CC BY
90
УДК 630*161.6: 582.475.2: 631.532
ОСОБЕННОСТИ РОСТА ЭМБРИОГЕННОГО КАЛЛУСА И ПОЛУЧЕНИЕ СОМАТИЧЕСКИХ ЗАРОДЫШЕЙ У КЕДРА СИБИРСКОГО
И.Н. Третьякова, М. В. Ижболдина
Институт леса им. В.Н.Сукачева СО РАН 660036 Красноярск, Академгородок, 50; е-mail: culture@ksc.krasn.ru
Инициация эмбриогенного каллуса и получение соматических зародышей у кедра сибирского проводилась с использованием мегагаметофитов и незрелых зиготических зародышей на разных стадиях их развития. Культивирование осуществлялось на среде МС с гормонами 2,4 -Д, БАП и АБК. Успешность соматического эмбриог е-неза была связана с генотипом дерева и зависела от стадии развития экспланта.
Ключевые слова: соматический зародыш, эмбриогенный каллус, кедр сибирский, мегагаметофит
Induction of embryogenic callus and the getting somatic embryos of Siberian pine has been conducted with meg a-gametophytes and immature zygotic embryos at different stages its development. Culturing was made on MS medium with hormones 2,4-D, 6-BA and ABA. Success of somatic embryogenesis of Siberian pine connected with tree genotypes and depends on the stage of explants development.
Key words: somatic embryo, embryogenic callus, megagametophyte
ВВЕДЕНИЕ
Кедр сибирский (Pinus sibirica Du Tour) является одним из основных лесообразователей в горах Южной Сибири. За последние годы этот единственный орехоносный вид в данном регионе подве р-гается хищническому истреблению из-за антропогенной нагрузки. Вместе с тем половая репродукция кедра сибирского характеризуется рядом особенностей, затрудняющих его возобновление :
- процесс созревания семян характеризуется длительным репродуктивным циклом (27 мес.);
- семена являются полиэмбриональными, отн о-сятся к труднопрорастаемым и требуют стратификации (4-7 мес.);
- в природных популяциях кедра сибирского встречаются отдельные уникальные гетерозисные генотипы деревьев, у которых наблюдается сильная акселерация генеративного цикла (от опыления до оплодотворения проходит 2 мес., вместо 1 года, наблюдаемого в норме). Однако размножение таких гетерозисных форм естественным путем невозмо ж-но из-за отсутствия зародыша вследствие гамет о-фитной несовместимости (Третьякова, 1990).
Для регуляции эмбриональных процессов, направленных на преодоление стерильности семян и выращивание полноценных сеянцев у кедра сиби р-ского, наиболее перспективным способом является использование микроклонального размножения в культуре in vitro и особенно путем соматического эмбриогенеза. Разработка биотехнологии соматич е-ского эмбриогенеза и получение соматических зародышей у кедра сибирского до сих пор не пров о-дилась.
Соматический эмбриогенез - это асексуальный
*Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 06-04-08040 ОФИ; ККФН и РФФИ № 07-0496810
способ размножения, основанный на тотипотентн ости растительных клеток, был открыт 20 лет назад у Picea glaucа (Durzan et al, 1987). Этот феномен побуждает на исследование процессов дифференц и-ровки и дедифференцировки растительных клеток, закономерностей детерминации в раннем онтоген е-зе. Эмбриогенные клеточные линии сохраняют компетентность длительный период времени и п о-зволяют получить генетически однородный селе к-ционный материал улучшенных форм и проводить их массовое тиражирование. Клональное размн о-жение хвойных через соматический эмбри огенез является одним из перспективных направл ений в решении проблем лесовосстановления.
К настоящему времени эмбриогенный ка ллус у хвойных был получен у 16 видов р ода Pinus, у 11 видов рода Picea, у 4 видов и 2 гибридов рода Abies, у 6 видов и гибридов рода Larix, а также у Pseudotsuga menziesii (Klimaszewska,. Cyr, 2002). В качестве источника соматических клеток, для и н-дукции соматического эмбриогенеза у хвойных, использовались мегагаметофиты, зрелые и незр е-лые зародыши и их отдельные органы (семядоли и гипокотиль), хвоя молодых растений (Lelu et al, 1994), а также сегменты вегетативных побегов взрослых деревьев (Malabadi, Staden, 2005). В данной статье впервые приводятся результаты иссл е-дования по индукции соматического эмбриогенеза из мегагаметофитов и изолированных незрелых зиготических зародышей кедра сибирского и ц и-тологический контроль этого процесса.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объекты исследований. Деревья кедра сибирского произрастают в естественном древостое З а-падного Саяна и на клоновых прививочных пла н-тациях Западно-Саянского опытного лесного хозяйства (с. Ермаковское Красноярского края). Для
взятия образцов использовались 8 дерев ьев-доноров №№ 1т, 2т, 8, 277/22 и три клона: 26, 28, 22 (черенки взяты с дерева 277/22) - свободноопылен-ные и 22х1А - клон 22, опыленный пыльцой материнского гетерозисного дерева с однолетним циклом развития женских шишек (№ 1А). Возраст деревьев из естественного древостоя с оставил 100-110 лет, на клоновых плантациях - 14 лет. Со всех опытных деревьев производился сбор шишек в ра з-ные периоды их развития (начиная с периода опл о-дотворения до полного развития с емян).
Растительный материал. В качестве экс-
плантов для индукции соматического эмбриоген е-за использовались мегагаметофиты и зиготические зародыши на разных стадиях их формирования (см. табл.), полученных в результате свободного опыления и при контролируемом опылении. Мег а-гаметофиты извлекали из семян и стерилизовали гипохлоритом натрия или раствором йода с 90% спиртом (1:3), с последующим трехкратным промыванием в стерильной дистиллированной воде. Зародыши извлекали из мегагаметофитов в стерильных условиях и помещали на питательную среду.
Таблица - Стадии эмбриогенеза зиготического зародыша в период сбора шишек (дата оплодотворения - конец
Стадия развития Размер зародыша Продолжительность развития после оплодотворения (нед.)
Оплодотворение. Проэмбрио Ранний эмбриогенез 0 1 нед.
- кливаж 4-16 клеток 2 нед.
- глобулярное эмбрио Поздний эмбриогенез 0,5-1 мм 4-5 нед.
- стадия торпедо 1,5-2 мм 6 нед.
- предсемядольная стадия 3 мм 7-8 нед.
- формирование оси зародыша 4 мм 8-9 нед.
Зародыш семян в период созревания шишки 5-10 мм 10-12 нед.
Зрелый зародыш (окончание периода стратиф и-кации) 11-12 мм 16-17 нед.
Методика получения соматических зарод ы-шей у хвойных включает ряд п оследовательных стадий, требующих определенного состава сред и гормональных добавок: инициация эмбриогенного каллуса (ЭК), пролиферация ЭК и созревание с о-матических зародышей. Эти стадии разли чаются по длительности и условиям культивирования.
Для получения эмбриогенного каллуса из ме-гагаметофитов и зиготических зародышей испол ь-зовались базовая среда МБ (Мига8Ы§е, Бкоо§, 1962) и % МБ (среда МБ с уменьшенным вдвое содержанием макроэлементов), с добавлением мезоинозита (0,1 г л-1), Ь-глютамина (1,45 г л-1), фитогормонов: 2,4-Д (0,5-2 мг л-1) и 6-БАП (0,51,01 мг л-1), сахарозы (30 г л-1), а также агара (7 г л-1) или Ое1гйе (4 г л-1). Для пролиферации эмбриональной массы концентрация 6 -БАП, 2,4-Д и сахарозы снижалась в 2-4 раза. Культивирование проводилось в темноте. Для перехода соматических зародышей к созреванию были использованы безгормональные базовые среды с активирова н-ным углем (1 %) в течение 1 нед. на свету. Кул ь-тивирование осуществлялось при 16-часовом фотопериоде и температуре 24±1 °С. Для созревания соматических зародышей в среды добавлялись мезоинозит (0,1 г л-1), Ь-глютамин (1,45 г л-1), 2,4-Д (2 мг л-1) и АБК (5-15 мг л-1), сахароза (34 г л-1), а также агар (7 г л-1).
Цитологический анализ
Для проведения цитологического анализа и с-пользовались давленые препараты. Окраска эк с-плантов проводилась сафранином с добавлением капли метиленового синего (Паушева, 1980). Пр осмотр микроскопических образцов осуществлялся на микроскопе МБИ-6. Замеры клеток и эмбриональных структур проводились при помощи ок у-
ляр-микрометра с последующим переводом пол ученных единиц в мкм.
Статистическая обработка данных
Для сравнения интенсивности прироста калл уса проводилось еженедельное измерение объема каллуса по формуле
V=2/3 nSLh,
1)
где V - объем экспланты, мм3;
S - ширина экспланты, мм;
L - длина экспланты, мм; h - высота экспланты, мм.
Статистическая обработка данных провод и-лась по стандартным методикам (Лакин, 1973 ) при помощи программы Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Получение эмбриогенного каллуса из зигот и-ческих зародышей сосны сибирской
Введение в культуру мегагаметофитов кедра сибирского на стадии оплодотворения, проэмбрио и кливажа показало, что на 12 - 15-е сут. культивирования на микропиллярном конце гаметофита происходило формирование каллусной массы у 3 -5 % эксплантов. В течение 3-5 нед. происходил активный рост каллуса - первоначальная масса экспланта увеличилась в 4-8 раз (рис. 1а). При введении в культуру незрелых изолированных з а-родышей на глобулярной стадии развития наблюдалось образование эмбриогенного каллуса только в 7-10 % случаев (рис. 1б).
Наиболее активное формирование эмбриоге н-ного каллуса шло на пре дсемядольной и более
поздних стадиях развития, когда длина зиготич е-ского зародыша составляла 3-4 мм, т.е. зародыш занимал % длины коррозийной полости (конец июля - начало августа). Морфологический отклик эксплантов, введенных в культуру, был уже заметен через 4-8 сут., который выражался в формиро-
вании эмбриогенного каллуса (ЭК) по всей длине зародыша. Инициация ЭК активно шла на среде МБ. На данной среде на 30-й день инициации объем эмбриогенного каллуса составил 880 - 1430 мм3 (рис. 2).
Рисунок 1 - а - Неэмбриогенный каллус из апикальной части мегагаметофита сосны с ибиркой; б - Эмбриогенный каллус и соматические зародыши, полученные из зиготическ ого зародыша сосны сибирской
срок культивирования, дней
-Д28
-277/22
-22
-26 -ж-22*а
- т1
-т2-------д8
Рисунок 2 - Динамика роста эмбриогенного каллуса, полученного из зиготических зародышей разных г е-нотипов сосны сиби рской
Полученный ЭК поддерживался на пролифер а-ционных средах (МБ) без потери пролиферацио н-ной активности. На протяжении всего срока кул ь-тивирования происходил интенсивный п рирост ЭК, объем которого за 3-4 мес. составил 14000 - 20000 мм3. Пролиферационная активность у кедра сиби р-ского сохранялась в течение 12 и более мес яцев, и в ЭК шло интенсивное образование сомат ических зародышей.
Влияние генотипа дерева (клона) - донора на инициацию и пролиферацию соматического эмбриогенеза сосны сибирской
Наблюдения за динамикой роста эмбриогенн ого каллуса на среде МБ показали, что процессы инициации и пролиферации каллуса у разных ген о-типов идут неодинаково (рис . 2). Прежде всего, выделились 3 дерева, произрастающих в естестве н-ном древостое Западного Саяна (№№ 1т, 2т и 8), у которых за 30 сут. инициации объем эмбриогенного
каллуса не превышал 250-380 мм , т.е. составил в 23 раза меньшую величину по сравнению с остал ь-ными опытными деревьями. Пролиферация каллуса у этих деревьев шла еще более медленным темпом. Следовательно, указанные деревья не способны формировать эмбриогенный каллус и в дальнейшем соматические зародыши. Остальные 5 опытных деревьев формировали эмбриогенный каллус с ра зной степенью активности. Через 30 сут. культив и-рования (конец инициации) объем эмбриогенного каллуса превышал 1100 мм3 (клон 28). Высокой эмбриогенной активностью обладали дер ево № 277/22 и клон, полученный от этого дерева (№ 22), а также клон № 26. Образование ЭК клона 22х1А (клон дерева 277/22, опыленного пыльцой гетер о-зисного дерева 1А с однолетним генеративным циклом) шло менее активно. Объем эмбриогенного каллуса составил 420 мм3.
При пересадке на среду МБ с уменьшенным вдвое содержанием фитогормонов процесс пролиферации эксплантов указа нных деревьев шел также быстрым темпом. Динамика роста эмбриогенного каллуса у всех опытных деревьев кедра сибирского сохранялась. Через 50 сут. культивирования прол и-ферирующие эмбриогенные каллусы распадались на ряд отдельных кусочков, которые продолжали активно расти при последующих пересадках .
Таким образом, обнаруживается значительное влияние генотипа донорского дерева кедра сиби р-ского на рост эмбриогенного каллуса и образ ование в нем соматических зародышей.
Заслуживает внимания тот факт, что введение зародышей семян, полученных от одной шишки дерева № 277/22, показало сильную гетерогенность образования и роста эмбриогенного каллуса в пр е-
делах одной шишки (рис. 3). Вероятно, такая разно-качественность образцов эмбриогенного каллуса в пределах одной шишки свидетельствует о сильном влиянии пыльцы, полученной от разных отцов (д е-ревьев - опылителей).
Вызревание соматических зародышей кедра сибирского
Через 2-3 месяца культивирования экспланты поэтапно переводились из пролиферационной среды на безгормональную среду с добавлением акт и-вированного угля (1 нед.), а затем помещались на среду МБ, содержащую АБК (концентрация 5-15 мг/л). Пробирки выставлялись на свет и проводились наблюдение за появлением соматических з а-родышей. Через 2 нед. культивирования в данной среде на поверхности эмбриогенного каллуса отм е-чались появление зародышей с семядолями. На одном каллусе длиной 1,5-2 см образовывалось до 10-20 соматических зародышей. Через 1 -2 мес. пребывания в данной среде соматические зародыши переносились в среду для проращивания.
"г 60000
50000 О 40000 Е 30000
Я 20000 °10000 0
Время со дня посадки, дни
♦ Экстент 1 —■—Эксплaнт 2 —Д—Экстент 3
—■—Экстент 4 —Ж—Эксплaнт б —•— Экстент б
Рисунок 3 - Рост эмбриогенного каллуса из эксплан-тов одной женской шишки генотипа 277/ 22 (свободное опыление)
Цитология возникновения эмбриогенного каллуса и соматических зародышей
Цитологический анализ показал, что при введ е-нии в культуру мегагаметофитов на стадии оплод о-творения, проэмбрио и начала внедрен ия зародыша в зародышевый канал, клетки, составляющие каллус, были однородными, без всяких признаков дифференциации.
При введении зиготических зародышей на с е-мядольной и последующих стадиях развития в культуру через 3 -7 дней начиналось активное удл и-нение клеток по всей длине зародышевого к орешка (рис. 4а). Через 10-12 дней длина клеток составляла 160-190 мкм по сравнению с исходной 30-70 мкм. Такие клетки похожи на эмбриональные тру бки первичного суспензора зиготического зар одыша (рис. 4б). Эти клетки подвергались ассиме тричному делению и образовывали две клетки: одну маленькую - эмбриональную, другую длинную - эмбриональную трубку. Оба типа клеток активно дел и-лись, формируя эмбриональные глобулы (б удущие соматические зародыши) (рис. 4В), которые со всех сторон были окружены длинными клетками, в ы-полняющими гаусториальную функцию.
К концу инициации эмбриогенный каллус
0 бб 100 107 114
представлял собой эмбрионально-суспензорную массу. Он состоял из эмбриональных глобул и эмбриональных трубок. Эмбриональные глобулы и трубки подвергались кливажу, их число значительно увеличивалось в период пролиферации, и через 40-50 дней в пролиферирующем эмбриоге нном каллусе возникали торпедообразные соматические зародыши. При переносе такого каллуса на безго р-мональную среду эмбриональные трубки отмирали, а торпедообразные соматические зародыши начинали увеличиваться в размерах и в них четко выделялась эмбриональная ось.
При переносе эмбриогенного каллуса на ср еду с АБК соматические зародыши приобретают четкую биполярную структуру: на одном из полюсов зародыша происходит образование ап екса побега и семядолей, а на другом - апекса корешка. Через 812 нед. соматические зародыши появляются на п о-верхности каллуса (рис. 4Г).
Эмбриогенный каллус был индуцирован у 16 видов сосен, из которых только у половины были получены соматические зародыши и растения реге-неранты. Соматические зародыши были пол учены у P. caribaea (Laine, David, 1990), P.elliottii (Newton et al 1995), P. lambertiana (Durzan, Gupta, 1987), P. nigra (Salajova et al 1995), P. palustris (Nagmani et al 1993), P. patula (Jones, Staden 1995), P. sylvestris (Keinonen-Mettala et al 1996), P. taeda (Becwar et al 1990; Litvay et al 1985), P pinaster (Bercetche, Paques, 1995), P. koraiensis (Bozhkov et al 1997), P. strobus (Finer et al 1989).
На среде с ауксинами и цитокининами частота регенерации эмбриогенного каллуса у Pinus была низкой и колебалась у P. taeda от 2 до 9 %, у P. pinaster эта частота составила 15 % (Bercetche, Paques, 1995), а у P. strobus (Finer et al 1989) составила 52,9 %. У изучаемых генотипов кедра сибирского процесс инициации эмбриогенного каллуса наблюдался у 58 % эксплантов. Однако активное образование эмбриогенного каллуса шло только у трех из восьми генотипов, у которых через 2-3 месяца культивирования наблюдалось образование соматических зародышей.
Образование ранних соматических з ародышей напоминает процесс кливажной эмбрионии, ярко выраженной у зиготических зародышей сосен, в том числе и кедра сибирского (Третьякова, 1990; Singh, 1978). У последнего эмбриональные инициа-ли зародыша, полученные от одной оплодотвор ен-ной яйцеклетки, распадаются на четыре иденти ч-ных эмбриональных единицы, каждая из кот орых дает начало четырем зародышам-близнецам. Простая и кливажная полиэмбрионии широко распр о-странены у хвойных растений ( Durzan, Gupta, 1987). По мнению Сарваса (Sarvas, 1962), этот феномен служит для компенсации стерильности, к о-торая у P. sylvestris составляет 27 %. При самоопылении число стерильных семян значительно увел и-чивается (Koski, 1991), а при климатической флуктуации может достигать 100% (Носкова, Третьяк о-ва, 2004).
Имеются данные о том, что наблюдается наиболее эффективное получение соматических зар о-
дышей при введении в культуру in vitro эксплантов P. strobus на стадии кливажа и посткливажной стадии развития (Klimaszewska, Cyr, 2002). Однако у кедра сибирского при введении в культуру зигот и-ческих зародышей на более поздних стадиях разв и-тия, начиная со стадии инициации семядолей и до полного завершения морфогенеза (стадия опадения
женских шишек), шло активное образование ЭК и соматических зародышей. Вероятно, в растительных клетках архивировано наличие кливажа, который в силу тотипотентности клеток реализуется в пролиферирующих каллусах путем активного дел е-ния эмбриональных клеток (глобул) и эмбрионал ь-ных трубок под действием го рмонов.
к
Г 1 см
Рисунок 4 - Цитологический анализ эмбриог енного каллуса кедра сибирского: А - Клетки на этапе инициации через 7 день культивирования; Б - Эмбриональные трубки через 17 дней культивирования; В - Цитологическая структура эмбрионально-суспензорной массы, состоящая из эмбриональных трубок (с) и изодиаметрических э м-бриональных(и) клеток (фрагмент); Г - Соматический зародыш, полученный из каллуса зиготич еского зародыша, З - соматический зародыш, К - каллусная масса
Экспериментальным путем было показано, что индукция и регенерация соматических зарод ышей у кедра сибирского, так же как у других видов хвойных - процесс многоступенчатый, включающий применение разнообразных химических с о-единений и многочисленных гормональных пр е-добработок, так же как у других видов хвойных (Белоруссова, Третьякова 2008). Наиболее пр о-блематичным остается стадия созревания сомат и-ческих зародышей. В опытах культивирования зиготических зародышей представителей сосен этот процесс шел на средах с высокой концентр а-цией АБК (120 рМ) (Ьеіи, 1994). В экспериментах с кедром сибирским использовалось АБК в знач и-тельно меньших концентрациях (40-60 рМ), при этом возникали единичные соматичес ких зародыши. При использовании более высоких концентр а-ций АБК наступал некроз эмбриогенн ого каллуса. В настоящее время нами проводятся исследов ания
по совершенствованию биотехнологии пол учения соматических зародышей кедра сибирского.
Таким образом, у кедра сибирского впервые были получены эмбриогенный каллус и соматич е-ские зародыши из незрелых половых зародышей. Успех получения соматических зародышей был связан с генотипом дерева - донора. Следовательно, для инициации эмбриогенного каллуса и пол учения соматических зародышей необходимо пр о-ведение, прежде всего, отбора генотипов, обл а-дающих повышенной способностью к регенер а-ции. При этом наиболее перспективным направл е-нием является проведение работ по гибридизации с использованием улучшенных материнских и о т-цовских деревьев, дающих высокопродуктивное потомство. Проведение работ по введению ги б-ридных зародышей в культуру in vitro, получение из них эмбриогенного каллуса, соматических з а-родышей и растений - регенерантов будет спосо б-
з
ствовать получению высокопродуктивных чистых линий (может быть даже сортов) кедра сибирск ого, единственного орехоносного вида в Сибири, для коммерческого плантационного выращивания.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Белоруссова, А.С. Особенности формирования соматич е-ских зародышей у лиственницы сибирской: эмбриологические аспекты/ А.С. Белоруссова, И.Н. Третьякова // Онтогенез. - 2008. Т. 39. - №2. - C.1-10.
Лакин, Г.Ф. Биометрия/ Г.Ф. Лакин. - М.; Высшая школа, 1973.- 343с.
Носкова, Н.Е. Пыльца сосны обыкновенной в условиях экологического стресса. / Н.Е. Носкова, И.Н. Третьякова // Экология.- 2004.- №1. - С.26-33 Паушева, З.П. Практикум по цитологии растений / З.П.
Паушева. - М.: Колос, 1980.- 340 с.
Третьякова, И.Н. Эмбриология хвойных: физиологические аспекты/ И.Н. Третьякова. - Новосибирск; Наука, 1990.- 157с.
Becwar, M.R. Initiation of embryogenic cultures and somatic embryo development in loblolly pine (Pinus taeda)/ M.R. Becwar, R. Nagmani, S.R. Wann // Can. J. For. Res. 1990. V. 20. - P. 810-817 Bercetche, J. Somatic embryogenesis in maritime pine (Pinus pinaster) / J. Bercetche, M. Paques, // Somatic Embry o-genesis in Woody Plants. - Dordrecht.: Kluwer Academic Publishers, 1995. - P. 269-285 Bozhkov, P.V. Two alternative pathways of somatic embryo origin from polyembryonic mature store seeds of Pinus koraiensis Siebet Zucc. / P.V. Bozhkov, I.S. Ahn, Y.G. Park // Can. J. Bot. 1997. V. 75. - P. 509-512 Durzan, D.J. Somatic embryogenesis and polyembryogen esis in Douglas-fir cell suspension cultures / D.J. Durzan, P.K. Gupta // Plant Science. 1987. V. 52. - P. 229-235. Finer, J.J. Initiation of embryogenic callus and suspe nsion cultures of eastern white pine (Pinus strobus L.). / J.J. Finer, H.B. Kriebel, M.R. Becwar // Plant Cell Rep. 1989. V. 8. - P. 203-206 Jones, N.B. Plantlet production from somatic embryos of Pinuspatula. / N.B. Jones, J. van Staden // Plant Physiol.
1995. V. 145.-P. 519-525
Keinonen-Mettala, K. Somatic embryogenesis of Pinus sylve-stris. / K. Keinonen-Mettala, P. Jalonen, P. Eurola, S. von Arnold, K. von Weissenberg // Scand. J. For. Res.
1996. V. 11. - P. 242-250
Klimaszewska, K. Conifer somatic embryogenesis: I. Deve l-opment / K. Klimaszewska, D.R. Cyr // Dendrobiology. 2002. V. 48.-P. 31-39.
Koski, V. Generative reproduction and genetic pro cesses in nature / V. Koski// Genetics of Scots Pine. - Amsterdam.: Elsevier, 1991. - P. 59-72.
Kutschera, U. The current status of the acid-growth hypothesis / U. Kutschera // New Phytol. 1994. V. 126. - P. 549569.
Laine, E. Somatic embryogenesis in immature embryos and protoplasts of Pinus caribaea. /E. Laine, D. David// Plant Sci. 1990. V. 69. - P. 215-224
Lelu, M.A. Somatic embryogenesis from immature and m a-ture zygotic embryos and from cotyledons and ne edles of somatic plantlets of Larix / M.A. Lelu, M.A. Klimaszewska, P.J. Charest // Can. J. For. Res. 1994. V. 24. № 1.-P. 100-106.
Litvay, J. Influence of a loblolly pine (Pinus taeda L.) culture medium and its components on growth and somatic e m-bryogenesis of the wild carrot (Daucus carota L.) / J. Litvay, D.C. Verma, M.A. Johnson // Plant Cell Rep. 1985. №4.-P. 325-328.
Malabadi, R.B. Somatic embriyogenesis from vegetative shoot apices of mature trees of Pinus patula. / R.B. Malabadi, J. van Staden // Tree Physiology. 2005. V. 25. -P. 11-16.
Murashige, T.A. revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. 1962. V. 15. №4. - P. 473-497.
Nagmani, R. Somatic embryogenesis in longleaf pine (Pinus palustris). / R. Nagmani, A.M. Diner, G.C. Sharma // Can. J. For. Res. 1993. V. 23. - P. 873-876
Newton, R.J. Somatic embriyogenesis in slash pine ( Pinus elliottii Engelm.). / R.J. Newton, K.A. Marek-Swize, M.E. Magallanes-Cedeno, N. Dong, S. Sen, S.M. Jain,//Somatic Embryogenesis in Woody Plants. - Dordrecht.: Kluwer Academic Publishers, 1995. - P. 183195.
Salajova, T. Somatic embryogenesis in Pinus nigra Arn. /T. Salajova, J. Jasik, A. Kormutak// Somatic Embryogen e-sis in Woody Plants. - Dordrecht.: Kluwer Academic Publishers, 1995. - P. 207-220.
Sarvas, R. Investigations on the flowering and seed crop of Pinus sylvestris. /R. Sarvas// Comm. Inst. For. Finniae. 1962. V 53.-P. 1-198
Singh, H. Embryology of gymnosperms / H. Singh. - Berlin.: Stuttgart Gebruder Borntraeger, 1978. - P. 187-241.
Поступила в редакцию 11 декабря 2007 г. Принята к печати 16 мая 2008 г.
