CC BY
7
к 7 суткам. Уровень экспрессии Р-УДР до криокон-сервации, сразу после размораживания, на 1 и 7 сутки культивирования после криоконсервации менялся незначительно.
Таким образом, мы можем сделать вывод, что пул стволовых клеток в популяции эпидермальных кератино-цитов после криохранения заметно снижается, но полностью восстанавливается к 7 суткам культивирования после размораживания.
МАТРИКСЫ ИЗ РЕКОМБИНАНТНЫХ СПИДРОИНОВ ПОДДЕРЖИВАЮТ РОСТ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ НЕЙРОНОВ И ГЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
Е.В. Новосадова1, И.А. Гривенников1, Д.М. Шимченко1, С.А. Антонов1, Т.П. Герасимова1, Л.В. Новосадова1, Е.Л. Арсеньева1, Л.И. Давыдова2, К.В. Сидорук2, В.Г. Богуш2, В.З. Тарантул1
1 Институт молекулярной генетики НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
2 НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
e-mail: novek-img@mail.ru
Ключевые слова: рекомбинантные спидроины, матриксы, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, направленная дифференцировка, нейроны.
Разработка новых биоматериалов и усовершенствование современных методов биоинженерии дали возможность культивировать клетки на 3D подложках-носителях естественного или искусственного происхождения. Выбор матриксов — первый этап для формирования подобного рода систем. Матриксы должны соответствовать определенным требованиям: отсутствие цитотоксичности, хорошая адгезионность, обеспечение, либо препятствие дифференцировки клеток, отсутствие иммунного ответа, биорезорбируемость. Нейрогенез происходит в динамически меняющейся микросреде, где межклеточные взаимодействия и локальные сигналы, в том числе от соседних клеток, гуморальные факторы и внеклеточный матрикс регулируют дифференцировку и гомеостаз клеток [1]. От того, насколько точно и правильно удастся воссоздать этот сложный массив разнообразных сигналов, будет зависеть пространственная организация клеток, правильное формирование контактов и зрелость получаемых культур. В процессах нейродегенерации принимают участие не только специфические нейроны, но и клетки глии, поэтому при выборе матрикса важно, чтобы он обеспечивал подходящую микросреду.
Рекомбинантные спидроины (РС) по своим свойствам оптимально подходят для разработки таких матриксов. Благодаря своей способности к самосборке, они могут образовывать различные надмолекулярные структуры, такие как гидрогели, в том числе микрогели, прозрачные упругие пленки, высокопористые губчатые 3D-скаффолды и т. п. Учитывая такие свойства биоматериалов на основе РС, как высокая биосовместимость, регулируемая биорезорбция в организме, способность обеспечивать неоваскуляризацию и иннервацию поврежденных тканей, наиболее перспективной областью их применения на сегодняшний день является медицина [2].
В настоящей работе было проведено исследование способности матриксов, полученных на основе водных растворов РС и биологически активных пептидов (5 различных комбинаций), поддерживать рост и дифференци-ровку нейронов и глиальных клеток, полученных из индуцированных плюрипотентных клеток (ИПСК) человека. Было показано различие в адгезии клеточных культур к исследуемым матриксам, а также продемонстрировано снижение пролиферативной активности дифференцирующихся нейронов на всех подложках. С помощью ПЦР в реальном времени показана дифференциальная экспрессия ряда генов в нейронах и глиальных клетках на разных подложках. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках соглашения № 075-15-2021-1357 и договора № 69/21 - СИН1357.
Литература:
1. Gattazzo F, Urciuolo A. and Bonaldo P. Biochim. Biophys. Acta,
2014. V. 1840. P. 2506-2519.
2. Debabov V.G., Bogush V.G. ACS Biomater Sci Eng. 2020. V. 6.
P. 3745-3761.
ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ММСК ПОД ВЛИЯНИЕМ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ДОЗ ГЕПАРИНА
И.К. Норкин1, К.А. Юрова1, О.Г. Хазиахматова1, В.В. Малащенко1, И.А. Хлусов1, 2, Л.С. Литвинова1
1 ФГАОУ ВО Балтийский федеральный университет им. Иммануила Канта, Калининград, Россия
2 Сибирский государственный медицинский университет, Томск, Россия
e-mail: norkin_igor@mail.ru
Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки, гепарин, in vitro, остеодифференцировка, стволовость.
В целях предотвращения послеоперационных патологических состояний, вызванные гиперкоагуляцией, используют стратегии с применением антикоагулянтов (в т. ч., гепарина). Однако описанная тактика лечения приводит к нарушению процессов миграции и адгезии мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК), что негативно влияет на формирование костной мозоли. При этом влияние гепарина на остеодифферен-цировку носит противоречивый характер.
Материалом исследования служила культура ММСК, выделенная из жировой ткани человека (протокол № 1 от 22.03.2021 БФУ им. И. Канта). Для эксперимента использовались клетки с принадлежностью к ММСК в соответствии с минимальными критериями Международного общества клеточной терапии. В исследовании изучали 4 группы: контроль без гепарина; модель культивирования ММСК с гепарином в терапевтических концентрациях (0,5, 0,75 и 1 МЕ/мл). Культивирование ММСК проводили при 37°С, 100% влажности, содержащей 5% С02 в течение 14 сут. Для постановки эксперимента использовали ППС (5% FBS, 400 Е/мкг/мл пенициллин/стрептами-цин, 2 мМ L-глютамин, aMEM). Оценку поверхностных маркеров CD105, CD73, CD90, CD45, CD14, CD20, CD34 проводили на 14 сут. на цитометре MACS Quant FL7 system (Miltenyi Biotec, Germany). Анализ уровней относительной экспрессии мРНК генов остеодиффе-ренцировки (ALPL, RUNX2, BMP2, BMP6) проводили
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на ам-плификаторе LightCycler 480 Real-Time PCR («Roche», Швейцария). Статистический анализ проводили с использованием IBM SPSS Statistics 20.
При добавлении гепарина в исследуемых концентрациях (0,5, 0,75 и 1 МЕ/мл) в культуру ММСК доля CD90+, CD105+ и CD73+ клеток статистически значимо не изменялась относительно контроля. В модели культивировании ММСК с гепарином в концентрации 1 МЕ/мл экспрессия мРНК гена щелочной фосфа-тазы (ALPL) увеличилась в 26 раз (относительно контроля), что свидетельствует о дифференцировке ММСК в остеобласты. Экспрессия гена ALPL относится к ранним стадиям остеодифференцировки и необходима для минерализации межклеточного матрикса. Экспрессия мРНК генов RUNX2, BMP2 и BMP6 не изменялась между исследуемыми группами. Однако наблюдалась тенденция к увеличению экспрессии мРНК генов (RUNX2, BMP2 и BMP6) при добавлении гепарина в концентрации 1 МЕ/мл.
Таким образом, выявленное повышение экспрессии мРНК генов остеодифференцировки (ALPL, RUNX2, BMP2, BMP6) в присутствии гепарина в терапевтических концентрациях (в сравнении с контролем) может свидетельствовать об участии гепарина (1 МЕ/мл) в инициации остеодифференцировки ММСК в условиях сокультивиро-вания in vitro. Авторы выражают благодарность за финансовую поддержку Программы стратегического академического лидерства ПРИОРИТЕТ 2030 в СибГМУ.
СОЗДАНИЕ ЖИВОТНОЙ МОДЕЛИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ Т-КАДГЕРИН ОПОСРЕДОВАННОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ
И.Д. Ожималов, М.Н. Балацкая,
В.С. Попов, И.Б. Бродский, Е.В. Семина,
М.А. Кулебякина, В.Ю. Сысоева,
А.В. Балацкий, К.А. Рубина, Н.И. Калинина
Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: i.ozhimalov@gmail.com
Ключевые слова: Т-кадгерин, адипонектин, регенерация, экзосомы.
Адипонектин — гормон жировой ткани, являющийся одним из важнейших регуляторов регенерации тканей. Его влияние на регенерацию скелетных мышц [1], анги-огенез и предотвращение поражения кровеносных сосудов и сердца опосредовано его взаимодействием с мембранным рецептором Т-кадгерином [2, 3]. В частности, связывание адипонектина с Т-кадгерином вызывает повышение продукции внеклеточных везикул, которые необходимы для реализации влияния адипонектина на регенерацию тканей [4].
Для исследования процессов регенерации, опосредованных Т-кадгерином, нами была выведена линия нокаутных мышей путем скрещивания отбей с флокси-рованным 3 экзоном гена Т-кадгерина (Cdh13) и особей с конститутивно активной Cre-рекомбиназой. С помощью метода ПЦР мы продемонстрировали отсутствие 3 экзона как в ДНК, так и мРНК белка Т-кадгерина в образцах нокаутных мышей. Мы также проанализировали содержание Т-кадгерина в образцах аорт, сердец и скелетных мышц с помощью иммуноблоттинга. Отсутствие Т-кадгерина также было подтверждено с помощью про-теомного анализа образцов скелетных мышц.
Мы показали, что масса тела, давление крови и другие параметры значимо не отличались у нокаутных мышей по сравнению с мышами линии C57Bl, которые экспрессируют ген Т-кадгерина. Поскольку взаимодействие адипонектина с Т-кадгерином влияет на регенерацию скелетных мышц, мы сопоставили способность к бегу на беговой дорожке нокаутных и контрольных мышей. Вопреки нашему предположению, мыши, но-каутные по Т-кадгерину, уставали медленнее и пробегали значимо более длинную дистанцию по сравнению с мышами контрольной линии. Мы проанализировали молекулярные механизмы таких различий. В частности, мы оценили уровень фосфорилирования АМФ-киназы, а также продукцию внеклеточных везикул у но-каутных мышей и животных контрольной линии. Таким образом, полученная нами линия мышей нокаутных по Т-кадгерину открывает возможности для проведения исследований участия этого белка в регенерации тканей. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ № 19-29-04118.
Литература:
1. Tanaka Y., Kita S., Nishizawa H. et al. Sci. Rep. 2019. V.9. P.16.
2. Denzel M.S., Scimia M.-C., Zumstein P.M. et al. J. Clin. Invest. 2010. V. 120. P. 4342-4352
3. Parker-Duffen J.L., Nakamura K., Silver M. et al. J. Biol. Chem. 2013. V. 288. P. 24886-24897
4. Obata Y., Kita S., Koyama Y. et al. JCI insight. 2018. V. 3. № . 8.
ПРИМЕНЕНИЕ ДИОПСИДА В КАЧЕСТВЕ
НОСИТЕЛЯ РЕКОМБИНАНТНОГО BMP-
2 В СОСТАВЕ ГИБРИДНЫХ ИМПЛАНТАТОВ
НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ
ИНЖЕНЕРИИ КОСТНОЙ ТКАНИ
П.А. Орлова1, А.В. Жулина1, М.С. Кривозубов1,
А.В. Громов1, А.С. Карягина1, 2 3
1 НИЦ эпидемиологии и микробиологии
им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, Москва, Россия
2 НИИ физико-химической биологии
им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
3 ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии, Москва, Россия
e-mail: p.orlova88@gmail.com
Ключевые слова: силикатная керамика, диопсид, BMP-2.
Эффективным решением проблемы замещения костных дефектов может быть разработка остеоиндуктивных гибридных имплантатов на основе силикатной керамики с адсорбированным на ней рекомбинантным белком BMP-2. Различные варианты силикатной керамики обладают высокой биоактивностью, биосовместимостью, хорошими механическими свойствами, способствуют остеогенной дифференцировке мезенхимальных стро-мальных стволовых клеток и, согласно результатам наших исследований, обладают высокой сорбционной емкостью по отношению к BMP-2.
Эффективнсть применения имплантатов на основе силикатной керамики была исследована на трех моделях: 1) при введении суспензии содержащих и не содержащих BMP-2 частиц диопсида (CaMgSi2O6) и волластонита (CaSiO3) в гиалуроновой кислоте под надкостницу черепа мыши; 2) при имплантации суспензии частиц диопсида с/без BMP-2, введенной в диски
