CC BY
67
36
раздел БИОЛОГИЯ, ЭКОЛОГИЯ и МЕДИЦИНА
УДК 581.143.6
КУЛЬТУРА ЗАРОДЫШЕЙ PAEONIA ANOMALA L. (PAEONIA CEAE)
© А. А. Зарипова 1а, И. Ф. Шаяхметов 2, Р. К. Байбурина 1
I Ботанический сад-институт Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, г. Уфа, 450080, ул. Полярная, 8.
Тел./факс: +7 (347) 228 13 55.
E-mail: zaripova. al@mail. ru 2 Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, г. Уфа, 450074, ул. Фрунзе, 32.
Тел./факс: +7 (347) 273 6712.
Разработана технология культивирования in vitro зародышей Paeonia anomala L., позволяющая сократить период прорастания семян, что приводит к ускорению размножения этого вида.
Ключевые слова: Paeonia anomala, зародыши, культура in vitro.
Пион уклоняющийся, Paeonia anomala Ь. (сем. Paeoniaceae) - редкое лекарственное растение, находящееся под угрозой исчезновения, численность особей которого уменьшилась до критического уровня [1-3]. Лимитирующими факторами являются рубки леса, выпас скота в лесах и лугах, выкапывание корневищ населением, а также длительное прорастание семян.
Возобновление вида в природных условиях и размножение в интродукционной культуре затруднено в связи с медленным прорастанием семян (2-3 года). Семена P. anomala имеют недоразвитый зародыш, который отличается очень низким содержанием физиологически активных веществ и слабой активностью ферментов [4-6]. Кроме того, у P. anomala наблюдается продолжительный прегенера-тивный период развития особей [7], связанный с морфофизиологическим глубоким эпикотильным типом покоя [8, 9].
С целью сохранения и воспроизводства генофонда редких и исчезающих видов растений перед нами была поставлена задача разработать технологию ускоренного размножения P. anomala с использованием метода эмбриокультуры.
Материалом для работы служили семена P. anomala, собранные с растений, произрастающих в Татышлинском районе республики Башкортостан. Эксплантами являлись изолированные зародыши зрелых семян, которые не вступили в период покоя.
Приготовление и стерилизацию питательных сред для культивирования тканей и органов P. anomala проводили согласно предложенным рекомендациям [10, 11].
Перед извлечением зародышей проводили стерилизацию семян по следующей схеме: семена отмывали в мыльном растворе в течение 15 мин, затем промывали проточной водой в течение 10 мин., ополаскивали дистиллированной водой, далее в ламинар-боксе выдерживали в 70%-ном этаноле в течение 1 мин, в 3%-ном растворе перекиси водорода в течение 5 мин., в 0.1%-ном растворе диацида в течение 20 мин., промывали дистиллированной водой 3 раза по 15 мин.
Зародыши вычленяли из семян в асептических условиях ламинар-бокса на поверхности стерильной бумаги. Вдоль семени ближе к халазальному концу делали небольшой надрез семенной кожуры и окружающих зародыш тканей (эндосперм) при помощи ланцета. Затем зародыш извлекали и немедленно помещали в пробирки с питательной средой для избегания подсыхания. Зародыши выделяли осторожно, чтобы не повредить их, так как незначительные повреждения отрицательно сказывались на их развитии в культуре in vitro. В течение первых трех-четырех недель пробирки с зародышами находились в темноте при 26°C и относительной влажности воздуха 70%. После образования первичного корешка длиной 2-3 см проростки выставляли на светоплощадку с люминесцентными лампами 3000 лк и температурой 26°С.
Для изучения влияния различных добавок на рост и развитие изолированных зародышей P. anomala использовали среды Уайта, Хеллера и Му-расиге-Скуга с сахарозой, глюкозой и различными добавками стимулирующих рост веществ: индоли-луксусной кислотой (ИУК), индолилмасляной кислотой (ИМК), а-нафтилуксусной кислотой (НУК), 6-бензиламинопурина (БАП), кокосового молока, дрожжевого экстракта, гидролизата казеина. В наших опытах все вышеперечисленные добавки приводили чаще всего к аномальному развитию зародыша. Наибольшая тератология наблюдалась на средах с ауксинами и дрожжевым экстрактом. При этом корневая система покрывалась каллусной тканью, чрезмерно разрастался гипокотиль, семядоли и почка также очень часто образовывали каллус-ную ткань. Добавление в питательную среду сахарозы приводило к более интенсивному росту по сравнению с использованием глюкозы. К тому же экономически выгоднее использование сахарозы. Развитие зародышей шло нормально на простой минерально-сахарозной среде Хеллера и с половинной концентрацией минеральных солей среде Мурасиге-Скуга. Всю последующую работу мы проводили с использованием % состава минеральной среды Мурасиге и Скуга с 2% сахарозы и 0.6% агара.
Вестник Башкирского университета. 2007. Т.12, №4
37
Были проведены исследования по влиянию глубины погружения зародышей P. anomala в питательную среду. Опыты показали, что при помещении зародышей на глубину 0.4-0.5 см от поверхности среды они гибнут через два пассажа, т. е. через 42-45 дней. Если зародыши помещали на поверхности среды, они засыхали. Оптимальное положение зародыша - это частичное погружение в питательную среду на 0.1-0.2 см. Полученные нами результаты согласуются с данными Т. Б. Батыгиной и Р. Г. Бутенко [12].
Таблица 1.
Влияние размера экспланта на жизнеспособность зародышей Paeonia anomala Ь.
Зародыши группировали по размерам: от 0.3 до 0.4 мм и от 0.5 до 0.6 мм. Жизнеспособность зародышей зависела от их размера при инокуляции (табл. 1). Хорошо сформированные растения были получены из зародышей размером от 0.5 до 0.6 мм. Присутствие в питательной среде Мурасиге и Ску-га фитогормонов не являлось обязательным условием формирования растений из зародышей (табл. 2). Тем не менее, среда с низкими концентрациями цитокинина и ауксина также способствовала развитию зародыша.
Таблица 2.
Влияние регуляторов роста на развитие зародышей Paeonia anomala L. в культуре in vitro.
Примечание: «+» - активное развитие, «±» - слабое развитие, «-» - деформированный проросток (различные нарушения в развитии).
Нормальный ход развития изолированных зародышей P. anomala на среде Мурасиге и Скуга с половинной концентрацией минеральных солей без гормонов выглядит следующим образом. На 5-7 сутки после вычленения зародыша раздвигались семядоли; на 12-14 сутки появлялся корешок; на 25-30 сутки корешок достигал 1.5-2.0 см длины, увеличивались семядоли. После переноса проростков в условия фотопериода через месяц начиналось
позеленение семядолей. Через 40 суток появлялась почка, корешок достигал 3-5 см длины.
В культуре изолированных зародышей P. anomala мы получали интенсивное развитие зародышей, активный рост их корневой системы, гипо-котиля и семядолей, но верхушечная почка проростка, при принятых условиях выращивания (температура 26°С), оставалась в состоянии покоя.
Для выведения из покоя верхушечной почки проростков нами использовано влияние пониженных температур и гибберелловой кислоты. При воздействии низкими положительными температурами (5-6°С) и добавлении в питательную среду гибберелловой кислоты в концентрации 1.0 мг/л первый лист появился через один месяц культивирования in vitro, в то время как контрольные растения оставались в семядольном состоянии.
Таким образом, разработанная технология включает асептическое вычленение зародыша, выращивание его на питательной среде Мурасиге и Скуга с половинной концентрацией минеральных солей и выведение из покоя верхушечной почки проростка с применением низких положительных температур и гибберелловой кислоты. Использование метода эмбриокультуры сокращает период прорастания и развития зародышей, что позволяет получить растения P. anomala через 1.5-2 месяца после вычленения и культивирования зародышей на искусственной питательной среде вместо 1-2 и более лет при обычном посеве семян в грунт.
ЛИТЕРАТУРА
1. Мулдашев А. А, Кучеров Е. В, Галеева А. Х. Об охране и рациональном использовании флоры и растительности в северной зоне Башкортостана // Вопросы рационального использования и охраны растений в республике Башкортостан. Уфа: Гилем, 1998. С. 5-18.
2. Мулдашев А. А., Галеева А. Х., Маслова Н. В. Проблемы охраны пиона уклоняющегося (Paeonia anomala L.) в республике Башкортостан // Проблемы сохранения биоразнообразия на Южном Урале. Уфа: Гилем, 2004. С.
3. Красная. книга республики Башкортостан. Т. 1. Редкие и исчезающие виды высших сосудистых растений. Уфа: Ки-тап, 2001. - 280 с.
4. Цингер Н. В. // Тр. Гл. Бот. сада. 1951. Т. II. С. 103-145.
5. Валишина В. П., Цингер Н. В. // Бюлл. ГБС. 1952. Вып. 13. С. 45-47.
6. Попцов А. В., Некрасов В. И., Иванова И. А. Очерки по семеноведению. М.: Наука, 1981. С. 1-113.
7. Игнатьева И. П. // Изв. ТСХА. 1995. Вып. 4. С. 108-134.
8. Николаева М. Г. // Физиология семян. М.: Наука, 1982. С. 125-183.
9. Николаева М. Г., Разумова М. В., Гладкова В. Н. Справочник по проращиванию покоящихся семян. Л.: Наука, 1985. С. 1-347.
10. Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964. - 272 с.
11. Калинин В. Ф., Сарнацкая В. В., Полищук В. Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. М.: Наук. думка, 1980. - 488 с.
12. Батыгина Т. Б., Бутенко Р. Г. // Ботан. журн. 1981. Т. 66. № 11. С. 1531-1547.
Поступила в редакцию 05.07.2006 г.
Поступила в редакцию после доработки 31.10.2007 г.
№ п/п Размер Жизнеспо- Нежизнеспо-
зародыша, мм собные, % собные, %
1. 0.3 - 0.4 40 і 3.2 60 і 4.7
2. 0.5 - 0.6 80 і 6.7 20 і 1.2
№ п/п Концентрация ауксинов, мг/л Концентрация БАП, мг/л Развитие проростка
1. 0 0 +
ИМК 0.01 0.1 +
2. 0.01 0.3 і
0.01 0.5 -
ИУК 0.01 0.1 і
3. 0.01 0.3 -
0.01 0.5 -
НУК 0.01 0.1 і
4. 0.01 0.3 -
0.01 0.5 -
