CC BY
45
УДК 618+616-053.2
ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ДНК В ПЛАЗМЕ КРОВИ У ЖЕНЩИН С МИОМОЙ МАТКИ
Л.М. ИСАНБАЕВА*
Статья посвящена количественной и качественной характеристике внеклеточной ДНК (вкДНК) плазмы крови у женщин при миомах матки. Показано, что в плазме крови женщин в норме и при различных миомах матки присутствует внеклеточная ДНК, концентрация которой значительно увеличена при простой миоме, максимально увеличена при прогрессирующей миоме.
Ключевые слова: миома матки, дезоксирибонуклеиновая кислота, внеклеточная ДНК.
Миома матки представляет собой доброкачественную опухоль, источником которой являются гладкомышечные клетки шейки или тела матки [1]. Изучение генетических факторов образования миомы матки у женщин всех возрастных периодов является актуальной проблемой современной медицины. Это обусловлено тем, что миома матки и её осложнения остаются одной из основных причин радикальных операций в современной гинекологической практике.
Миома матки является причиной бесплодия, маточных кровотечений, нарушения функции тазовых органов [2]. Несмотря на значительный прогресс в изучении данной патологии, ряд ключевых вопросов остаются недостаточно изученными, такие как идентификация генетических факторов и первичных молекулярных дефектов, приводящих к развитию и эволюции миоматозных изменений матки, ранняя диагностика. До определенного времени считалось, что ДНК находится только в клеточных структурах: преимущественно в ядрах клеток и некоторое количество - в митохондриях, где она выполняет функцию носителя генетической информации.
Установлено, что небольшие количества ДНК обнаруживаются и вне клеток, прежде всего в плазме крови человека. Возможность использования вкДНК в медицине обусловлена изменениями ее концентрации, изменениями в структуре и размерах молекул вкДНК плазмы крови, появлением различных мутаций. Интерес к внеклеточным ДНК (вкДНК) неизмеримо возрос после того, как выяснилось, что количество ее может существенно возрастать при ряде заболеваний, что возможно учитывать как ранний признак соответствующих патологий. Это придало совершенно четкое практическое значение изучению циркулирующих нуклеиновых кислот.
Одним из наименее изученных аспектов остается количественная и качественная характеристики вкДНК плазмы крови у женщин при миомах матки.
Цель исследования - изучение количественных и качественных нарушений внеклеточной ДНК в плазме крови у женщин смиомой матки.
Материалы и методы исследования. В качестве материала использовали кровь женщин с различными миомами матки. Кровь в объеме 1 мл брали с помощью катетера из локтевой вены в вакуумные пробирки с 0,5 М ЭДТА.
Было исследовано 24 образцов крови женщин разного возраста. ВнДНК выделяли из 1 мл периферической крови, взятой из локтевой вены, переносили в пластиковые пробирки с напыленной ЭДТА - N2. Кровь центрифугировали при 40С последовательно при 1,5 тыс. оборотов в минуту (об/мин) - 10 минут, при 3 тыс. об/мин - 15 минут, при 5 тыс. об/мин - 15 минут. После центрифугирования из пробирок, строго по 400 мкл отбирали сыворотку крови в новые стерильные пробирки.
Сыворотку предварительно добавляли 100мкг/мл РНКазы А и инкубировали в течение 1 часа при 370С, затем протеиназой К (50мкг/мл), инкубация 1 час при 370С. После ферментативной обработки, всыворотку крови добавляли по 200 мкл лизирующего буфера (100мМ Трис НС1, pH 8,0; 25мМ ЭДТА, pH 8,0; 0,15М №С1; 0,7М р-меркаптоэтанол; (конечная концентрация 2%).
Лизис проводили на холоду 3 минуты (надо льдом). Затем аликвоты депротеинизировали 15 мин в 1,5мл смеси фенол/хлороформ (1:2) с последующим центрифугированием при 5 тыс. об/мин, 15 мин при 40С. Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли 1/10 объема 3М ацетата натрия, pH 5,2 и 2,5 объема охлажденного 96% этанола, затем пробирки оставляли на ночь при -200С. Денатурированные препараты внДНК центрифу-
* Ташкентский институт усовершенствования врачей, 100007, Узбекистан, Ташкент, Мирзо-Улугбекский район, ул. Паркент, 51
гировали при 5 тыс. об/мин - 30мин, 40С. Осадок препаратов внДНК промывали в 1мл охлажденного 70% этанола с последующим центрифугированием при 13 тыс. об/мин в течение 15мин при 40С. Препараты внДНК хранили при -200С.
Для определение концентрации внДНК препараты внДНК растворяли в 100 мкл ДНК - связывающего флуоресцентного красителя (ДСФК), содержащего 10 мМ трис НС1, pH 8,0; 1мМ ЭДТА, pH 8,0; бромистый этидий 0,5 мкг/мл. Растворы внДНК измеряли на спектрофометре при длине волны 350 нм. Интенсивность флюоресценции увеличилась линейно с концентрацией внДНК. В качестве контроля использовали ДСФК без применения внДНК.
Анализ молекулярной массы внеклеточной ДНК проводили методом электрофореза в 2% агарозном геле. Гель окрашивали бромистым этидием и фотографировали на трансилюминаторе через проходящие лучи УФ. В качестве маркеров длины использовали гидролизат рестриктазы ДНК фага ЦНіп^І/ЕсоКІ) и ДНК лестницу 100 т.п.н.
Результаты и их обсуждение. Исследования, проводимые в области этиологии и патогенеза миомы матки, доказывают, что ранняя и своевременная диагностика данного заболевания может полностью заменить хирургическое вмешательство, определить консервативное направление в лечении и наметить пути профилактики.
В данной работе проведен сравнительный количественный и качественный анализ вкДНК плазмы крови женщин при миомах матки. Известно, что содержание вкДНК меняется при диабете, инфаркте миокарда, системной красной волчанке, ревматоидном артрите, гломерулонефрите, гепатите и других патологических состояниях [3,4,5].
Патогенетические процессы, приводящие к повышению уровня вкДНК в крови при заболеваниях практически не исследованы, однако, получены предварительные данные о наличии корреляций между концентрацией вкДНК крови и развитием какой-либо патологии.
Очевидно, что исследование процессов, обеспечивающих появление и циркуляцию внеклеточных нуклеиновых кислот, а также понимание их физиологической роли позволит получить новые данные о механизмах патогенеза многих заболеваний, в том числе и миомы матки. Было обследовано 24 пациенток разной возрастной категории.
Пациентки были разделены на 4 группы: 1 - здоровые доноры (5); 2 - простая миома матки (5); 3 - прогрессирующая (быстрорастущая) миома матки (9); 4 - симптомная миома - симптом кровотечения (5). В табл. 1 приведены результаты определения содержания вкДНК в плазме крови женщин при различных миомах матки.
Таблица
Содержание внднк в сыворотки крови у женщин с миомой матки
Группа Патология Общая СвнДНК, нг/мл Размер фрагментов, в т.п.н.
1 п=5 Здоровые доноры контроль 23,00±1,07 20-23
2 п=5 Простая миома 80,54±0,91* 10; 6; 3,5; 1,5; 0,8
3 п=9 Прогрессирующая миома (быстрорастущая) 120,3±1,0* 4,2; 1,2; 0,9; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5;0,4
4 п=5 Симптомная миома (кровотечение) 70,4±1,55* 21; 6; 4,2;0,2
Примечание: * - Р< 0,05 по сравнению с контролем
Из приведенных результатов видно, что у женщин с миомой матки отмечается достоверное увеличение концентрации вкДНК в плазме крови по сравнению с контрольной группой здоровых женщин. При этом у женщин с пролиферативной формой миомы матки имеет место наибольший выброс вкДНК в плазму крови - 120 нг/мл. Возрастание концентрации вкДНК позволяет сделать заключение о прогрессировании заболевания. Повышение концентрации вкДНК в плазме крови дает возможность использовать данный фактор как биомаркера заболевания.
До настоящего времени механизмы развития различных по клиническому течению и форм миомы матки остаются не изученными. Качественный состав вкДНК плазмы крови, так же как и количественный является системным показателем, способным охарактеризовать ход патологического процесса. В следующей серии экспериментов нами был изучен качественный состав вкДНК плазмы крови женщин при различных миомах матки. Выявлено, что при простой миоме матки вкДНК представлена высокомолекулярными фрагментами ДНК, а при пролиферативной ее формах -
фрагментами деградированной ДНК.
В контрольной группе содержание внДНК в плазме крови представлена с высокой молекулярной массой 20-23 т.п.н. При простой миоме матки в агарозном геле наблюдается фрагменты внДНК с молекулярной массой от 0,8 до 10,0 т.п.н. Заметное снижение размеров фрагментов внДНК наблюдается при прогрессирующей миоме, с молекулярной массой от 0,2 до 4,2 т.п.н. При миомах протекающих с нарушением менструального цикла сопровождающихся кровотечением, размеры фрагментов внДНК по подвижности в агарозном геле заметно варьируют и молекулярная масса вкДНК при данной патологии меняется от 0,2 до 21,0 т.п.н. На основании полученных данных можно придти к выводу, что при прогрессирующей миоме матки наблюдается наибольшая фрагментация вкДНК. Анализ длины фрагментов показал, что вкДНК в крови женщин при различных миомах матки циркулирует в виде коротких фрагментов (0,2-4,2 т.п.н.), в то время как в контроле в виде длинных фрагментов.
В результате исследований нами показано, что при миомах матки существенно изменяются не только концентрация, но и фракционный состав вкДНК. Появление в плазме крови низкомолекулярных фрагментов вкДНК происходит во время развития многих заболеваний, таких как рак, инсульт, при ишемических процессах, миомы матки.
Одна из возможных причин качественного изменения вкДНК - неодинаковая скорость гидролиза фрагментов внДНК в составе растворимого хроматина погибших клеток нуклеазами крови до коротких фрагментов. Данные результаты показали перспективность дальнейших исследований по содержанию вкДНК для установления их участия в механизмах развития и прогрессирования различных миом матки.
Выводы:
1. Показано, что в плазме крови женщин в норме и при различных миомах матки присутствует внеклеточная ДНК. Концентрация вкДНК у женщин с миомой матки значительно повышена, по сравнению с данным показателем в контрольной группе;
2. При различных по клиническому течению миомах матки происходят качественные изменения вкДНК: при прогрессирующей миоме размер фрагментов составляет 0,2 до 4,2 т.п.н.: при простой миоме - 0,8 до 10,0 т.п.н.
Литература
1. Тихомиров, А.Л. Современные представления об этиологии и патогенезе миомы матки / А.Л. Тихомиров, Д.М. Лубнин //Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии.- 2004.- Т. 3.- № 6.- С.
62-68.
2. Сидорова, И.С. Клинико-морфологические особенности простой и пролиферирующей миомы матки / И.С. Сидорова, С.А. Леваков, Р.Б. Мамедбекова //Росс. вестн. акушера-гинеколога.- 2001.-Т.З.- №5.- С. 19-24.
3. Владимиров, В.Г. Внеклеточная ДНК и ее значение для современной медицины / В.Г. Владимиров //Клин. мед. патофизиол.-1998.- № 1-2.- С. 112-119.
4. Chang, C.P.-Y. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction/ C.P.-Y. Chang, R.-H. Chia, //Clin. Chem. Acta. 2003. Vol. 327. P. 95-101.
5. Foumie, G.J. Plasma DNA as a marker of cancerous cell death. Investigation in patients suffering from lung cancer and in nude mice bearing / G.J. Foumie // J. Mol. Biol.- 2002.- V. 41.- P. 668-676.
PRACTICAL ASPECTS AND BIOLOGICAL VALUE OF THE DEFINITION OF CIRCULATING EXTRACELLULAR DNA IN BLOOD PLASMA AT WOMEN WITH HYSTEROMYOMA
L.M. ISANBAEVA
Tashkent Institute of Postgraduate Medical Education,
Institute of Biochemistry
The article considers quantitative and qualitative characteristic of extracellular DNA) women's blood plasma at hysteromyomas. It is shown, that in blood plasma in norm and at various hysteromyomas extracellular DNA takes place, concentration being considerably increased at simple myoma hysteromyoma and highest possible at progressing one.
Key words: hysteromyoma, deoxyribonucleic acid (DNA), extracellular DNA (ecDNA).
