CC BY
8
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на ам-плификаторе LightCycler 480 Real-Time PCR («Roche», Швейцария). Статистический анализ проводили с использованием IBM SPSS Statistics 20.
При добавлении гепарина в исследуемых концентрациях (0,5, 0,75 и 1 МЕ/мл) в культуру ММСК доля CD90+, CD105+ и CD73+ клеток статистически значимо не изменялась относительно контроля. В модели культивировании ММСК с гепарином в концентрации 1 МЕ/мл экспрессия мРНК гена щелочной фосфа-тазы (ALPL) увеличилась в 26 раз (относительно контроля), что свидетельствует о дифференцировке ММСК в остеобласты. Экспрессия гена ALPL относится к ранним стадиям остеодифференцировки и необходима для минерализации межклеточного матрикса. Экспрессия мРНК генов RUNX2, BMP2 и BMP6 не изменялась между исследуемыми группами. Однако наблюдалась тенденция к увеличению экспрессии мРНК генов (RUNX2, BMP2 и BMP6) при добавлении гепарина в концентрации 1 МЕ/мл.
Таким образом, выявленное повышение экспрессии мРНК генов остеодифференцировки (ALPL, RUNX2, BMP2, BMP6) в присутствии гепарина в терапевтических концентрациях (в сравнении с контролем) может свидетельствовать об участии гепарина (1 МЕ/мл) в инициации остеодифференцировки ММСК в условиях сокультивиро-вания in vitro. Авторы выражают благодарность за финансовую поддержку Программы стратегического академического лидерства ПРИОРИТЕТ 2030 в СибГМУ.
СОЗДАНИЕ ЖИВОТНОЙ МОДЕЛИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ Т-КАДГЕРИН ОПОСРЕДОВАННОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ
И.Д. Ожималов, М.Н. Балацкая,
В.С. Попов, И.Б. Бродский, Е.В. Семина,
М.А. Кулебякина, В.Ю. Сысоева,
А.В. Балацкий, К.А. Рубина, Н.И. Калинина
Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: i.ozhimalov@gmail.com
Ключевые слова: Т-кадгерин, адипонектин, регенерация, экзосомы.
Адипонектин — гормон жировой ткани, являющийся одним из важнейших регуляторов регенерации тканей. Его влияние на регенерацию скелетных мышц [1], анги-огенез и предотвращение поражения кровеносных сосудов и сердца опосредовано его взаимодействием с мембранным рецептором Т-кадгерином [2, 3]. В частности, связывание адипонектина с Т-кадгерином вызывает повышение продукции внеклеточных везикул, которые необходимы для реализации влияния адипонектина на регенерацию тканей [4].
Для исследования процессов регенерации, опосредованных Т-кадгерином, нами была выведена линия нокаутных мышей путем скрещивания отбей с флокси-рованным 3 экзоном гена Т-кадгерина (Cdh13) и особей с конститутивно активной Cre-рекомбиназой. С помощью метода ПЦР мы продемонстрировали отсутствие 3 экзона как в ДНК, так и мРНК белка Т-кадгерина в образцах нокаутных мышей. Мы также проанализировали содержание Т-кадгерина в образцах аорт, сердец и скелетных мышц с помощью иммуноблоттинга. Отсутствие Т-кадгерина также было подтверждено с помощью про-теомного анализа образцов скелетных мышц.
Мы показали, что масса тела, давление крови и другие параметры значимо не отличались у нокаутных мышей по сравнению с мышами линии C57Bl, которые экспрессируют ген Т-кадгерина. Поскольку взаимодействие адипонектина с Т-кадгерином влияет на регенерацию скелетных мышц, мы сопоставили способность к бегу на беговой дорожке нокаутных и контрольных мышей. Вопреки нашему предположению, мыши, но-каутные по Т-кадгерину, уставали медленнее и пробегали значимо более длинную дистанцию по сравнению с мышами контрольной линии. Мы проанализировали молекулярные механизмы таких различий. В частности, мы оценили уровень фосфорилирования АМФ-киназы, а также продукцию внеклеточных везикул у но-каутных мышей и животных контрольной линии. Таким образом, полученная нами линия мышей нокаутных по Т-кадгерину открывает возможности для проведения исследований участия этого белка в регенерации тканей. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ № 19-29-04118.
Литература:
1. Tanaka Y., Kita S., Nishizawa H. et al. Sci. Rep. 2019. V.9. P.16.
2. Denzel M.S., Scimia M.-C., Zumstein P.M. et al. J. Clin. Invest. 2010. V. 120. P. 4342-4352
3. Parker-Duffen J.L., Nakamura K., Silver M. et al. J. Biol. Chem. 2013. V. 288. P. 24886-24897
4. Obata Y., Kita S., Koyama Y. et al. JCI insight. 2018. V. 3. № . 8.
ПРИМЕНЕНИЕ ДИОПСИДА В КАЧЕСТВЕ
НОСИТЕЛЯ РЕКОМБИНАНТНОГО BMP-
2 В СОСТАВЕ ГИБРИДНЫХ ИМПЛАНТАТОВ
НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ
ИНЖЕНЕРИИ КОСТНОЙ ТКАНИ
П.А. Орлова1, А.В. Жулина1, М.С. Кривозубов1,
А.В. Громов1, А.С. Карягина1, 2 3
1 НИЦ эпидемиологии и микробиологии
им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, Москва, Россия
2 НИИ физико-химической биологии
им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
3 ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии, Москва, Россия
e-mail: p.orlova88@gmail.com
Ключевые слова: силикатная керамика, диопсид, BMP-2.
Эффективным решением проблемы замещения костных дефектов может быть разработка остеоиндуктивных гибридных имплантатов на основе силикатной керамики с адсорбированным на ней рекомбинантным белком BMP-2. Различные варианты силикатной керамики обладают высокой биоактивностью, биосовместимостью, хорошими механическими свойствами, способствуют остеогенной дифференцировке мезенхимальных стро-мальных стволовых клеток и, согласно результатам наших исследований, обладают высокой сорбционной емкостью по отношению к BMP-2.
Эффективнсть применения имплантатов на основе силикатной керамики была исследована на трех моделях: 1) при введении суспензии содержащих и не содержащих BMP-2 частиц диопсида (CaMgSi2O6) и волластонита (CaSiO3) в гиалуроновой кислоте под надкостницу черепа мыши; 2) при имплантации суспензии частиц диопсида с/без BMP-2, введенной в диски
из ксеногенного ДКМ, в краниальные дефекты критического размера у мышей; 3) при имплантации суспензии частиц диопсида с/без ВМР-2, введенной в диски из ДКМ, в бедренную мышцу мыши. Мезопористые частицы диопсида и волластонита были получены в НИТУ «МИСиС». Особенности минерализации и регенерации тканей в области имплантации исследовали с помощью микро-КТ и гистологического анализа.
В эксперименте 1 на протяжении 6 недель наблюдалась выраженная динамика минерализации тканей и остеогенеза в случае диопсида, содержащего ВМР-2. Волластонит, необратимо связывающий ВМР-2, вызывал сильную воспалительную реакцию, сопровождавшуюся агрегацией микрочастиц на фоне слабо выраженного формирования костной ткани. В эксперименте 2 при введении диопсида с ВМР-2 на сроке 6 недель после имплантации наблюдалось практически полное замещение костных дефектов новой костной тканью, содержащей костный мозг, при слабо выраженной реакции на инородное тело. В эксперименте 3 на сроке 12 недель наблюдалось ремоделирование костной ткани внутри имплантата и образование вокруг него покрытой надкостницей костной капсулы с трабекулами новообразованной костной ткани и костным мозгом.
Диопсид может успешно применяться в качестве носителя ВМР-2 в составе гибридных имплантатов для инженерии костной ткани. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ 22-15-00216.
ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГЕНЕРАТИВНЫХ СВОЙСТВ НОВЫХ ВАРИАНТОВ РЕКОМБИНАНТНОГО EPO И BMP-2 В СОСТАВЕ КОНСТРУКЦИЙ НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
П.А. Орлова
НИЦ эпидемиологии и микробиологии
им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: p.orlova88@gmail.com
Ключевые слова: эритропоэтин, BMP-2, полиэфирэфирке-тон, сверхвысокомолекулярный полиэтилен.
Применение кроветворного белка эритропоэтина (EPO) совместно с костным морфогенетическим белом-2 (BMP-2) в составе костнопластических материалов представляет значительный интерес благодаря тому, что они способствуют росту костной ткани по независимым молекулярным механизмам.
Целью данной работы было исследование остеоин-дуктивного потенциала композитных конструкций на основе новых вариантов BMP-2 и EPO, полученных раннее методом микробиологического синтеза [1, 2], в составе природных и синтетических материалов.
Был проведен ряд экспериментов по введению им-плантатов на основе рекомбинантных белков в составе различных носителей в краниальные дефекты критического размера на мышах. В качестве природных носителей были использованы диски диаметром 4 мм из деминерализованного костного матрикса (ДКМ). В качестве синтетических носителей, полученных сотрудниками МИСиС, были использованы диски из полиэфирэфирке-тона (ПЭЭК), диски из ПЭЭК с добавлением гидроксилапа-тита (ГАП), а также диски из сверхвысокомолекулярного полиэтилена с ГАП (СВМПЭ/ГАП). Динамику образования минерализованной костной ткани в области дефекта
оценивали с помощью микрокомпьютерной томографии. Исследование регенератов проводилось с помощью гистологического анализа и иммуногистохимического анализа на М2-макрофаги.
Минерализованная ткань наблюдалась в области дефекта уже на 3-й неделе после имплантации во всех группах, в состав которых входил BMP-2 Совместное применение BMP-2 и EPO способствовало усилению ан-гиогенеза новообразованной костной ткани. На 6-й неделе формировалось значительное количество новообразованной минерализованной костной ткани с включениями зрелого костного мозга. Максимальная поляризация М2-макрофагов наблюдалась в случае применения материалов на основе ДКМ.
Комбинация новых вариантов BMP-2 и EPO существенно повышает остеоиндуктивные свойства широкого спектра остеопластических материалов, перспективных для применения в регенеративной медицине.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РНФ 16-15-00133 и 22-15-00216.
Литература:
1. Karyagina A.S. et al. Biochemistry (Moscow) 82 (2017) 613-624.
2. Karyagina A.S. et al. Biochemistry (Moscow) 84 (2019) 20-32.
АУГМЕНТАЦИЯ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ АЛЛОГЕННЫХ ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ
Н.В. Орлова1, А.Н. Муравьев1' 4, А.А. Горелова1' 3, А.Н. Ремезова1, Т.И. Виноградова1, Н.М. Юдинцева2, Ю.А. Нащекина2, Н.В. Заболотных1, А.А. Лебедев1, П.К. Яблонский1, 3
1 Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия
2 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
3 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
4 Частное образовательное учреждение высшего образования Санкт-Петербургский медико-социальный институт, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: nadinbat@gmail.com
Ключевые слова: тканеинженерная конструкция, мезен-химные стволовые клетки, малый мочевой пузырь, биоде-градируемые полимеры, поли-1_,1_-лактид.
До сих пор остаются нерешенными проблемы, связанные с реконструкцией мочевого пузыря [1]. Замещение фрагментами желудочно-кишечного тракта, хоть и является золотым стандартом, почти всегда приводит к различным осложнениям. Применение в урологии методов регенеративной медицины и тканевой инженерии может способствовать улучшению результатов лечения многих патологических состояний [2]. На базе ФГБУ СПбНИИФ впервые в мировой практике выполнено успешное замещение дефекта мочевого пузыря кролика после его парциальной резекции с использованием тканеинженерного лоскута, содержащего аллогенные мезенхимные стволовые клетки [3].
Цель: экспериментальное изучение возможности применения аллогенного тканеинженерного трансплантата для замещения дефекта стенки мочевого пузыря.
Материалы и методы: 15 кроликам после парциальной резекции мочевого пузыря выполнилась
