CC BY
7
САМООРГАНИЗАЦИЯ ПУТЕМ МЕЗЕНХИМАЛЬНОЙ КОНДЕНСАЦИИ В КЛЕТОЧНЫХ ПЛАСТАХ ОПРЕДЕЛЯЕТ ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНУЮ СУДЬБУ МСК
П.П. Нимирицкий, Е.С. Новоселецкая, Р.Ю. Еремичев, Н.А. Александрушкина, Н.А. Басалова, П.И. Макаревич
Институт Регенеративной Медицины, Медицинский научно-образовательный центр, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: самоорганизация, стромальные клетки, мезенхимальная конденсация, МСК, остеогенез.
Важнейшей целью регенеративной медицины является восстановление микроархитектуры тканей как структурированных в пространстве клеточных сообществ. Формирование структуры тканей в онтогенезе задействует естественные механизмы самоорганизации клеток при их локальных взаимодействиях [1]. Для клеток мезенхимного ряда характерна самоорганизация путем конденсации, имеющая ключевое значение при органогенезе многих органов (кости, почки, зубы, мышцы и т. д.). Конденсация клеток опосредована их дифференциальной межклеточной адгезией, специфической миграцией, перестройками цитоскелета. Механизмы и роль спонтанной (без экзогенных воздействий) самоорганизации мультипотентных стромальных клеток (МСК) были исследованы в модели клеточных пластов (КП) [2].
Было показано, что самоорганизация приводит к формированию неоднородной в пространстве плотности клеточного состава, обеспечивает структурированное распределение клеток с разными свойствами, особенностями профиля транскрипции, метаболическими характеристиками. Более того, конденсация МСК при самоорганизации определяет их превалирующий тип дифференцировки. Было обнаружено, что конденсация МСК повышала эффективность их дифференциров-ки в остеогенном и хондрогенном, но не адипогенном направлениях. С использованием метода лазерной микродиссекции были препаративно выделены клетки, различные по степени вовлеченности в процесс конденсации. Далее, с помощью секвенирования РНК были установлены последствия конденсации на паттерн экспрессии генов, что позволило изучить эффекты компактизации и предположить её механизмы. Анализ показал, что клетки после конденсации имеют черты дифференцировки в остеогенном направлении: локальная активность щелочной фосфатазы, обогащенный коллагеном 1 типа внеклеточный матрикс, характерные черты метаболизма и др. Транскрипционные сдвиги при конденсации также включали активацию участников сигнального пути ГТФаз Rho, и подавление активности транскрипционного фактора SREBP — ключевого для адипогенеза. С использованием ингиби-торного анализа было показано, что самоорганизация МСК в КП протекает путем Rho-зависимой конденсации, и активность сигнального пути Rho определяет формирование в изначально гомогенном конструкте пространственной гетерогенности клеток. Конденсация МСК в клеточных пластах может рассматриваться как модель самоорганизации клеток при восстановлении микроархитектуры тканей и органов после повреждения. Работа была выполнена в рамках государственного задания МГУ им. М.В. Ломоносова и по перспективному направлению научно-образовательного развития
Московского университета «Молекулярные технологии живых систем и синтетическая биология»
Литература:
1. Nimiritsky P.P. et al. International journal of molecular sciences. - 2019. - Т. 20. - № . 4. - С. 823.
2. Nimiritsky P. et al. Biomedicines. - 2021. - Т. 9. - № . 9. - С. 1192.
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ КРИОХРАНЕНИЯ
НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ КЛЕТОК
КОЖИ И ДИНАМИКУ ПОПУЛЯЦИИ
ЭПИДЕРМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
Ю.А. Новикова1, О.С. Роговая2, А.Н. Попова2,
А.Д. Финошин2, Е.А. Воротеляк2
1 Российский Химико-Технологический Университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия
2 Институт биологии развития им. НК. Кольцова РАН, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: кератиноциты, криохранение, эпидер-
мальные стволовые клетки, апоптоз.
Криохранение кератиноцитов человека позволяет планировать научные эксперименты и операции по трансплантации тканеинженерных конструкций на основе кератиноцитов, а также является важным этапом в сохранении и пополнении клеточных банков. Замораживание кератиноцитов в суспензии стимулирует процессы апоптоза и терминальной дифференцировки, что приводит к массивной потере пула стволовых и про-гениторных кератиноцитов и ограничивает возможность их использования после размораживания.
Цель нашей работы: исследовать структуру и динамику гибели кератиноцитов и проследить восстановление популяции эпидермальных стволовых клеток после криоконсервации.
Кератиноциты замораживали по разработанному ранее протоколу замораживания суспензии кератиноцитов на базе Коллекции клеточных культур ИБР РАН и размораживали по истечению как минимум 2 недель нахождения в условиях глубокой заморозки.
Методом проточной цитометрии проводили анализ на определение количества апоптотических клеток до и после криохранения. Выяснили, что до криохранения количество клеток в позднем апоптозе составляет около 20%, сразу после размораживания увеличивается до 42%, а к 7 суткам снижается до 27%.
Иммунофлуоресцентным методом выявили доли про-лиферирующих клеток с помощью антител к ki67 и доли стволовых и ранних прогениторных клеток с помощью антител к p63 в динамике роста первичной культуры и культуры после криохранения. Максимальную долю ш7-положительных клеток наблюдали на 3 сутки после посева на пластик (73% до криохранения и 81% после криохранения), к 7 суткам пролиферация снижалась в обоих случаях (35% и 45%). Доля р63-положительных клеток увеличивалась к 3 суткам культивирования (89% и 82%) и оставалась высокой к 7 суткам (8б% и 84%).
Методом Вестерн-Блот анализа исследовали уровень экспрессии сигнального белка phospho-YAP и р4-интегрина, специфического для стволовых клеток. Уровень ITG р4 значительно снижался в клетках сразу после разморозки, оставался низким на 1 сутки культивирования после размораживания, но восстанавливался
к 7 суткам. Уровень экспрессии Р-УДР до криокон-сервации, сразу после размораживания, на 1 и 7 сутки культивирования после криоконсервации менялся незначительно.
Таким образом, мы можем сделать вывод, что пул стволовых клеток в популяции эпидермальных кератино-цитов после криохранения заметно снижается, но полностью восстанавливается к 7 суткам культивирования после размораживания.
МАТРИКСЫ ИЗ РЕКОМБИНАНТНЫХ СПИДРОИНОВ ПОДДЕРЖИВАЮТ РОСТ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ НЕЙРОНОВ И ГЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
Е.В. Новосадова1, И.А. Гривенников1, Д.М. Шимченко1, С.А. Антонов1, Т.П. Герасимова1, Л.В. Новосадова1, Е.Л. Арсеньева1, Л.И. Давыдова2, К.В. Сидорук2, В.Г. Богуш2, В.З. Тарантул1
1 Институт молекулярной генетики НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
2 НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: рекомбинантные спидроины, матриксы, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, направленная дифференцировка, нейроны.
Разработка новых биоматериалов и усовершенствование современных методов биоинженерии дали возможность культивировать клетки на 3D подложках-носителях естественного или искусственного происхождения. Выбор матриксов — первый этап для формирования подобного рода систем. Матриксы должны соответствовать определенным требованиям: отсутствие цитотоксичности, хорошая адгезионность, обеспечение, либо препятствие дифференцировки клеток, отсутствие иммунного ответа, биорезорбируемость. Нейрогенез происходит в динамически меняющейся микросреде, где межклеточные взаимодействия и локальные сигналы, в том числе от соседних клеток, гуморальные факторы и внеклеточный матрикс регулируют дифференцировку и гомеостаз клеток [1]. От того, насколько точно и правильно удастся воссоздать этот сложный массив разнообразных сигналов, будет зависеть пространственная организация клеток, правильное формирование контактов и зрелость получаемых культур. В процессах нейродегенерации принимают участие не только специфические нейроны, но и клетки глии, поэтому при выборе матрикса важно, чтобы он обеспечивал подходящую микросреду.
Рекомбинантные спидроины (РС) по своим свойствам оптимально подходят для разработки таких матриксов. Благодаря своей способности к самосборке, они могут образовывать различные надмолекулярные структуры, такие как гидрогели, в том числе микрогели, прозрачные упругие пленки, высокопористые губчатые 3D-скаффолды и т. п. Учитывая такие свойства биоматериалов на основе РС, как высокая биосовместимость, регулируемая биорезорбция в организме, способность обеспечивать неоваскуляризацию и иннервацию поврежденных тканей, наиболее перспективной областью их применения на сегодняшний день является медицина [2].
В настоящей работе было проведено исследование способности матриксов, полученных на основе водных растворов РС и биологически активных пептидов (5 различных комбинаций), поддерживать рост и дифференци-ровку нейронов и глиальных клеток, полученных из индуцированных плюрипотентных клеток (ИПСК) человека. Было показано различие в адгезии клеточных культур к исследуемым матриксам, а также продемонстрировано снижение пролиферативной активности дифференцирующихся нейронов на всех подложках. С помощью ПЦР в реальном времени показана дифференциальная экспрессия ряда генов в нейронах и глиальных клетках на разных подложках. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках соглашения № 075-15-2021-1357 и договора № 69/21 - СИН1357.
Литература:
1. Gattazzo F, Urciuolo A. and Bonaldo P. Biochim. Biophys. Acta,
2014. V. 1840. P. 2506-2519.
2. Debabov V.G., Bogush V.G. ACS Biomater Sci Eng. 2020. V. 6.
P. 3745-3761.
ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ММСК ПОД ВЛИЯНИЕМ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ДОЗ ГЕПАРИНА
И.К. Норкин1, К.А. Юрова1, О.Г. Хазиахматова1, В.В. Малащенко1, И.А. Хлусов1, 2, Л.С. Литвинова1
1 ФГАОУ ВО Балтийский федеральный университет им. Иммануила Канта, Калининград, Россия
2 Сибирский государственный медицинский университет, Томск, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки, гепарин, in vitro, остеодифференцировка, стволовость.
В целях предотвращения послеоперационных патологических состояний, вызванные гиперкоагуляцией, используют стратегии с применением антикоагулянтов (в т. ч., гепарина). Однако описанная тактика лечения приводит к нарушению процессов миграции и адгезии мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК), что негативно влияет на формирование костной мозоли. При этом влияние гепарина на остеодифферен-цировку носит противоречивый характер.
Материалом исследования служила культура ММСК, выделенная из жировой ткани человека (протокол № 1 от 22.03.2021 БФУ им. И. Канта). Для эксперимента использовались клетки с принадлежностью к ММСК в соответствии с минимальными критериями Международного общества клеточной терапии. В исследовании изучали 4 группы: контроль без гепарина; модель культивирования ММСК с гепарином в терапевтических концентрациях (0,5, 0,75 и 1 МЕ/мл). Культивирование ММСК проводили при 37°С, 100% влажности, содержащей 5% С02 в течение 14 сут. Для постановки эксперимента использовали ППС (5% FBS, 400 Е/мкг/мл пенициллин/стрептами-цин, 2 мМ L-глютамин, aMEM). Оценку поверхностных маркеров CD105, CD73, CD90, CD45, CD14, CD20, CD34 проводили на 14 сут. на цитометре MACS Quant FL7 system (Miltenyi Biotec, Germany). Анализ уровней относительной экспрессии мРНК генов остеодиффе-ренцировки (ALPL, RUNX2, BMP2, BMP6) проводили
