CC BY
616
И. Н. Мусин, Ф. С. Шарифуллин, И. С. Разина
ПРИБОРЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА В МЕДИЦИНЕ
Ключевые слова: фотометрия, колориметр фотоэлектрический, фотоэлементы, спектрофотометр, фотоприемник,
полимерные комплексы.
В статье приведены физико-химические методы анализа малых количеств веществ. Рассмотрено оборудование, их принципиальные схемы, порядок работы, преимущества и недостатки.
Keywords: photometry, photo-electric colorimeter, photo cells spectrophotometry, photodetector, polymer complexes.
In article physical and chemical methods of the analysis of small quantities of substances are resulted. The equipment, their circuit diagrams, an operating procedure, advantages and lacks is considered.
Методы количественного определения химического состава веществ, основанные на измерении их физических свойств, называются физико-химическими методами анализа. Все эти измерения связаны с использованием соответствующих приборов и поэтому их часто называют инструментальными методами анализа.
Фотометрические и спектрофотометрические методы получили широкое распространение в лабораториях. Эти методы позволяют относительно быстро определять весьма малые количества веществ. Имеется определенная закономерность в поглощении части светового спектра окрашенным раствором. Например, раствор, окрашенный в желтый цвет, поглощает синюю часть света, т. е. дополнительный цвет [1].
Величина светопоглощения в фотометрии выражается величиной оптической плотности й (экстинкция или поглощение раствора иногда обозначается Е). Величина, обратная плотности, называется прозрачностью, или пропусканием раствора, обозначается Т и выражается в процентах.
Основным законом колориметрии и абсорбциометрии является объединенный закон Бугера
— Ламберта — Бера. Из этого закона следует, что оптическая плотность раствора, или экстинкция, прямо пропорциональна концентрации поглощающего вещества, толщине слоя раствора и молярному коэффициенту погашения. Закон имеет следующее выражение:
й=Е=£Аа, (1)
где й — плотность или Е — экстинкция; £д — молярный коэффициент погашения; С — концентрация вещества, поглощающего свет; I — толщина поглощающего слоя окрашенного раствора.
Молярный коэффициент погашения
представляет собой оптическую плотность 1М раствора, помещенного в кювету с толщиной слоя 1 см.
Фотоэлектроколориметрия - это определение концентрации вещества в растворе по изменению тока в фотоэлементе при попадании на него луча, прошедшего через исследуемый раствор. Степень поглощения света (коэффициент экстинкции) прямо пропорциональна концентрации вещества в растворе. Концентрацию растворенного вещества определяют путем сравнивания силы тока в фотоэлементе через
исследуемый раствор с силой тока на выходном ФЭ при прохождении луча через контрольную жидкость
- бесцветный растворитель.
Нефелометрия - это тоже, что и фотоэлектроколориметрия, но оценивается не степень поглощения или экстинкции, а степень рассеивания света в эмульсиях и взвесях.
Спектрофотометрия - это тоже, что фотоэлектроколориметрия и нефелометрия, но предназначенная для измерения светопоглощения или рассеивания строго определенной длины волн.
Фотометр предназначен для качественной или количественной оценки результатов иммуноферментного анализа и широко используется в медицине, биологии, фармакологии, пищевой промышленности, сельском хозяйстве и ветеринарии и в службах санэпидемнадзора (СЭС).
Примеры лабораторных исследований, проводимых посредством фотометрических приборов [2]:
- концентрацию гемоглобина в специальном растворе крови определяют в спектрофотометре при зеленом светофильтре с И = 500... 560 нм в кювете с рабочей шириной 10 мм;
- процесс агрегации тромбоцитов исследуют в ФЭК, перемешивая смесь плазмы крови и специального раствора в течение 16 мин;
- исследуя в ФЭК кровь в кислотном физиологическом растворе, строят эритрограммы -зависимости коэффициента экстинкции от времени в течение 10 мин - и делают выводы о кислотной резидентности крови;
- белок в моче дает помутнение при добавлении в нее специального раствора, это помутнение регистрируется ФЭК, расчет ведут по калибровочному графику;
- для определения сахара в моче исследуют цветную реакцию мочи и щелочи (светофильтр зеленый, ширина кюветы - 5 мм), смесь нагревают в водяной бане, сахар определяют по калибровочной кривой;
- диагностику онкологических заболеваний (выявление онкомаркеров), фотодинамические методы используются в терапии метастазов рака молочной железы и меланомы [3].
Актуально применение фотометрических методов анализа в контроле качества лекарственных
препаратов [4 - 7]. Расширение арсенала
лекарственных средств сопровождается развитием новых методов их анализа. Это связано с тем, что выход и качество конечных продуктов химикофармацевтического производства зависит не только от строгого проведения процесса согласно технологическому регламенту, от качества исходного сырья, но и от применения надежных методов постадийного контроля. Физико-химические методы все шире внедряются в фундаментальные фармацевтические исследования и в практику фармацевтического анализа. Они используются для идентификации и количественного определения различных групп лекарственных веществ, их
стандартных образцов, а также таблеток, мазей, инъекционных растворов, капель и других многокомпонентных лекарственных смесей [8]. Наиболее доступны для использования в
фармацевтическом анализе фотометрические методы, в частности спектрофотометрия в ИК- и УФ-областях, фотометрия в видимой области спектра и их
различные модификации [9]
Интересен фотометрический экспресс-метод определения светозащитных свойств упаковки для лекарственных средств [10].
В [11] представлен обзор основных подходов, применяемых для определения гидразина и его
производных спектрофотометрическими и
флуориметирическими методами. Приведены примеры определения в объектах. Обсуждены достоинства и недостатки предложенных схем анализа, рассмотрены тенденции развития методов.
Как известно, принципиально новые возможности для решения практических задач дают полимер - коллоидные комплексы, поскольку по своим физико-химическим свойствам они существенно отличаются от индивидуальных компонентов [12]. Системы, содержащие неионные ПАВ и водорастворимые полимеры, широко используются в нефтяной, фармацевтической и других отраслях промышленности.
Взаимодействие полимолекулярных ансамблей в частности мицелл с макромолекулами, такими как полимеры, могут мимикрировать действие определенных биоструктур и поэтому они также интересны с теоретической точки зрения.
В работе [13] были рассмотрены особенности формирования полимер - коллоидных комплексов в системе неионное ПАВ - полимер. В качестве неионного ПАВ выбраны алкилполиэтоксифенолы (неонолы) с различной длиной оксиэтилированной цепи (АФ9 _ 12, АФ9 _ 10, АФ9 _ 8, АФ9 -6), а в качестве полимера _ полиэтиленимин (ПЭИ)
высокомолекулярный (молярной массы 10000) и низкомолекулярный молярной массы 1200)
Спектрофотометрическим методом показано, что реакция в системе АФ9-12 _ ПЭИ1200 (0.02моль/л) _ вода идет в двух направлениях, т.е. идут две параллельные реакции, причем с близкими скоростями. Полученные данные по каталитической активности полимер _ коллоидных композиций позволяют предположить, что в системе на основе неионных ПАВ и полиэтилениминов формируются нанореакторы [14,
15]. Это можно использовать для разработки эффективных каталитических систем на основе неионных ПАВ с регулируемой активностью, моделирующих принципы функционирования биокатализаторов и действующих в мягких условиях. Это имеет важное значение при решении экологических проблем по уничтожению токсичных соединений.
Разработана фотометрическая методика определения дифенгидрамина гидрохлорида в капсулах Антигриппин-АНВИ [7], основанная на реакции лекарственного вещества с кислотным красителем бромтимоловым синим. Изучены оптимальные условия образования окрашенного комплекса и его спектральные характеристики.
В настоящее время бурно развивается
направление получения аналитической информации в лабораторной диагностике, которое все более успешно конкурирует с традиционной фотометрией: применение видеоцифровых систем на основе ПЗС-камер и сканеров [16]. Микропланшеты для иммуноферментного анализа (ИФА) являются традиционным объектом измерений
специализированных вертикальных фотометров
(ИФА-ридеров). Целью работы [17] являлось сопоставление аналитических характеристик сканерной видеоцифровой системы Эксперт-Лаб при использовании в качестве фотометра и обычного высококлассного ИФА-ридера.
Примеры промышленных фотометров:
- колориметры фотоэлектрические
концентрационные КФК-2, КФК-1 [3];
- колориметр фотоэлектрический
однолучевой КФО;
- фотоэлектроколориметр ФЭК-56м, ФЭК-М;
- спектрофотометры СФ-4, СФ-16;
- минифотометры МйеПесИ (Тайвань):
- модель ЭР-810 (на 330...1000 нм содержит аналоговый индикатор-самописец);
- модель ЭР-870 (на 300.1000 нм, включает
клавиатуру, дисплей, 30 ячеек памяти для
программы измерений).
Фотометры классифицируют:
- по количеству каналов (одноканальные и многоканальные фотометры);
- по типу источников света (с лампами накаливания, с водородными и ртутными лампами);
- по типу фотоприемников (с
фоторезисторами, селеновыми фотоэлементами, фотодиодами и с фототранзисторами);
- по устройству индикации (стрелочные, цифровые и микрометрические).
Фотоэлектрический колориметр ФЭК-М применяется в медицинских лабораториях всех направлений (рис. 1).
Технические характеристики прибора:
- количество каналов 2;
- диапазон исследуемых коэффициентов экстинкции 2.100%;
- погрешность прибора 1%;
- длины волн фильтров (зеленый, синий, красный) 300.700 нм.
светофильтры, А1, А2 - кюветы с исследуемым и контрольным растворами, Ф1, Ф2 - фотоэлементы селеновые, К - клин (заслонка), применяемый для изменения светового потока по оптическому каналу, Б - диафрагма с микрометрическим винтом, отградуированным в единицах коэффициентов экстинкции, Г - гальванометр
Фотоэлементы Ф1, Ф2 включены дифференциально, поэтому при идентичных каналах световые токи фотоэлементов вычитаются и гальванометр показывает нуль. Идентичность каналов обеспечивается идентичностью фотоэлементов и световых потоков. Переключатель в первом положении обеспечивает меньшую чувствительность гальванометра, во втором - полную.
Этапы работы с прибором следующие. В кюветы А1 и А2 помещают контрольный раствор. Диафрагму устанавливают на 100%. Регулируя клин (левый световой поток), обеспечивают идентичность каналов по нулю гальванометра, в кювету А1 ставят исследуемый раствор. Гальванометр показывает не нуль. Изменяя переключателем чувствительность гальванометра и вращая лимб диафрагмы Б, устанавливают стрелку гальванометра на нуль. На лимбе читают коэффициент экстинкции.
Колориметр фотоэлектрический одноканальный (КФО) используется в аналитических лабораториях для измерения коэффициента пропускания через раствор света определённых длин волн.
Технические характеристики:
- коэффициент пропускания 5. 100%;
- погрешность измерения коэффициента пропускания 1...5%;
- разделение на цвета длин волн: 415 нм -синий, 500 нм - сине-зеленый, 530 нм - зеленый, 600 нм - оранжевый, 630 нм - красный, 320.720 нм -нейтральный.
В приборе используются лампа накаливания и селеновый фотоприемник. Оптический принцип работы устройства - одноканальный (эталонный и исследуемый раствор анализируется последовательно во времени).
Принципиальная схема устройства приведена на
рис. 2.
Работа с прибором заключается в следующем. Затемнив фотоприемник, потенциометром Я2 стрелку прибора устанавливают на нуль, затем вводят кювету с контрольным раствором с коэффициентом
пропускания X = 5.100% и потенциометром Я5 добиваются максимума шкалы, соответствующей Фо. После этого устанавливают исследуемый раствор, измеряют Физм и по формуле X = Физм/Фо рассчитывают X.
Рис. 2 - Схема ФКО: Д1 - селеновый
фотоприемник, А1 - операционный усилитель, И1, Я2, Я5 - сопротивление установки на нуль, ИП - измерительный прибор, Я4, Я5 - цепь отрицательной обратной связи (ООС) для регулировки чувствительности ИП
Спектрофотометры КФК-3 [18], КФК-2МП предназначены для измерения коэффициента пропускания, оптической плотности растворов и твердых образцов, скорости изменения оптической плотности и концентрации вещества в растворах. Физико-химические методы и биотестирование применяются для системного анализа качества водных объектов [19], эти методы также могут использоваться при анализе археологических объектов, в частности находок из металла [20], загрязняющих веществ в объектах окружающей природной среды [21].
Технические показатели прибора КФК-3:
- коэффициент пропускания 0,1.100%;
- погрешность измерения коэффициента пропускания 5%;
- длины волн 315. 990 нм;
- разрешение по длине волны 7 нм;
- оптическая плотность 0.3.
Оптическая схема двухканальная (раствор и
растворитель исследуются одновременно). Лампа галогенная, фотоприемник фотодиодный. В этом приборе в качестве дифрагирущего элемента используется дифракционная решетка (рис.3).
Технические характеристики прибор КФК-
2МП:
- коэффициент пропускания 1... 100%;
- погрешность измерения коэффициента пропускания 1%;
- длины волн 315. 980 нм;
- оптическая плотность 0.2.
В приборе используются оптическая схема одноканальная, лампа галогенная, фотоприемники фотодиодные (Ф26 - для 315.500 нм, ФД-24К - для 500...980 нм), дифрагирущие элементы -светофильтры.
ФП
[>
мэвм
Г(Ф)
МУПДР
ввд
ТТ2(>.) РСН
о
Рис. 3 - Схема КФК-3: ФП - фотоприемник, МУПДР - механизм угла поворота дифракционной решётки, МЭВМ - микроЭВМ, ПУП -
преобразователь угла поворота, РСН -
регулируемый стабилизатор напряжения
Свет от лампы попадает на фотодиод Д через раствор. Фотоприемник формирует напряжение и(Ф), которое вводится через АЦП в микроЭВМ.
Механизм управления углом поворота дифракционной решетки изменяет длину волны света, проходящего через раствор. Это изменение (механическое) устройством ПУП преобразуется в напряжения и1 и и2, пропорциональные длине волны. и1 поступает в МЭВМ через второй АЦП, а и2 преобразуется в напряжение питания лампы так, чтобы на нижней длине волны 315 нм это напряжение было равно 12 В, а на верхней - 10 В. При этом осуществляется коррекция силы света от длины волны.
В МЭВМ вводятся и(Ф) и и1(Л) в автоматическом режиме, а градуировочный коэффициент Кг - с клавиатуры. Кроме этого, в МЭВМ имеется таймер, который дает информацию об интервале времени 1 между замерами последовательных коэффициентов пропускания. Благодаря этому в МЭВМ рассчитываются такие параметры:
Л = (Физм/Фо)-100% - коэффициент
пропускания;
Д = й(1/Л) - оптическая плотность;
А = (Дкон - Днач)Л - скорость изменения оптической плотности;
С = ДКг - концентрация, где Кг -градуировочный коэффициент.
Кроме этого, МЭВМ управляет механизмом угла поворота дифракционной решетки и переключает оптический путь луча через эталонный и исследуемый растворы. Процесс измерения параметров
осуществляется по программе, заложенной в МЭВМ.
Фотометр КФК-2МП работает аналогично КФК-
3, но в нем отсутствует блок МУПДР, а содержится кассета с одиннадцатью фильтрами. Смена фильтров осуществляется дискретно по команде МЭВМ.
Специалист всегда стремиться получить максимум полезной информации с помощью наиболее безопасных для пациента методик диагностики, к которым относятся лабораторные анализы крови, мочи, кала, мокроты и слизи, содержимого мазков и соскобов, к таким методам и относят фотометрические и спектрофотометрические методы анализа. Данные методы позволяют относительно быстро определять весьма малые количества веществ. Отличаясь простотой, хорошей чувствительностью и высокой скоростью анализа, они находят применение, как в
повседневной практике, так и в исследовательской работе. Фотометрический анализ является одним из наиболее удобных методов определения малых количеств вещества, так как существует
практически неограниченная возможность превращения вещества в раствор, сильно
поглощающий свет
Достоинство фотометров заключается в том, что обеспечивается автоматизированный режим измерения параметров (благодаря наличию МЭВМ), а недостаток - в сложности устройств. Однако, обширная область применения фотометров -лаборатории научно-исследовательских институтов, лечебно-профилактических и санитарно-
эпидемиологических учреждений, лаборатории контроля пищевых продуктов и мониторинга окружающей среды перекрывают все их недостатки.
Литература
1. Любина А.Я., Ильичева А.П. Катасонова Т.В., Петросова С.А., Методы клинических лабораторных исследований. М., 1984.
2. Двухлучевые фотометрические системы для клинико-
физиологических исследований. Учебное пособие. Е.П. Попечителев, Б.И. Чигирев _ Л: Издательство
Ленинградского университета, 1991.
3. Филинов В.Л., Сдвижков А.М., Борисов В.И. Фотодинамическая терапия метастазов рака молочной железы и меланомы / Паллиативная медицина и реабилитация. 2004. № 3. С. 19-23.
4. Бодренкова Н.А. Применение физических и физикохимических методов для анализа щелочных и щелочноземельных катионов в лекарственных препаратах / автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук / Харьков, 1996
5. Сафонова Е.Ф., Сливкин А.И., Вязова Д.С., Дзюба В.Ф Сравнительная оценка физико-химических методов контроля качества метронидазола / Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2008. № 1. С. 159-162.
6. Марахова А.И. Применение физико-химических методов в анализе настоев из сырья лекарственных растений семейства яснотковых / автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук / Пермская государственная фармацевтическая академия. Пермь, 2009
7. Тыжигирова В.В., Лапшина М.П. Фотометрическое определение дифенгидрамина гидрохлорида в лекарственном препарате антигриппин-анви / Сибирский медицинский журнал (г. Иркутск). 2011. Т. 106. № 7. С. 73-75.
8. Арзамасцев А.П., Печенников В.М., Родионова Г. М. и
др. Анализ лекарственных смесей. М.: Компания
Спутник, 2000, 275с.
9. В. Г. Беликов Анализ лекарственных веществ
фотометрическими методами. Опыт работы
отечественных специалистов / Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 2002, т. ХЬУ1, № 4
10. Карпенко Т.А., Артемьев А.И. Фотометрический экспресс-метод определения светозащитных свойств упаковки для лекарственных средств / Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Медицина. 2000. № 2. С. 64-70.
11. Смоленков А. Д., Родин И.А., Шпигун О.А. Спектрофотометрические и флуориметрические методы определения гидразина и его метилированных аналогов / Журнал аналитической химии. 2012. Т. 67. № 2. С. 133.
12. Смирнова Н.А. Фазовое поведение и формы самоорганизации растворов смесей поверхностно _ активных веществ// Успехи химии.- 2005. -Т.74. -№2. -С. 138 _ 154.
13. Бакеева Р.Ф. Агрегационные и каталитические свойства мицеллярных систем полиэтиленимин+нонилфенол+вода / Р.Ф. Бакеева, И.С. Разина, Ю.С. Ковалев, А. И. Куклин, Т.С. Горбунова, В.Ф. Сопин // Вестник Казанского технол. ун-та.2009. -№5. -С. 296-303.
14. Бакеева Р. Ф. Коллоидные свойства мицелл в системе полиэтиленимин (М. 1200) _ нонилфенол _ вода / Р.Ф. Бакеева, И.С. Разина, Т.С. Горбунова, А. Раевска, Ю. Ковалев, В.Ф. Сопин // Вестник Казанского технол. ун-та.-2004. -№1-2. -С. 234-240.
15. Бакеева Р.Ф. Полимер-коллоидные ассоциаты в системе полиэтиленимин (ВМ) _ нонилфенол _ вода / Р.Ф. Бакеева, И.С. Разина, Т.С. Горбунова, В.Ф. Сопин // Вестник Казанского технол. ун-та. -2006. -№1. -С. 49-53.
16. Старовойтова Т.А., Стериополо Н.А., Зайко В.В.,
Мартынкила Л.П., Калачева О.С., Кутвицкий В.А., Тугалуков А.Е., Волощук С.Г., Венгеров Ю.Ю., Тогузов Р.Т. Исследование характеристик сканерной
видеоцифровой системы эксперт-лаб для регистрации результатов иммуноферментного анализа / Клиническая лабораторная диагностика. 2007. № 9. С. 30Ь-31.
17. Иноземцев Я. О., Воробьев А. Б., Матюшин Ю. Н. Калориметр для контроля эффективности энергоемких систем и калорийности энергоресурсов / Вестник Казанского технол. ун-та. - 2010.-№ 1.- С. 71-74
18. Бункин С. Б., Гурушкина З. И. Фотометры КФК-3-«ЗОМЗ» - традиции и качество / Интеграл.-2008.-№4.- С. 6-7
19. Беднаржевский С.С., Еськов В.М., Захариков Е.С., Кузнецов Д.И., Мамедов Р.М., Пушкарев Н.С., Шевченко Н.Г. Применение физико-химических методов и биотестирования для системного анализа качества водных объектов в районах нефтедобычи / Вестник новых медицинских технологий. 2008. Т. 15. №
03. С. 38-39.
20. Цыбульская О.Н., Буравлев И.Ю., Юдаков А.А., Никитин Ю.Г. Использование физико-химических методов анализа при изучении археологических объектов / Вестник Дальневосточного отделения Российской академии наук. 2010. № 5. С. 85-90
21. Воронин С.С., Тимощук С.П. Современные физикохимические методы анализа загрязняющих веществ в объектах окружающей природной среды / Экологические системы и приборы. 2008. № 7. С. 18-21.
© И. Н. Мусин - к.т.н., зав. каф. технологического оборудования медицинской и легкой промышленности КНИТУ, imusin@kstu.ru; Ф. С. Шарифуллин - д.т.н., доц. каф. плазмохимических и нанотехнологий высокомолекулярных материалов КНИТУ, sharifullin80@mail.ru; И.С. Разина - к.х.н., асс. каф. технологического оборудования медицинской и легкой промышленности КНИТУ, ira-a82@mail.ru.
