CC BY
0
УДК 635.21:579.64(470.57) DOI: 10.24412/1029-2551-2024-5-013
ПРЕДПОСАДОЧНАЯ ИНОКУЛЯЦИЯ ЭНДОФИТАМИ КАК СПОСОБ УПРАВЛЕНИЯ СЕМЕННОЙ ПРОДУКТИВНОСТЬЮ И КАЧЕСТВОМ ОЗДОРОВЛЕННЫХ КЛУБНЕЙ КАРТОФЕЛЯ
!Л.И. Пусенкова, к.с.-х.н.,1 2С.Р. Гарипова, д.б.н., 23О.В. Ласточкина, к.б.н., В.А. Валиева, !А.В. Чистоедова, !В.Д. Матюнина
1 Башкирский НИИСХ УФИЦ РАН, e-mail: l.pusenkova@mail.ru
2
Уфимский университет науки и технологий, e-mail: garipovasvetlana@gmail.com 3Институт биохимии и генетики УФИЦ РАН, e-mail: oksana.lastochkina@ufaras.ru
В условиях Предуральской степной зоны Республики Башкортостан изучено влияние инокуляции семенных оздоровленных гидропонных мини-клубней и клубней репродукции суперэлита бактериями - эндофитами Bacillus subtilis 10-4 на продуктивность и содержание фотосинтетических пигментов, а также на устойчивость растений и клубней к болезням в период вегетации и уборки. Установлено, что бактерии успешно колонизировали клубни, корни, стебли и листья, оказывая положительное влияние на метаболизм растений в течение вегетации. Сравнительный анализ показал, что инокуляция мини-клубней и суперэлиты B. subtilis 10-4 обеспечила закладку большего количества клубней на один куст по сравнению с контролем на 35%, при этом продуктивность увеличилась на 68 и 17% соответственно. Выявлено повышение по сравнению с контролем содержания фотосинтетических пигментов (Хл а, Хл b и Кар) инокулированных B. subtilis 10-4 растений из мини-клубней и суперэлиты во второй половине вегетации: в фазе всходов сумма хлорофиллов (а + b) превышала контроль на 19 и 11%, в фазе бутонизации - на 5 и 14%, в начале цветения - на 50 и 43%, окончания цветения - на 27 и 53% соответственно, что свидетельствует о положительном влиянии инокуляции на интенсивность и продолжительность работы ассимиляционного аппарата. Предпосадочная инокуляция клубней B. subtilis 10-4 снижала распространенность болезней картофеля в период вегетации и уборки: альтернариозом в 1,5-1,8 раза в опыте с клубнями суперэлита и в 1,5 раза - с мини-клубнями, паршой серебристой - в 3,5 и 3 раза, сухой гнилью (фузарио-зом) - в 4,8 и 2,5 раза соответственно. При этом инокуляция мини-клубней эндофитами обеспечивала трехкратное снижение видового разнообразия патогенного комплекса микромицетов на клубнях первого поколения, в т.ч. отсутствие опасного возбудителя рода Fusarium.
Ключевые слова: эндофитные бактерии, Bacillus subtilis, Solanum tuberosum L., инокуляция, продуктивность, качество, Республика Башкортостан.
PRE-PLANTING INOCULATION WITH ENDOPHYTES AS A WAY TO MANAGE SEED PRODUCTIVITY AND QUALITY OF HEALTHY TUBERS OF POTATO
1Ph.D. L.I. Pusenkova, 12Dr.Sci. S.R. Garipova, 2 ъPh.D. O.V. Lastochkina, V.A. Valieva, A.V. Chistoedova, V.D. Matyunina
1 Bashkir Scientific-Research Institute of Agriculture of the Ufa FRC of the RAS, e-mail: l.pusenkova@mail.ru 2 Ufa University of Science and Technologies, e-mail: garipovasvetlana@gmail.com 3Institute of Biochemistry and Genetics of the Ufa FRC of the RAS, e-mail: oksana.lastochkina@ufaras.ru
In the conditions of the Pre-Ural steppe zone of the Republic of Bashkortostan, the effect of inoculation of hydro-ponically-grown healthy seed mini-tubers and seed tubers of superelite reproduction with endophytic bacteria Bacillus subtilis 10-4 on the productivity, the content of photosynthetic pigments, and the resistance of plants and tubers to diseases during the growing season and harvesting was studied. It was established that bacteria successfully colonized tubers, roots, stems, and leaves, exerting a positive effect on plant metabolism during the growing season. A comparative analysis showed that inoculation of mini-tubers and superelite with B. subtilis 10-4 ensured the laying of a larger number of tubers per bush (by 35%) compared to the control, while productivity increased by 68% and 17%, respectively. It was revealed an increase in the content of photosynthetic pigments chlorophyll (Chl) a, Chl b, and carotenoids (Car) in bacterial inoculated plants grown from mini-tubers and superelite, compared to the control in the second half of the growing season: in the germination phase, the sum of Chl a + Chl b exceeded the control by 19% and 11%; in the budding phase - by 5% and 14%; in the beginning of flowering - by 50% and 43%; and the
end offlowering - by 27% and 53%, respectively. These data indicate a positive effect of inoculation on the intensity and duration of the assimilation apparatus. Pre-planting inoculation of seeds with B. subtilis reduced the prevalence of potato diseases during the growing season and harvesting: Alternaria blight by 1.5-1.8 times in the experiment with super-elite tubers and by 1.5 times with mini-tubers, silver scab by 3.5 and 3 times, dry rot (Fusarium) - 4.8 and 2.5 times, respectively. At the same time, inoculation of mini-tubers with endophytes ensured a 3-fold reduction in the species diversity of the pathogenic complex of micromycetes in tubers of the first generation, including the absence of a dangerous pathogen of the genus Fusarium.
Keywords: endophytic bacteria, Bacillus subtilis, Solanum tuberosum L., seed tuber inoculation, the Republic of Bashkortostan.
Применение качественного посадочного материала служит основным условием высокодоходного картофелеводства, обеспечивая 25-30%, а в неблагоприятных условиях - 50% прироста урожая, и в значительной мере решает проблемы снижения его потерь [1]. Для производства оригинальных семян картофеля используют инновационные технологии, ускоряющие процесс получения мини-клубней, из которых наиболее перспективны гидропонный и аэропонный способы выращивания растений, которые позволяют увеличить продолжительность клубнеобразования и успешно выращивать мини-клубни размером от 10 г и выше [2]. Существенное преимущество при этом обеспечивается выращиванием растений в водно-воздушной среде с аэрозольной доставкой питательных веществ к корням и без использования почвы. Однако на последующих этапах размножения в полевых условиях с трудно контролируемым микробиологическим составом почвы клубни могут быстро заселяться многочисленными видами грибов, бактерий, в том числе фитопатогенными, и индуцировать иммунодефицит генотипа. Болезнями качества клубней считают такие заболевания, как фитофто-роз, парша обыкновенная и серебристая, ризокто-ниоз, черная ножка и некоторые другие [1]. Соответственно, важнейшей задачей при размножении как исходного оздоровленного, так и репродукционного семенного картофеля является применение агроприемов, обеспечивающих сведение к минимуму распространение болезней для получения оптимального уровня урожайности семян высокого качества в соответствии с требованиями действующих нормативных документов.
Метод бактеризации растений полезной микрофлорой - один из наиболее перспективных экологичных подходов в системе семеноводства и производства картофеля [3]. Инокуляция растений рос-тостимулирующими ризобактериями (PGPR, plant growth-promoting Rhizobacteria) в культуре in vitro может быть использована для повышения эффективности роста и продуктивности микрорастений при получении оздоровленного посадочного материала картофеля. Существенное повышение адаптационного потенциала микроклонов достигается путем создания активно функционирующих растительно-микробных ассоциаций между микрорасте-
ниями и PGPR (plant - PGPR). Это позволяет ускорить темпы роста микроклонов, а также активизировать формирование защитных систем растений к абиотическим и биотическим стрессовым факторам внешней среды [4]. Инокуляция микроклонов картофеля Azospirillum не только улучшает качество посадочного материала, получаемого in vitro, но и значительно увеличивает урожай мини-клубней за счет повышения адаптационной способности растений в полевых условиях [5, 6]. Установлена зависимость эффективности бактеризации от генотипа картофеля, этапа культивирования и состава ино-кулята [7]. Показано, что влияние бактериальной инокуляции на формирование и линейный рост органов растения (побегов и корней) зависит от гормонального баланса в растении в данный момент, что определяется генетическими особенностями, условиями окружающей среды, а также факторами, которые вызывают в нем конкретные штаммы [8].
Эффективность применения ризобактерий высока в оптимальных условиях in vitro, однако в полевых условиях может снижаться [9, 10]. Перспективным биотехнологическим ресурсом в этом случае могут служить эндофитные бактерии, стимулирующие рост растений (PGPB, plant growth-promoting bacteria), способные длительное время находиться внутри растения-хозяина, что позволяет оказывать пролонгированное благоприятное действие на макроорганизм, а также избегать конкуренции со стороны аборигенной микрофлоры [11-13]. Большинство бактериальных эндофитов служат ростостимуляторами, способны повышать иммунный статус и стресс-толерантность растения, обеспечивая защиту от заболеваний и конкурируя с фи-топатогенами [14]. Показано, что заболеваемость картофеля черной паршой, вызываемой Rhizoctonia solani, при применении культурального фильтрата Bacillus subtilis Hussain T-AMU для обработки клубней перед посадкой снижалась в вегетационных опытах на 71%, в полевых условиях - 50% [15]. Бактериальные обработки почвы и растений эндофитами (4 штамма) B. subtilis в полевых условиях снижали заболеваемость фитофторозом картофеля сорта Кафри Джоти по сравнению с контролем [16]. В полевых мелкоделяночных опытах при инокуляции растений картофеля сортов Чароит и Гусар эндофитными бактериями Bacillus
amyloliquefaciens Р20 и B. thuringiensis W65 урожайность клубней увеличилась на 7,9-14,6%. Биологическая эффективность штамма B. amyloliquefaciens Р20 в защите от фитофтороза на сорте Чароит составила 42,8%, при этом использование экспериментальных образцов не оказало достоверного влияния на развитие ризоктониоза [17]. Поскольку разные генотипы картофеля по-разному реагируют на комбинированный стресс и содержат различную микробиоту в ризосфере и эндосфере корней [18], главная задача правильно подобрать соответствующие бактерии с конкретным растением и условиями окружающей среды для достижения лучших результатов [19].
Большинство исследований сосредоточено на оценке влияния инокуляции семенных клубней и обработки растений эндофитными микроорганизмами в период вегетации на ростовые показатели, продуктивность и качество. Вопросы взаимодействия эндофитных бактерий, в т.ч. их влияние на микробиом растений и клубней картофеля, остаются малоизученными, в частности для оздоровленных клубней картофеля сведений практически нет.
Цель исследования - оценка эффективности инокуляции оздоровленных гидропонных мини-клубней картофеля (Solanum tuberosum L.) сорта Башкирский эндофитными бактериями Bacillus subtilis для получения семенных клубней высокого качества с улучшенным микробиомом.
Методика. Объектами исследования служили оздоровленные гидропонные мини-клубни, клубни репродукции суперэлита, а также растения картофеля (Solanum tuberosum L.) районированного сорта Башкирский, эндофитные бактерии Bacillus subtilis 10-4 (из коллекции Башкирского НИИСХ УФИЦ РАН). Для оценки потенциала применения метода предпосадочной обработки мини-клубней картофеля эндофитным штаммом B. subtilis 10-4 на параметры роста, урожайности и качества продукции были проведены вегетационные опыты в контролируемых условиях климатической камеры «Спектр КР» (фотопериод 16 часов день / 8 часов ночь, температура 22°С день / 18°С ночь, относительная влажность 70%). Для закладки вегетационного опыта мини-клубни погружали в растворы с суспензией бактерий B. subtilis 10-4 в концентрации 108 КОЕ/мл на 30 минут, далее растворы сливали, клубни подсушивали, высаживали в пластиковые сосуды с универсальным грунтом (pHKCl 6,7). Физиолого-биохимические показатели (высоту растений, длину корня, фотосинтетические пигменты, общую площадь листьев) оценивали в динамике по 3 точкам: фаза всходов, бутонизации и цветения. Ростостиму-лирующее действие эндофитов оценивали путем определения высоты растений (см), числа и массы клубней (г) на растении, и размера (см), массы надземной части растений (г), количества столонов и их
массы (г) и выход клубней (г/м2) через 65 дней после посадки. Концентрацию фотосинтетических пигментов хлорофилла (Хл а, Хл Ь) и каротиноидов (Кар) определяли в свежих листьях из средних узлов растений спектрофотометрическим методом [20].
Полевые эксперименты проводили в условиях Предуральской степной зоны Республики Башкортостан (Чишминский район) в 2023 г. Почва опытного участка чернозем выщелоченный тяжелосуглинистого гранулометрического состава. Агрохимическая характеристика пахотного слоя почвы: pHKCl 6,3, содержание гумуса (по Тюрину) 7,4%, подвижных форм фосфора и калия - 127 и 148 мг/кг почвы соответственно. Для закладки полевого опыта мини-клубни и клубни репродукции суперэлита инокулировали эндофитными бактериями, погружая их в растворы суспензионной культуры В. subtilis 10-4 в концентрации 108 КОЕ/мл и воду (контроль), далее растворы сливали, клубни подсушивали при комнатной температуре и высаживали в поле. Посадка клубней в предварительно нарезанные гребни проведена 15 мая. Делянки 70 х 35 см размещали рандомизированно в четырехкратной повторности. Длина делянки 18 м, ширина 3 м, площадь учетной делянки 27 м2, число растений при определении структуры урожая 20 штук. Урожай учитывали сплошным методом, поделя-ночно. Технология подготовки почвы: вспашка на глубину 22-24 см, культивация на 15-17 см, нарезка гребней, внесение азофоски 16/16/16 в дозе 100 кг/га. Уход за посадками состоял из одной довсходовой и одной повсходовой междурядных обработок и окучивания перед смыканием рядков. Уборку проводили в первой декаде сентября. Условия вегетационного периода 2023 г. были неблагоприятны для закладки и формирования урожая картофеля. Среднесуточная температура воздуха в мае была ниже нормы на 2-6°С (отмечались заморозки в воздухе и на почве) на фоне дефицита осадков (56% осадков от месячной нормы). В первой декаде июня температура воздуха составляла от +20 до +40°С на фоне дефицита осадков и ураганных ветров, вследствие чего всходы были очень неравномерными, с выпадами и участками, отстающими в росте. Неустойчивый характер погоды, почвенная засуха и недостаток влаги (36-55% от нормы) в июле сказался на формировании продуктивности растений картофеля. Накопление сумм положительных и эффективных температур происходило в опережающем режиме, распределение осадков было неравномерным, что способствовало раннему (10 августа) увяданию ботвы. ГТК вегетационного периода составил 0,56-0,61, что соответствует засушливым условиям.
Эффективность изучаемого штамма оценивали по массе урожая и его товарности. Ростовые показатели, содержание фотосинтетических пигментов и каротиноидов определяли в основных фазах раз-
вития растений (всходы, бутонизация, цветение). Концентрацию фотосинтетических пигментов хлорофилла (Хл) а, Хл b и каротиноидов (Кар) определяли в свежих листьях растений спектрофотомет-рическим методом [20].
Для определения численности эндофитных микроорганизмов в тканях растений со стебля, листа и корня брали навеску 0,5 г. Поверхностная стерилизация образца включала его промывку в мыльном растворе и воде, замачивание в 70% спирте 1 мин, промывку стерильной водой, замачивание в 30% растворе гипохлорита натрия 5 минут, 5-кратную промывку стерильной водой. Чистоту поверхностной стерилизации контролировали высевом на питательную среду смыва с последней обработки. Образец растирали до гомогенного состояния, разводили водой, перемешивали в Vortex и высевали серию кратных разведений на чашки Петри со средой PDA (Himedia). Инкубировали в термостате при 36,5°С. Все выросшие колонии учитывали через 24-48 ч.
Распространенность болезней на клубнях картофеля по счету и по массе оценивали по ГОСТ 33996-2016. Метагеномный анализ грибных патогенов проводили по внутреннему транскрибируемому (ITS, internal transcribed spacer) или ITS-региону на приборе MiSeq (Illumina, США).
Все эксперименты проведены в трех биологических и трех аналитических повторностях. Статистический анализ проводили с использованием компьютерной программы STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., США). В таблицах указаны средние значения и их стандартные ошибки (±SE) при р < 0,05.
Результаты. В условиях вегетационного опыта предпосадочная обработка оздоровленных мини-клубней B. subtilis 10-4 позволила сформировать симбиотические растительно-микробные отношения: интродуцированные бактерии успешно колонизировали мини-клубни, корни и побеги по мере их роста и оказывали пролонгированное влияние на метаболизм растений в течение вегетационного периода. Результаты вегетационных экспериментов в контролируемых условиях показали, что обработка мини-клубней эндофитными бактериями B. subtilis 10-4 приводила к более раннему появлению всходов, активизации ростовых процессов на начальных стадиях онтогенеза растений, повышению содержания фотосинтетических пигментов по сравнению с неино-кулированным контролем [21]. Предпосадочная обработка клубней B. subtilis 10-4 способствовала обра-
зованию повышенного количества клубней на растении (до 36%), увеличению их массы и урожайности с 1 м2 (до 20%) по сравнению с контролем. Достоверных отличий от контроля по высоте и массе надземной части растений при обработке штаммом 10-4 не выявлено, но биомасса столонов при этом увеличивалась на 22%. Результаты показали, что штамм 10-4 приводит к образованию большего количества клубней средних размеров, что предпочтительнее для получения семенного картофеля (табл. 1).
Таким образом, в контролируемых условиях эн-дофиты B. subtШs 10-4 успешно колонизировали семенные мини-клубни и растения (корни, побеги), тем самым способствовали ускорению прорастания, наступлению фенофаз, усиливали синтез фотосинтетических пигментов и повышали общую площадь листьев, увеличивали массу столонов, количество и массу клубней.
Для проверки ранее выдвинутой гипотезы аналогичные эксперименты были проведены на мини-клубнях и репродукции суперэлита в полевых условиях, в которых на процесс формирования урожая картофеля существенное влияние оказывают факторы абиотической природы, такие как влажность и температура воздуха, количество и интенсивность осадков, почвенные микробы, в т.ч. патогенные. Аналогично полученным в вегетационных экспериментах данным, предпосадочная обработка клубней (мини-клубни и суперэлита) активизировала ростовые процессы в полевых условиях в начальный период вегетации, что способствовало более раннему появлению всходов и наступлению основных фаз онтогенеза растений: всхожесть (на 8 июня) в контроле составила 40%, в варианте инокуляции 58 и 49%, что на 43 и 23% соответственно выше; к 12 июля в фазе бутонизации в контроле находилось 58% растений, тогда как в варианте инокуляции 71 и 62% соответственно; в фазе цветения в контроле находилось 8,8% растений, в варианте инокуляции соответственно 24 и 20%. Достоверного увеличения высоты растений в вариантах опыта не наблюдалось, что согласуется с результатами других исследователей [17, 22]. Совокупность полученных данных свидетельствует в пользу применения эндофитных бактерий на оздоровленных мини-клубнях, что очевидно связано с эффективной их колонизацией, показанной с использованием поверхностно стерилизованных проростков в вегетационном опыте [21] и подтверждается данными
1. Влияние предпосадочной обработки клубней эндофитными бактериями Bacillus subtilis
Вариант Высота растения, см Масса ботвы на 1 растение, г Масса столонов на 1 растение, г Количество клубней на 1 растение, шт. Масса клубней на 1 растение, г Урожайность клубней, г/м2
Контроль 42,3±1,5 55,8±12,4 3,2±1,2 2,8±0,8 59,8±3,7 1196±55
B. subtilis 10-4 41,8±1,2 55,2±17,2 3,9±0,8 3,8±1,2 71,9±4,4 1438±66
В таблице представлены стандартные ошибки (±БЕ) средних значений в трех экземплярах (п = 3).
о титре эндофитов в вегетирующих растениях картофеля в полевых экспериментах в течение всего периода вегетации (табл. 2).
Эндофиты могут передаваться как вертикально, проникая в семена, так и горизонтально, через вегетативное размножение [23, 24], а процесс колонизации предполагает сложное взаимодействие между двумя партнерами и требует распознавания эндо-фитными бактериями определенных соединений в корневых экссудатах растения [25]. В связи с этим проведены исследования по оценке численности и мест локализации эндофитов во внутренних тканях растений в течение вегетации. Численность эндо-фитов в растениях контрольного варианта в фазе бутонизации была сосредоточена в большей степени в стеблях, а в фазе цветения - в стеблях и листьях (табл. 2). По сравнению с контролем без инокуляции в варианте обработки штаммом 10-4 численность эндофитов в фазе бутонизации превалировала в корнях, что согласуется с данными некоторых исследователей [25], а в фазе цветения - в стеблях и листьях, превышая значения контроля в 1,6 и 2,5 раза соответственно.
Несмотря на аномально засушливые погодные условия, растения картофеля из инокулированных эндофитами клубней формировали мощные стебли и хорошо развитую листовую поверхностью до 0,40,5 м2 на куст. Анализ показателей продуктивности показал, что на один куст из мини-клубней сформировалось от 3,1 клубня в контроле до 4,2 шт. при инокуляции В. ьиЫШь 10-4 (табл. 3), что согласуется с результатами вегетационного опыта [21]. При инокуляции клубней суперэлиты В. ьиЫШь 10-4 сформировалось 6,5 шт., на 35% соответственно больше контроля (4,8 шт.). Выявлена высокая отзывчивость на инокуляцию мини-клубней В. тЫШь 10-4: про-
дуктивность 1 куста составила 209 г/куст, что на 68,5% соответственно выше контроля без инокуляции (124 г). Клубни суперэлиты в контроле без обработки формировали продуктивность 253 г/куст, в варианте обработки В. ьиЫШь 10-4 - 295 г/куст, соответственно на 16,7% выше. Анализ фракционного состава урожая клубней показал, что в инокули-рованных бактериями В. ьиЪИШ 10-4 вариантах сформировалось больше клубней товарного качества по сравнению с контролем как по количеству, так и по массе (табл. 3).
Установлено, что инокуляция В. ьиЫШь 10-4 обеспечила закладку большего количества клубней на один куст по сравнению с контролем на 35% как гидропонных мини-клубней, так и клубней репродукции суперэлита, что согласуется с результатами вегетационных опытов в контролируемых условиях, а также полевых экспериментов, проведенных ранее на сорте Удача [26]. Вместе с тем инокуляция оздоровленных клубней В. ьиЫИ 10-4 в полевых условиях обеспечила значительное увеличение продуктивности по сравнению с контролем (табл. 3).
Положительный эффект инокуляции клубней эндофитами сохранился и проявился в полевых условиях в течение всей вегетации. Больший эффект выявлен на оздоровленных мини-клубнях, что связано с исходным микробиомом, который в случае клубней суперэлиты, выращенных в почве, включает спектр микроорганизмов, в т.ч. патогенных. В связи с тем, что в стрессовых гидротермических условиях эффективность работы фотосинтетического аппарата, обусловленная особенностями пигментного комплекса, является одним из важнейших показателей адаптивного потенциала растений, изучена динамика накопления основных фотосинтетических пигментов в онтогенезе растений картофеля. Из данных таблицы 4 видно, что наибольшее количество зеленых пигментов накапливалось в фазе бутонизации - начало цветения. Несмотря на засушливые условия, выявлено достоверное повышение уровня (по сравнению с контролем) фотосинтетических пигментов (Хл а, Хл Ь и Кар) инокулированных эндофитами В. ьиЫШь 10-4 растений. По сравнению с контролем, инокулиро-ванные растения из мини-клубней и суперэлиты синтезировали больше фотосинтетических пигментов
2. Численность эндофитных бактерий
Bacillus subtilis в растениях картофеля
Вариант Численность, КОЕ х 106/г
листья стебли корни
Фаза бутонизации
Контроль без инокуляции 1,2 8 1
B. subtilis 10-4 1,3 1,5 8,8
Фаза цветения
Контроль без инокуляции 20 50 6
B. subtilis 10-4 50 80 4,7
3. Влияние инокуляции клубней эндофитными бактериями Bacillus subtilis на продуктивность и структуру урожая картофеля сорта Башкирский
Вариант Количество клубней на 1 растение, шт/куст Масса клубней 1 растение, г/куст Количество товарных клубней, шт/куст Масса товарных клубней, г/куст
Гидропонные мини-клубни
Контроль без инокуляции 3,1±0,4 124,0±17 1,2±0,2 89,0±15
B. subtilis 10-4 4,2±0,4 209,0±20 1,4±0,2 119,0±17
Суперэлита
Контроль без инокуляции 4,8±0,3 253,2±14 1,8±0,2 162,8±16
B. subtilis 10-4 6,5±0,5 295,0±25 2,4±0,4 187,5±28
4. Влияние предпосадочной обработки клубней эндофитными бактериями Bacillus subtilis _на содержание фотосинтетических пигментов в листьях картофеля_
Вариант Содержание фотосинтетических пигментов в листьях, мг/г сырой массы
хлорофиллы каротиноиды
а + b а b
Гидропонные мини-клубни
Фаза всходов
Контроль 1,51±0,082 1,16±0,076 0,34±0,017 0,72±0,036
B. subtilis 10-4 1,79±0,098 1,38±0,090 0,41±0,021 0,88±0,044
Фаза бутонизации
Контроль 1,69±0,079 1,28±0,085 0,42±0,023 0,82±0,041
B. subtilis 10-4 1,78±0,091 1,33±0,089 0,44±0,018 0,82±0,041
Фаза начала цветения
Контроль 1,97±0,107 1,49±0,099 0,49±0,026 0,91±0,046
B. subtilis 10-4 2,95±0,128 2,18±0,148 0,77±0,031 1,33±0,067
Фаза окончания цветения
Контроль 1,81±0,117 1,43±0,091 0,38±0,019 0,87±0,044
B. subtilis 10-4 2,29±0,137 1,70±0,115 0,59±0,024 1,06±0,053
Суперэлита
Фаза всходов
Контроль 1,52±0,087 1,17±0,076 0,35±0,021 0,75±0,038
B. subtilis 10-4 1,69±0,098 1,29±0,085 0,40±0,018 0,86±0,047
Фаза бутонизации
Контроль 1,96±0,123 1,49±0,098 0,46±0,024 0,75±0,056
B. subtilis 10-4 2,23±0,145 1,64±0,112 0,59±0,032 1,11±0,036
Фаза начала цветения
Контроль 1,55±0,085 1,20±0,078 0,35±0,018 0,76±0,041
B. subtilis 10-4 2,22±0,089 1,69±0,111 0,53±0,027 1,04±0,032
Фаза окончания цветения
Контроль 1,38±0,069 1,01±0,096 0,37±0,019 0,72±0,036
B. subtilis 10-4 2,11±0,106 1,59±0,089 0,52±0,026 1,00±0,041
во второй половине вегетации: в фазе всходов сумма хлорофилл ов (а + b) превышала контроль на 19 и 11%, в фазе бутонизации - на 5 и 14%, в начале цветения - на 50 и 43% и в фазе окончания цветения -27 и 53% соответственно, что свидетельствует о положительном влиянии инокуляции на интенсивность фотосинтеза и продолжительность работы ассимиляционного аппарата. Изучена также динамика накопления Кар, важнейшего компонента антиокси-дантной системы фотосинтетического аппарата. Выявлено, что в первой половине вегетации количество Кар, как в варианте мини-клубней, так и суперэлиты по сравнению с контролем увеличилось на 22 и 15% соответственно. В фазе начала цветения при значительном водном дефиците отмечено резкое увеличение синтеза Кар - на 46 и 37% выше контроля в варианте мини-клубней и суперэлиты. Это связано с продолжением засушливого периода, сопровождаемого повышением температуры воздуха до 30°С и более, а также со снижением атмосферной влажности и недостатком почвенной влаги.
Совокупность полученных данных о закономерностях изменения пигментного комплекса в период активной вегетации растений в полевых условиях свидетельствует в пользу того, что предпосадочная обработка клубней эндофитами способствует повышению содержания хлорофиллов и Кар в листьях
растений картофеля, что обеспечивало формирование более мощного фотосинтетического аппарата, защиту их от окислительного стресса и способствовало повышению урожайности. Более выраженный эффект выявлен на растениях, выращенных из мини-клубней (в сравнении с вариантом суперэлита), что свидетельствует о большем адаптивном потенциале этих инокулированных эндофитами растений.
В связи с климатическими изменениями серьезной проблемой в агроценозах картофеля в разных регионах России растения поражаются микромице-тами рода Fusarium и Alternaria, вызывающими увядание и гибель надземных побегов картофеля [27]. Фузариозное повреждение вредоносно не только для урожая текущего года, но и для следующих клубневых репродукций, поскольку при системном поражении растений грибы рода Fusarium могут длительное время сохраняться в клубнях в форме латентной (бессимптомной) инфекции и негативно отражаться на качестве выращиваемого семенного материала [28]. Соответственно, существует потребность в разработке эффективных стратегий биологического контроля защиты растений и клубней картофеля от фузариоза [29] для производства семенных клубней высокого качества и минимизация потерь при длительном их хранении. Поэтому особый интерес представлял
анализ влияния предпосадочной обработки клубней эндофитами как на распространенность, так и на видовое разнообразие болезней на растениях в период вегетации и на клубнях после уборки урожая.
В период вегетации на посадках картофеля наблюдались поверхностные поражения листьев аль-тернариозом, проявлявшиеся в виде коричневых округло-угловатых пятен (до 30 мм в диаметре) с концентрическими кольцами. Распространенность болезни на растениях, выросших из обработанных эндофитами клубней суперэлита, составляла около 10% (в контроле 14,7%), конец бутонизации - начало цветения - 15,8% (при контроле 29,4%), в фазе конец цветения (табл. 5) развитие болезни во всех вариантах было незначительным (3-5 баллов). В опыте с мини-клубнями распространенность болезни растений в фазе конец бутонизации - начало цветения в контроле составляла 5,2%, тогда как при обработке 10-4 признаков поражения не было обнаружено; к концу фазы цветения распространенность болезни в контроле составляла 25%, в вариантах с обработкой 10-4 - 10%.
Для точного детектирования и идентификации возбудителей болезней был проведен метагеномный анализ образцов листьев картофеля с признаками заболевания (табл. 5). Результаты показали, что в составе выявленного фитопатогенного комплекса микромицетов в контрольных вариантах преобладали Alternaría, А. helianthiinficiens, A. oregonensis (возбудители альтернариоза), а также были обнаружены Fusarium oxysporum, F. brachygibbosum, F. solani (возбудители фузариоза), Cladosporium (кла-
доспориоз или грибковая плесень) и Stemphylium solani (серая пятнистость листьев). В вариантах с обработкой B. subtilis 10-4 детектировано наличие Alternaria, A. oregonensis, V. dahlia (вертициллезное увядание) и Cladosporium (табл. 4).
Необходимо отметить, что в микробиоме листьев контрольных растений из мини-клубней и суперэлиты без проявления признаков заболевания выявлены микромицеты рода Fusarium, что впоследствии при благоприятных условиях для их развития могло приводить как к видимому, так и скрытому заражению клубней нового урожая. В тоже время, в иноку-лированных эндофитами растениях микромицетов рода Fusarium не выявлено. Таким образом, предпосевная инокуляция семенных клубней суперэлита и мини-клубней эндофитными B. subtilis 10-4 снижала развитие болезней вегетирующих растений и видовой состав фитопатогенов (населяющих внутренние ткани без проявления признаков заболеваний), причем максимальный защитный эффект достигался при обработке мини-клубней.
Фитопатологический анализ клубней картофеля, проведенный после уборки урожая, показал по морфологическим признакам наличие поражения паршой и сухой (фузариозной) гнилью. Распространенность признаков парши на клубнях в контроле составила 35% (суперэлита) и 15% (мини-клубни), сухой гнили - 19% (суперэлита) и 10% (мини-клубни). В вариантах предобработки B. subtilis - 5 и 4% (мини-клубни) и 10 и 4% (суперэлита), соответственно (табл. 5). Метагеномный анализ клубней, полученных из суперэлиты, показал наличие в составе фито-
5. Влияние предпосадочной инокуляции клубней эндофитными бактериями В. $иЫШ$ 10-4 _ на распространенность и видовой состав возбудителей болезней_
Обработка Вегетирующие растения Клубни после уборки
ВО* МГ** ВО МГ
I*** II Парша, % Сухая гниль, %
Альтернариоз, %
Мини-клубни
Контроль (без инокуляции) s 1s Alternaria sp., A. helianthiinficiens, A. oregonensis, F. oxysporum, F. brachygibbosum, F. solani, Cladosporium sp., S. solani 15 10 F. solani, F. oxysporum, Fusarium sp., A. alternata, A. oregonensis, H. solani
B. subtilis 10-4 н/о 10 Alternaria sp., A. oregonensis, V. dahlia, Cladosporium sp. s 4 A. alternata, H. solani
Суперэлита
Контроль (без инокуляции) 15 29 Alternaria sp., A. helianthiinficiens, A. oregonensis, F. oxysporum, F. brachygibbosum, F. solani, Cladosporium sp., S. solani 35 19 F. solani, F. oxysporum, Fusarium sp., A. alternata, A. oregonensis, V. dahlia, H. solani
B. subtilis 10-4 10 16 Alternaria sp., A. oregonensis, V. dahlia, Cladosporium sp. 10 4 F. solani, F. oxysporum, Fusarium sp., A. alternata, V. dahlia, H. solani
*ВО - визуальная оценка; **МГ - метагеномный анализ; ***1 - фаза конец бутонизации - начало цветения; II -фаза конец цветения; н/о - признаков болезней не наблюдалось.
патогенного комплекса микромицетов в контроле преобладание Fusarium solani, F. oxysporum и Fusarium (возбудители фузариоза), A. alternata, A. oregonensis (альтернариоз), V. dahlia и Helminthosporium solani (парша серебристая); в варианте с обработкой B. subtilis состав патогенов остался тем же (за исключением отсутствия A. oregonensis), но их доля была существенно ниже. Анализ клубней, полученных из мини-клубней, показал наличие в видовом составе микромицетов в контрольном варианте F. solani, F. oxysporum, Fusarium, A. alternata, A. oregonensis, H. solani; в варианте с обработкой мини-клубней 10-4 было выявлено наличие только A. alternata и H. solani.
Необходимо отметить, что клубнеобразование проходило на фоне высоких температур и пересыхания почвы, что стимулировало в стрессовых для растений условиях развитие фузариоза клубней, возбудителем которого служат широко распространенные в почве микромицеты рода Fusarium или скрыто пораженные сосудистым фузариозом семенные клубни [30]. Фузариозное увядание картофеля вредоносно не только для урожая текущего года, но и для следующих репродукций, т.к. инфекция может передаваться с семенными клубнями и вызывать изреживание всходов и торможение роста растений, а патогенный микологический комплекс Fusarium - Alternaria служит одной из причин полегания картофеля в различных регионах России и может возникать как первичное и вторичное поражение после ризоктониоза, фитофтороза или бактериоза [31]. Обращает на себя внимание факт отсутствия микромицетов рода Fusarium в микробиоме клубней, выращенных из инокулированных эндофитами мини-клубней. В то же время в необработанных вариантах как мини-клубней, так суперэлиты обнаруживалось 3 вида
Fusarium. Предпосадочная инокуляция клубней суперэлиты эндофитами не обеспечила защиту урожая клубней от фузариоза, что связано с исходным мик-робиомом семенных клубней, возможно зараженных почвенными микробами в период выращивания.
Полученные результаты согласуются с данными других исследователей [32] и суждениями о том, что заселенные эндофитами растения, как правило, более устойчивы к заболеваниям и дают высокие урожаи [33] за счет активной колонизации внутренних тканей и последующего благоприятного воздействия на растение [34]. Соответственно, «здоровый» микробиом инокулированных бактериями - эндофитами клубней окажет положительное влияние на продуктивность и снижение развития болезней растений картофеля в следующем полевом поколении [35, 36].
Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что способ обогащения выращенных на гидропонике здоровых семенных мини-клубней перед посадкой эндофитными B. subtilis имеет преимущество в сравнении с предпосадочной обработкой клубней суперэлита в качестве недорогого, экологически чистого подхода к производству семенного материала высокого качества. Качественные семенные клубни, не несущие существенной инфекционной нагрузки, имеют высокопродуктивный потенциал и за счет большей выносливости здоровых растений в меньшей степени будут подвержены воздействию болезней и других вредных организмов в следующем полевом поколении, что обеспечит надлежащий рост растений, повышение продуктивности и качество получаемых клубней, а также улучшить экологическое состояние почв.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-26-00262.
Литература
1. Жукова М.И., Середа Г.М., Зубкевич О.Н., Конопацкая М.В., Халаева В.И., Иванчук Н.Н. Фитосанитарный аспект испытания сортовых и семенных качеств картофеля // Защита и карантин растений, 2013, № 4. - С. 13-18.
2. Старовойтов В.И., Старовойтова О.А., Манохина А.А., Шабанов Н.Э., Филиппова С.В. Выращивание продовольственного картофеля из мини-клубней мелкой фракции, полученных в условиях водно-воздушной культуры // Вестник Воронежского государственного аграрного университета, 2022, Т. 15, № 4(75). - С. 38-51. doi: 10.53914/issn2071-2243_2022_4_38-51.
3. Caradonia F., Ronga D., Tava A., Francia E. Plant biostimulants in sustainable potato production: an overview // Potato Research, 2022, V. 65. - P. 83-104. doi: 10.1007/s11540-021-09510-3.
4. Ткаченко О.В., Евсеева Н.В., Каргаполова К.Ю., Денисова А.Ю., Позднякова Н.Н., Куликов А.А., Бурыгин Г.Л. Повышение активности про/антиоксидантной системы микрорастений картофеля ризосферными бактериями в условиях аэропоники // Аграрный научный журнал, 2023, № 3. - С. 65-72. doi: 10.28983/asj.y2023i3pp65-72.
5. Kargapolova K.Yu., Burygin G.L., Tkachenko O.V., Evseeva N.V., Pukhalskiy Y.V., Belimov A.A. Effectiveness of inoculation of in vitro-grown potato microplants with rhizosphere bacteria of the genus Azospirillum // Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2020, V. 141. - P. 351-359. doi: 10.1007/s11540-021-09510-3.
6. Tkachenko O.V., Evseeva N.V., Terentyeva E.V., Burygin G.L., Shirokov A.A., Burov A.M., Matora L.Y., Shchyogolev S.Y. Improved production of high-quality potato seeds in aeroponics with plantgrowth-promoting rhizobacteria // Potato Research, 2021, V. 64. -P. 55-66. doi: 10.1007/s11540-020-09464-y.
7. Каргаполова К.Ю., Ткаченко О.В., Бурыгин Г.Л., Евсеева Н.В., Широков А.А., Матора Л.Ю., Щёголев С.Ю. Повышение эффективности клонального микроразмножения картофеля при инокуляции ризосферными бактериями Azospirillum baldaniorum Sp245 и Ochrobactrum cytisi IPA7.2 // Вавиловский журнал генетики и селекции, 2022, № 26(5). - С. 422-430. doi: 10.18699/VJGB-22-52.
8. Arkhipova T.N., Evseeva N.V., Tkachenko O.V., Burygin G.L., Vysotskaya L.B., Akhtyamova Z.A., Kudoyarova G.R. Rhizobacteria inoculation effects on phytohormone status of potato microclones cultivated in vitro under osmotic stress // Biomolecules, 2020, № 10(9). - P. 1231. doi: 10.3390/biom10091231.
9. Bacilio M., Moreno M., Lopez-Aguilar D.R., Bashan Y. Scaling from the growth chamber to the greenhouse to the field: demonstration of diminishing effects of mitigation of salinity in peppers inoculated with plant growth-promoting bacterium and humic acids // Applied Soil Ecology, 2017, V. 119. - P. 327-338. doi: 10.1016/j.apsoil.2017.07.002.
10. Soumare A., Diedhiou A.G., Arora N.K., Al-Ani L.K.T., Ngom M., Fall S., Hafidi M., Ouhdouch Y., Kouisni L., Sy M.O. Potential Role and Utilization of Plant Growth Promoting Microbes in Plant Tissue Culture // Frontiers in Microbiology, 2021, V. 12. - P. 649878. doi: 10.3389/fmicb.2021.649878.
11. Gamalero E. The Use of Plant growth-promoting bacteria to prevent nematode damage to plants // Biology, 2020, V. 9, № 11. - P. 381. doi: 10.3390/biology9110381.
12. Ruiu L. Plant-growth-promoting Bacteria (PGPB) against insects and other agricultural pests // Agronomy, 2020, V. 10, № 6. - P. 861. doi: 10.3390/agronomy10060861.
13. El-Hasan A., Ngatia G., Link T.I., Voegele R.T. isolation, identification, and biocontrol potential of root fungal endophytes associated with solanaceous plants against potato late blight (Phytophthora infestans) // Plants, 2022, № 11(12). - P. 1605. doi: 10.3390/plants 11121605.
14. Васильева Е.Н., Ахтемова Г.А., Жуков В.А., Тихонович И.А. Эндофитные микроорганизмы в фундаментальных исследованиях и сельском хозяйстве // Экологическая генетика, 2019, Т. 17, № 1. - C. 19-32. doi: 10.17816/ecogen17119-32.
15. Hussain T., Khan A.A. Bacillus subtilis HussainT-AMU and its Antifungal activity against Potato Black scurf caused by Rhizoctonia solani on seed tubers // Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2020, V. 23. - P. 101443. doi:10.1016/j.bcab.2019.101443.
16. Kumbar B., Mahmood R., Nagesha S.N., Nagaraja M.S., Prashant D.G., Kerima O.Z., Karosiya A., Chavan M. Field application of Bacillus subtilis isolates for controlling late blight disease of potato caused by Phytophthora infestans // Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2019, V. 22. - P. 101366. doi:10.1016/J.BCAB.2019.101366.
17. Чеботарь В.К., Заплаткин А.Н., Балакина С.В., Гаджиев Н.М., Лебедева В.А., Хютти А.В., Чижевская Е.П., Филиппова П.С., Келейникова О.В., Баганова М.Е., Пищик В.Н. Урожайность и поражаемость картофеля ризоктониозом и фитофторозом под влиянием эндофитных бактерий Bacillus thuringiensis W65 и Bacillus amyloliquefaciens Р20 // Сельскохозяйственная биология, 2023, Т. 58, № 3. - С. 429-446. doi: 10.15389/agrobiology.2023.3.429rus.
18. Faist H., Trognitz F., Antonielli L., Symanczik S., White P. J., Sessitsch A. Potato root-associated microbiomes adapt to combined water and nutrient limitation and have a plant genotype-specific role for plant stress mitigation // Environmental Microbiome, 2023. - P. 18. doi: 10.1186/s40793-023-00469-x.
19. Yarte M.E., Llorente B.E., Larraburu E.E. Native putatively endophytic bacteria from Handroanthus impetiginosus improve its in vitro rooting // Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2022, V. 151. - P. 265-274. doi: 10.1007/s11240-022-02349-7.
20. Jeffrey S.; Humphrey G. New Spectrophotometric Equations for Determining Chlorophylls A, B, C1 and C2 in Higher Plants, Algae and Natural Phytoplankton // Biochemie und physiologie der Pflanzen, 1975, V. 167. - P. 191-194. Doi: 10.1016/S0015-3796(17)30778-3.
21. Pusenkova L, Lastochkina O., Sezai Ei. The Potential of Hydroponic Seed Minituber Enrichment with the Endophyte Bacillus subtilis for Improving the Yield Components and Quality of Potato (Solanum tuberosum L.) // Agriculture, 2023, V. 13, Issue 8. - P. 1626. doi: 10.3390/agriculture13081626.
22. Деревягина М.К., Васильева С.В., Зейрук В.Н., Белов Г.Л. Биологическая и химическая защита картофеля от болезней // Агрохимический вестник, 2018, № 5. - С. 65-68.
23. Frank A. C., Saldierna Guzman J. P., Shay J.E. Transmission of bacterial endophytes // Microorganisms, 2017, V. 5, №. 4. - P. 70.
24. Luo J., Tao Q., Jupa R., Liu Y., Wu K., Song Y., Li J., Huang Y., Zou L., Liang Y., Li T. The Role of Vertical Transmission of Shoot Endophytes in Root-Associated Microbiome Assembly and Heavy Metal Hyperaccumulation in Sedum alfredii // Environmental Science & Technology, 2019, V. 53, № 12. - P. 6954-6963. doi: 10.1021/acs.est.9b01093.
25. Khare E., Mishra J., Arora N.K. Multifaceted interactions between endophytes and plant: Developments and Prospects // Frontiers in microbiology, 2018, V. 9. - P. 2732. doi: 10.3389/fmicb.2018.02732.
26. Пусенкова Л.И., Гарипова С.Р., Ласточкина О.В., Федорова К.А., Марданшин И.С. Влияние эндофитных бактерий на урожай, качество клубней и послеуборочные болезни картофеля // Агрохимический вестник, 2021, № 5. - С. 73-79. doi: 10.24412/1029-2551-2021-5-013.
27. Смирнов А.Н., Бибик Т.С., Приходько Е.С., Белошапкина О.О., Кузнецов С.А. Листостебельный комплекс фитопатоген-ных и сопутствующих грибов на картофеле в различных регионах России // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии, 2015, № 3. - С. 36-46.
28. Хадиева Г.Ф., Лутфуллин М.Т., Акосах Й.А., Мавлова А.В., Мочалова Н.К., Вологин С.Г., Сташевски З., Марданова А.М. Анализ микромицетов рода Fusarium, изолированных из инфицированных клубней картофеля, выращенных в Республике Татарстан // Достижения науки и техники АПК, 2018, Т. 32, № 3. - С. 34-39. doi: 10.24411/0235-2451-2018-10307.
29. Cray J.A., Connor M.C., Stevenson A. Biocontrol agents promote growth of potato pathogens, depending on environmental conditions // Microbial biotechnology, 2016, V. 9. - P. 330-354.
30. Замалиева Ф.Ф., Зайцева Т.В., Рыжих Л.Ю, Салихова З.З. Фузариозное увядание картофеля и рекомендации по защите // Защита картофеля, 2015, № 2 - С. 3-9.
31. Смирнов А.Н., Бибик Т.С., Приходько Е.С., Белошапкина О.О., Кузнецов С.А. Листостебельный комплекс фитопатоген-ных и сопутствующих грибов на картофеле в различных регионах России // Известия ТСХА, 2015, № 3. - С. 36-46.
32. Новикова И.И., Бойкова И.В., Павлюшин В.А., Зейрук В.Н., Васильева С.В., Деревягина М.К. Биологическая эффективность препаративных форм на основе микробов-антагонистов для защиты картофеля от болезней при вегетации и хранении // Вестник защиты растений, 2015, № 4(86). - С. 12-19.
33. Чеботарь В.К., Щербаков А.В., Щербакова Е.Н., Масленникова С.Н., Заплаткин А.Н., Мальфанова Н.В. Эндофитные бактерии как перспективный биотехнологический ресурс и их разнообразие // Сельскохозяйственная биология, 2015, Т. 50, № 5. - С. 648-654.
34. Уромова И.П., Козлов А.В. Влияние биопрепаратов на продуктивность и качество картофеля // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований, 2020, № 5. - С. 77-81.
35. Shi W., Li M., Wei G. et al. The occurrence of potato common scab correlates with the community composition and function of the geocaulosphere soil microbiome // Microbiome, 2019, № 7. - P. 14. doi: 10.1186/s40168-019-0629-2.
36. Arseneault T, Goyer C., Filion M. Biocontrol of potato common scab is associated with high Pseudomonas fluorescens LBUM223 populations and phenazine-1-carboxylic acid biosynthetic transcript accumulation in the potato geocaulosphere // Phytopathology, 2016, V. 106, № 9. - P. 963-970. doi: 10.1094/PHYTO-01-16-0019-R.
