуктами вторичной альтерации. При этом происходит интенсификация общего хода раневого процесса, что подтверждается данными морфологического исследования и проявляется усилением пролиферации фибробластов, активацией синтеза коллагена и фибриллогенеза, образования и созревания грануляционной ткани, более быстрым рубцеванием и эпителизацией раны.
Заключение
В ходе исследований выявлена антирадикальная и антиоксидантная активность фуллеренов и отсутствие их общей и местной токсичности.
Установлено, что местное применение биологически активного фуллерен-содержащего раневого покрытия предупреждает осложненное течение раневого процесса, на 20-25% сокращает длительность заживления ран и может быть рекомендовано для лечения ран, возникающих при механической травме и, в том числе, при огнестрельных ранениях, для лечения гнойно-некротических процессов, гранулирующих ран при глубоких ожогах, трофических язв и пролежней.
Существенное сокращение длительности лечения наиболее распространенных патологических процессов и применение патогенетически обоснованных комбинированных средств местного лечения, изготовленных на основе отечественного сырья и малых доз фуллеренов, должно сопровождаться значительным экономическим эффектом.
Литература
1. Попов В.А. Физиологические основы военно-полевой и неотложной хирургии. -СПб: ЭЛБИ-СПб, 2003. - С. 304.
2. Jensen A.W., Wilson S.R., Schuster D.I. Biological applications of fullerenes // Bioorg. Med. Chem. - 1996. - Vol. 4. - P.767-779.
3. Piotrovsky L.B., Dumpis M.A., Poznyakova L.N., Kiselev O.I., Kozeletskaya K.N., Erop-kin M.Yu., Monaenkov A.O. Study of the biological activity of the adducts of fullerenes with poly(N-vinylpyrrolidine) // Mol.Mat. - 2000. - Vol.13. - P. 41-50.
4. Попов В.А., Тюнин М.А., Зайцева О.Б. и др. Морфологические изменения в тканях внутренних органов при внутрибрюшинном введении комплекса С60 с поливинил-пирролидон// Сб. науч. тр. Рос. школы-конференции молодых ученых и преподавателей «Биосовместимые наноструктурные материалы и покрытия медицинского назначения».- Белгород, 2006. - С.376-380.
5. Попов В.А., Тюнин М.А., Зайцева О.Б. и др. Активность мембранных ферментов в пищеварительных и непищеварительных органах при внутрибрюшинном введении комплекса С60 с поливинилпирролидоном // Сб. науч. тр. Рос. школы-конференции молодых ученых и преподавателей «Биосовместимые наноструктурные материалы и покрытия медицинского назначения».- Белгород, 2006. - С.381-385.
6. Glavind J. Antioxidants in animal tissue // Acta Chem. Scand. - 1963. - Vol. 17. - № 13. - P.1635-1640.
7. Andreopoulos A.G. Preparation and Swelling of Polymeric Hydrogels // J. Appl. Polym. Sci. - 1989. - Vol. 37. - №.8. - P. 2121-2129.
