CC BY
36
УДК 581.1
ПРЕОДОЛЕНИЕ ГЛУБОКОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО ПОКОЯ ЗАРОДЫШЕЙ МОЖЖЕВЕЛЬНИКА СИБИРСКОГО IN VITRO
Ю.В. Зырянова, Е.Н. Аёшина, Н.А. Величко, М. Н. Кузьмичева
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный технологический университет», Красноярск, Россия 660049, Красноярск, пр. Мира, д. 82; e-mail: [email protected]
Объектом исследования были семена можжевельника сибирского - Juniperus sibirica Burgsd., произростающего на територии Красноярского края. Цель исследования заключалась в подборе условий in vitro для преодоления глубокого физиологического покоя зародышей можжевельника сибирского. Изолированные зиготические зародыши можжевельника сибирского в стерильных условиях вводили на безгормональные агаризованные среды с минеральным составом по Мура-сиге-Скугу, Шенке-Хильдебрандту, Уайту, Гамборгу, Литвай. Культивирование проводили при температуре 25±1 °С, фотопериоде 16 часов день и 8 часов ночь при освещенности 3000 лк. Для выведения зародышей можжевельника сибирского из состояния глубокого физиологического покоя применяли агаризованные питательные среды с добавлением гормонов ауксиновой природы: а-НУК, 2,4-Д, ИУК, ИМК, а-НУК+ИУК, ИМК+ИУК, 2,4-Д+ИМК в различных концентрациях и соотношениях. В течение периода культивирования зародышей можжевельника сибирского на безгормональных средах наблюдали морфогенетическую реакцию на двух питательных средах. На среде Уайта на 25-30 сутки наблюдали позеленение семядолей. При дальнейшем культивировании на данной среде изменений не происходило. На питательной среде с минеральными солями по Гамборгу 5 % эксплантов отреагировали формированием ненормальных проростков, характеризующихся вздутием, а также закручиванием гипокотиля в спираль и прекращением роста. Это показывает, что зародыши находятся в состоянии глубокого физиологического покоя и не способны давать нормальные проростки без экзогенного воздействия на них. Полученные результаты позволяют утверждать, что питательная среда с минеральными солями по Уайту с добавлением гормона ауксиновой природы - а-НУК, является наиболее благоприятной для достижения поставленной цели - преодоления глубокого физиологического покоя зародышей можжевельника сибирского.
Ключевые слова: Juniperus sibirica Burgsd., можжевельник сибирский, всхожесть семян, стратификация, зиготические зародыши, постоянные препараты, культивирование in vitro.
The object of the study were the seeds of the Siberian juniper -. Juniperus sibirica Burgsd, growing on the territory of the Krasnoyarsk Territory. The purpose of the study was the selection of conditions in vitro to overcome the deep physiological rest embryos juniper Siberian. Isolated zygotic embryos juniper Siberian aseptically administered bezgormonalnye on agar medium with the mineral composition of the Murashige and Skoog, Schenke-Hildebrandt, White, Gamborg, Litvay. Cultivation was performed at 25 ± 1 ° C, 16 h photoperiod of 8 hours a day and night at an illumination of 3000 lux. For removing embryos juniper Siberian state of deep physiological rest used agar nutrient medium supplemented with auxin hormones nature: а-NAA, 2,4-D, IAA, IBA, NAA + alpha-IMC, IMC + IAA, 2,4-D + IMC in different concentrations and ratios. During the culture period embryos juniper Siberian bezgormonalnyh on media observed morphogenetic response to the two culture media. On Wednesday White 25-30 hours we watched greening cotyledons. With further cultivation on this medium changes from happening. On medium mineral salts on Gamborg 5% explants responded formation of abnormal seedlings, characterized by swelling and tightening of the hypocotyl into a spiral and termination of growth. This shows that the embryos are in deep physiological rest and capable of producing normal seedlings without exogenous impacts. These results suggest that the culture medium with mineral salts for White with the addition of hormone auxin nature - а-NAA is most conducive to achieving the objective - to overcome the deep physiological rest embryos juniper Siberian.
Keywords: Juniperus sibirica Burgsd., germination of seeds, stratification, zygotic embryos, constant preparations, culture
in vitro.
ВВЕДЕНИЕ
Juniperus &чЬтса Burgsd. - вечнозеленый низкорослый, стелющийся хвойный кустарник семейства кипарисовых. В диком виде растет в горных районах Средней Азии, Крыму, Алтае-Саянской горной области, на Кавказе, Дальнем Востоке и Сибири (Воробьев, 1987). Природная форма очень привлекательна благодаря темно-зеленой иголь чатой хвое с яркими белыми устьичными полосками. Имеет высокие декоративные качества, отличается медленным ростом. Морозостоек и неприхотлив. Можжевельник сибирский - вид, который нуждается в защите и изучении (Воробьев, 1987, Носов, 2001, Мухамедшин, 1982). Можжевельники
приобретают все большую популярность в ландшафтном дизайне и могут смело конкурировать с другими хвойными растениями. Однако, для большинства видов, в том числе для можжевельника сибирского, основным препятствием для естественного и искусственного возобновления является низкая всхожесть семян. Согласно данным разных ученых всхожесть семян можжевельника варьируется от 0 до 5,2 % (Ру-баник, 1969, Бакланова,1988, Барзут, 2002, Харламова, 1997). Одной из основных причин долгого непрорастания семян можжевельника многие авторы называют глубокий физиологический покой (Рубаник,1969, Харламова, 1997, Истратова, 1968, Мухамедшин, 1980,
Николаева, 1967.) Покой семян можно отнести к комбинированному типу, при котором задержка прорастания вызывается и свойствами покровов, и состоянием внутренних частей семени (низкое содержание физиологически активных веществ и слабая активность ферментов). На прорастание оказывают влияние и семенные покровы (семенная кожура, эндосперм).
Отдельные авторы склоняются к другой точке зрения и основной причиной низкой всхожести семян можжевельника называют недоразвитие зародыша (Николаева, 1967, Иванова, 1974).
По данным некоторых исследователей такие манипуляции с семенами можжевельника как замачивание в снеговой воде, ошпаривание кипятком не оказывают сколько-нибудь заметного стимулирующего действия на прорастание. Химическая обработка семян можжевельника также является малоэффективной для нарушения глубокого физиологического покоя семян можжевельника. Воздействие раствором KMnO4, концентрированной серной кислотой, раствором соды, едкого натрия, гиббереллиновой кислоты, стимуляторами роста НРВ (нефтяное ростовое вещество) на прорастание семян можжевельника не оказывают положительного влияния. Всходы появляются через 2-3 года, а всхожесть не превышает 3-5 % (Воробьев, 1987, Носов, 2001, Мухамедшин, 1982).
Для нарушения состояния покоя семян, полученных из зрелых шишкоягод, чаще всего используют стратификацию. Однако, по данным многих исследователей всхожесть семян можжевельника увеличивается незначительно. Так, после холодной стратификации в течение трех месяцев этот показатель достиг максимума в 9,3 % (Tigabu M, 2007, Al-Ramamneh Ezz AL-Dein,1970). Холодная стратификация и стратификация переменными температурами в течение 9 месяцев увеличила всхожесть семян можжевельника до 35 % (Рубаник, 1969, Бакланова,1988).
Существующие в настоящее время методы повышения всхожести семян можжевельников, в том числе традиционная стратификация, не решают эффективно названную проблему. В связи с чем возникла необходимость разработки технологии in vitro для интенсификации процессов прорастания семян можжевельника сибирского и ускоренного получения посадочного материала.
Цель данной работы заключалась в преодолении глубокого физиологического покоя зрелых зиготиче-ских зародышей можжевельника сибирского.
В задачи входило следующее: 1) сравнить стадии развития зиготических зародышей in vivo (в естественных условиях) в зависимости от цикла развития шишек можжевельника сибирского, произрастающего на территории Красноярского края; 2) определить всхожесть семян можжевельника сибирского в условиях in vitro на безгормональных питательных средах; 3) оценить возможность использования эмбриокультуры как метода преодоления покоя семян можжевельника сибирского; 4) подобрать оптимальные условия культивирования in vitro зиготических зародышей можжевельника сибирского для получения полноценных проростков.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Растительный материал. В работе использовали семена можжевельника сибирского, произрастающего на территории Красноярского края. Сбор материала (шишек) осуществляли с июля по октябрь 2010-2012 гг. на территориях дендрария Сибирского государственного технологического университета (пригород Красноярска, 56° с. ш., 92°40' в. д.), стационара Института леса СО РАН «Погорельский бор» (38-й км от г. Красноярска, 56°22'07.48'' с. ш. 92°57'17.95'' в. д.), в Богучанском районе Красноярского края, в Якутии (пойма р. Витим, 59°27>00>> с.ш. 112°34>60>> в.д.), Эвенкии (поселок Суринда, 62°34'00" с. ш. 97°23'00" в.д.). Манипуляции проводили с шишками (шишкояго-дами) второго года созревания.
Сравнение стадий развития зародышей можжевельника сибирского в зависимости от срока сбора шишек и места произрастания. Зиготические зародыши в семенах можжевельника, как и других голосеменных растений, проходят несколько последовательных стадий развития: глобулярную, сердечковидную, торпедовидную («торпедо»), стадию инициации семядолей и, наконец, стадию зрелого зародыша. Определение стадий развития зародышей можжевельника сибирского в собранных образцах осуществляли с помощью изготовления микротомных срезов. Для этого семена, извлеченные из шишкоягод с удаленной кожурой, фиксировали в смеси С.Г. Навашина в течение суток в темноте (состав фиксатора: 10 частей 1 %-й хромовой кислоты, 4 части 16 %-го формалина и 1 часть ледяной уксусной кислоты) (Паушева, 1970). Дальнейшую обработку материала проводили по общеизвестной методике, принятой в цитологии и эмбриологии растений (Прозина,1660). Парафинированные образцы резали на ротационном микротоме. Толщина срезов 7-12 мкм.
Срезы окрашивали проционовыми красителями Окрашивание проводили на депарафинированных срезах. Комбинированная окраска белков и углеводов осуществлялась проционом ярко-синим RS и про-ционом ярко-красным 2 RS (Иванов,1967, Иванов, 1982). Промытые водой срезы помещали в 0,1 % раствор проционового ярко-синего в фосфатном буфере с pH 5,6-6,0 в течение 1 часа при температуре 56°С -60°С. Срезы промывали и окрашивали 0,1 % содовым (Na2CO3) раствором проционового красного в течение 25 мин. при комнатной температуре. Далее их промывали дистиллированной водой, обезвоживали и бальзамировали. Приготовление постоянных препаратов проводили в Институте леса имени В.Н. Сукачёва Сибирского отделения Российской академии наук в лаборатории лесной генетики и селекции.
Просмотр микроскопических образцов осуществляли на микроскопе «Olympus», Япония.
Определение всхожести семян можжевельника сибирского в условиях in vitro. Изолированные зиготические зародыши можжевельника сибирского в стерильных условиях вводили на безгормональные агаризованные среды с минеральным составом по Мурасиге-Скугу, Шенке-Хильдебрандту, Уайту, Гамборгу, Литвай. Культивирование проводили при
температуре 25±1 °С, фотопериоде 16 часов день и 8 часов ночь при освещенности 3000 лк.
Преодоление глубокого физиологического покоя зародышей можжевельника сибирского in vitro. Способность прорастать семена приобретают при высокой концентрации индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), которая является гормоном естественного происхождения и накапливается в семенах к моменту их прорастания. Однако, в культуре in vitro ИУК редко применяют в качестве единственного ауксина: либо в сочетании с другими ауксинами синтетического происхождения, либо заменяют аналогами, устойчивыми к разложению в процессе автоклавирования и также не являющимися фитотоксичными.
Для выведения зародышей можжевельника сибирского из состояния глубокого физиологического
покоя применяли агаризованные питательные среды с добавлением гормонов ауксиновой природы: а-НУК, 2,4-Д, ИУК, ИМК, а-НУК+ИУК, ИМК+ИУК, 2,4-Д+ИМК в различных концентрациях и соотношениях. Культивирование проводили при температуре 25±1°С, фотопериоде 16 часов день и 8 часов ночь при освещенности 3000 лк.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Сравнение стадий развития зародышей можжевельника сибирского в зависимости от срока сбора шишек и места произрастания
В таблице 1 приведены стадии развития зиготиче-ских зародышей можжевельника сибирского в зависимости от срока сбора шишек и места произрастания.
Таблица 1- Стадии развития зиготических зародышей можжевельника сибирского в зависимости от срока сбора шишек и места произрастания
Место произрастания можжевельника сибирского
Дендрарий СибГТУ (пригород Красноярска)
Стационар Института леса СО РАН «Погорельский бор» (38-й км от г. Красноярска)
Богучанский район Красноярского края
Якутия (пойма р.Витим)
Эвенкия (поселок Суринда)
Состояние зародыша в зависимости срока сбора шишек
3 декада июля (шишки зеленые) Стадия позднего «торпедо», некоторые зародыши в стадии инициации семядолей
Стадия «торпедо»
Глобулярная и сердечковидная
стадии
Стадия «сердечко» и стадия раннего торпедо
Стадия «сердечко»
2-3 декада сентября
Зрелый зародыш
Стадия инициа-Стадия позднего ции семядолей
3 декада августа
Стадия инициации семядолей
«торпедо»
«Сердечко» и раннее «торпедо»
и зрелого зародыша Позднее «торпедо» и стадия инициации семядолей
Стадия «торпе- Стадия инициа-до» ции семядолей
Стадия «торпедо»
Стадия инициации семядолей
2-3 декада октября (шишки черно-синие)
Зрелый зародыш
Зрелый зародыш
Зрелый зародыш
Зрелый зародыш Зрелый зародыш
Характерным для всех зиготических зародышей можжевельника сибирского, шишки которого собраны в Красноярском крае, является достижение зародышем полной морфологической зрелости к концу октября. В это время шишки находятся в состоянии полной биологической зрелости, имеют темно-синюю окраску с сизым налетом. Зародыш с двумя семядолями, полностью занимает зародышевый канал, семядоли различимы невооруженным глазом. На рисунке 1 представлен срез зрелого семени можжевельника сибирского.
На рисунке 1 хорошо различимы две семядоли, отходящие от оси зародыша по бокам. Апикальная меристема (точка роста побега, или почечка), находится между семядолями и является верхушечной, или терминальной. На ней заложены зачатки следующих за семядолями листьев. На срезе хорошо заметны корневая меристема и корневой чехлик. Зародыш полностью сформирован и занимает практически весь зародышевый канал (коррозионную полость).
Рисунок 1- Срез зрелого семени можжевельника сибирского
Определение всхожести семян можжевельника сибирского в условиях in vitro
В течение периода культивирования зародышей можжевельника сибирского на безгормональных средах наблюдали морфогенетическую реакцию на двух питательных средах. На среде Уайта на 2530 сутки наблюдали позеленение семядолей. При дальнейшем культивировании на данной среде изменений не происходило. На питательной среде с минеральными солями по Гамборгу 5 % эксплантов отреагировали формированием ненормальных проростков, характеризующихся вздутием, а также за-
кручиванием гипокотиля в спираль и прекращением роста. Это показывает, что зародыши находятся в состоянии глубокого физиологического покоя и не способны давать нормальные проростки без экзогенного воздействия на них.
Преодоление глубокого физиологического покоя зародышей можжевельника сибирского in vitro
Результаты эксперимента по влиянию ауксинов на формирование проростков из зрелых зиготических зародышей можжевельника сибирского на среде Уайта представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Влияние ауксинов на формирование проростков из изолированных зиготических зародышей можжевельника сибирского на среде Уайта
Концентрация гормона, мг/л Общее число эксплантов, шт. Реакция экспланта Количество эксплантов, образовавших полноценные проростки, % Начало прорастания, сут.
Без гормонов 20 Позеленение семядолей без дальнейшего развития 0 -
а-НУК 0,1 20 Позеленение семядолей без дальнейшего развития 0 -
а-НУК 0,2 20 Позеленение семядолей, единичные проростки 10 25-30
а-НУК 0,3 20 Формирование проростков 45 20-25
а-НУК 0,4 20 Формирование проростков 60 20-25
а-НУК 0,5 20 Преобладание каллусообразова-ния, единичные проростки 5 20-25
2,4-Д 0,1;0,2; 0,3; 0,4; 0,5 20 Формирование каллуса 0 -
ИУК 0,9 20 Незначительное образование каллуса на семядолях 0 -
ИУК 1,1 20 Незначительное образование каллуса на семядолях 0 -
ИМК 0,1 ИМК 0,2 20 20 Нет реакции 0 0 -
ИМК 0,3 20 Позеленение семядолей 0 -
ИМК 0,4 ИМК 0,5 20 20 Разрастание семядолей и каллусо-образование 0 0 -
а-НУК+ИУК 0,2+0,2 а-НУК+ИУК 0,3+0,3 20 20 Формирование проростков 10 45 20-24 20-24
а-НУК+ИУК 0,4+0,4 20 Формирование проростков с частичным каллусо- образованием на семядолях 50 20-24
а-НУК+ИУК 0.5+0,3 а-НУК+ИУК 0,5+0,5 20 20 Преобладание каллусообразова-ния, формирование единичных 5 5 18-23 18-23
а-НУК+ИУК 0,5+0,8 20 проростков 5 18-23
ИМК+ИУК 0,2+0,25 20 Слабое позеленение семядолей 0 -
ИМК+ ИУК 0,3+0,2 20 0 -
ИМК+ ИУК 0,4+0,3 20 Позеленение семядолей 0 -
ИМК+ ИУК 0,5+0,3 20 0 -
ИМК+ ИУК 0,6+0,4 20 Позеленение семядолей и слабое каллусообразование 0 -
ИМК+ ИУК 0,7+0,5 20 Позеленение семядолей и каллу-сообразование 0 -
2,4-Д+ИМК 0,2+0,1 20 0 -
2,4-Д+ИМК 0,3+0,1 20 0 -
2,4-Д+ИМК 0,5+0,2 2,4-Д+ИМК 0,6+0,4 2,4-Д+ИМК 0,2+0,3 20 20 20 Позеленение семядолей и каллусообразование 000 -
2,4-Д+ИМК 0,2+0,4 20 0 -
2,4-Д+ИМК 0,3+0,5 20 0 -
Выбор питательной среды обусловлен следующими моментами: зрелые зиготические зародыши не нуждаются в усиленном питании, кроме того на высокосолевых средах их развитие замедляется, поэтому низкосолевая среда Уайта является более благоприятной для получения проростков из данного типа эксплантов.
Как видно из результатов таблицы 2, на безгормональной среде с минеральным составом по Уайту не происходило формирование проростков, наблюдали лишь позеленение семядолей. Добавление в среду ауксина 2,4-Д в концентрации от 0,1 до 0,5 мг/л приводило исключительно к каллусообразова-нию. Среда с ИУК в концентрации от 0,1 до 0,8 мг/л не оказала видимого влияния на экспланты. Однако при концентрации ИУК свыше 0,8 мг/л (от 0,9 до 1,1 мг/л) происходило незначительное образование каллуса на семядолях. Изолированные зародыши можжевельника сибирского на среде с ИМК в концентрации 0,4 и 0,5 мг/л проявляли реакцию в виде разрастания семядолей и образования каллуса на семядолях, концентрация ИМК от 0,1 до 0,2 мг/л не оказала видимого влияния на экспланты, при добавлении в среду 0,3 мг/л индолил-3-масляной кислоты наблюдали позеленение семядолей. Воздействие сочетания ауксинов 2,4-Д+ИМК в концентрациях
для 2,4-Д от 0,2 до 0,6 мг/л и для ИМК от 0,1 до 0,5 мг/л заключалось в позеленении семядолей экс-плантов и каллусообразовании, а сочетание гормонов ИМК+ИУК в концентрации от 0,2+0,25 мг/л до 0,7+0,5 мг/л проявлялось в реакции эксплантов от позеленения семядолей до каллусообразования. Комбинация гормонов а-НУК+ИУК в различных концентрациях способствовала формированию проростков, однако помимо этого наблюдали и образование каллуса, что является нежелательным эффектом. Питательная среда с добавлением а-НУК в концентрации 0,4 мг/л оказалась самой благоприятной для формирования полноценных проростков можжевельника сибирского; количество эксплантов, образовавших полноценные проростки составило в среднем 60 %. Концентрации данного ауксина меньше 0,4 мг/л менее эффективны для выведения зародышей можжевельника сибирского из состояния глубокого физиологического покоя, а добавление в среду а-НУК более 0,4 мг/л вызывало каллусообра-зование на семядолях.
На рисунке 2 представлены проростки, полученные из зрелых зиготических зародышей можжевельника сибирского, находящихся в состоянии глубокого физиологического покоя.
Рисунок 2 - Проростки можжевельника сибирского, полученные на среде Уайта с 0,4 мг/л а-НУК
Полученные результаты позволяют утверждать, что питательная среда с минеральными солями по Уайту с добавлением гормона ауксиновой природы -а-НУК в концентрации 0,4 мг/л является наиболее благоприятной для достижения поставленной цели -преодоления глубокого физиологического покоя зародышей можжевельника сибирского. Об этом свидетельствует интенсификация процессов прорастания зародышей в полноценные проростки (в среднем около 60 % эксплантов дают положительный отклик). Эта технология в дальнейшем может представлять альтернативу традиционной стратификации и смело конкурировать с ней.
Необходимо отметить, что при решении задачи о целесообразности использования эмбриокульту-
ры как метода преодоления покоя зародышей можжевельника сибирского в качестве эксплантов использовали не только изолированные зиготические зародыши, но и семена с мегагаметофитами. В процессе эксперимента убедились, что мегагаметофиты значительно замедляют процесс прорастания семян, что подтвердило необходимость использования в качестве эксплантов изолированных зародышей, которые значительно активнее реагировали на состав питательной среды и экзогенные гормональные факторы.
Кроме того, исследование микротомных срезов семян можжевельника сибирского не подтвердило напрямую явления недоразвитости зародышей. Однако
важным явился тот факт, что к моменту полного созревания зародышей, последние впадают в глубокий физиологический покой, преодоление которого является необходимым условием для размножения можжевельника сибирского.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Воробьев, Д.П. Дикорастущие деревья и кустарники Дальнего Востока [Текст]/ Д.П. Воробьев. - Л., 1987. - 277 с. Носов, А.М. Лекарственные растения [Текст]/ А.М. Носов.
М.: ЭКСМО-Пресс, 2001. - 350 с. 3 Муха.медтттин, К.Д. Можжевеловые леса [Текст]/ К.Д. Му-
хамедшин, Н.К. Таланцев. Лесн.пром-ть, 1982. - 184 с. Рубаник, В.Г. Развитие шишек J.virginiana L. и J.communis L. в Алма-Ате [Текст]/ В.Г. Рубаник, Т.А. Жеронкина // Бот. ж. - 1969. - Т. 54. - № 3. - С. 464-Бакланова, Е.Г. Можжевельник обыкновенный на Среднем Урале // Ботанические исследования на Урале: информационные материалы. Свердловск: УрО АН СССР, 1988. - С. 10-11. Барзут, О. С. Эколого-географические особенности можжевельника обыкновенного в Архангельской области // География Европейского Севера. Проблемы природопользования, социально-экономические, экологические: Сб. науч. трудов / отв. ред. Н. М. Бызова. Архангельск, 2002. С. 185 - 193. Харламова, С. В. Размножение можжевельника обыкновенного в Республике Марий Эл: Автореф. дис. ... канд. с.-х. наук. Йошкар-Ола: МарГТУ, 1997. - 23 с.
Истратова, О. Т. Размножение можжевельников // Труды Сочинской научно-исследовательской опытной станции субтропического лесного и лесопаркового хозяйства. М.: Лесн. пром-сть, 1968. Вып. 5. С. 90-114.
Мухамедшин, К.Д. Арча. М.: Лесная пром-ть, 1980. 96 с.
Николаева, М.Г. Физиология глубокого покоя семян. Л.: Наука, 1967.
Иванова, З.Я. Декоративные кустарники для Новосибирской области и способы их размножения. Новосибирск: Западно-Сибирское книжное издательство, 1974.
Tigabu M, Fjellstrom J, Oden PC, Teketay D. Germination of Juniperus procera seeds in response to stratification and smoke treatments, and detection of insect-damaged seeds with VIS + NIR spectroscopy // New Forest. 2007. V. 33. P. 155-169.
Al-Ramamneh Ezz AL-Dein, Dura S., Daradkeh N. Propagation physiology of Juniperus phoenicea L. from Jordan using seeds and in vitro culture techniques: Baseline information for a conservation perspective // African Journal of Biotechnology. 2012. V. 11(30). P. 7684-7692.
Паушева, З.П. Практикум по цитологии растений [Текст]/ З.П. Паушева. - М.: Колос, 1970. - 255 с.
Прозина М.Н. Ботаническая микротехника. М.: Высшая школа, 1960. - 206 c.
Иванов, В.Б.. Одновременная окраска белков и углеводов проционовыми красителями/ В.Б. Иванов, Т.К Литин-ская // Цитология.- 1967. - Т.9. - №9. - С. 1163-1165.
Иванов В.Б. Активные красители в биологии. М.: Наука, 1982. - 214 с.
Поступила в редакцию 16.02.15 Принята к печати 10.05.16
